朱瑞康 李江 李文韜 顏延鳳

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇 南京 210014)

急性支氣管炎是臨床常見(jiàn)病，可由微生物感染、物理化學(xué)刺激因素等誘發(fā)，屬于中醫(yī)咳嗽、痰飲、喘證等范疇，目前除了細(xì)菌性支氣管炎應(yīng)用抗生素治療效果確切之外，其余病因患者尚無(wú)特效療法[1,2]。近年來(lái)中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療急性支氣管炎取得較大的進(jìn)步，但大多數(shù)中藥復(fù)方及成藥基礎(chǔ)研究不夠深入，藥物發(fā)揮作用的成分和機(jī)理尚不明確，使得很多確有療效的中藥臨床應(yīng)用難以推廣[3]。

氣道神經(jīng)源性炎癥是由氣道內(nèi)感覺(jué)神經(jīng)元的外周神經(jīng)末梢所釋放的速激肽和神經(jīng)遞質(zhì)所引起，包括：P物質(zhì)(SP)、神經(jīng)激肽A(NKA)、神經(jīng)激肽B(NKB)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)等，表現(xiàn)為血管通透性增高、血漿蛋白外滲、氣道平滑肌收縮、黏液分泌增多和組織充血水腫等[4-5]。氣道神經(jīng)源性炎癥在多種呼吸道疾病中均發(fā)揮重要的作用，而關(guān)于中醫(yī)藥對(duì)急性支氣管炎相關(guān)氣道神經(jīng)源性炎癥干預(yù)研究的文獻(xiàn)報(bào)道極少。前胡湯由前胡10 g、杏仁10 g、桑葉15 g、生甘草6 g組成，來(lái)源于《溫病條辨》中的杏蘇散和桑菊飲，臨床上可用于急性支氣管炎治療[6-7]。本研究通過(guò)建立大鼠急性支氣管炎模型，探討前胡湯對(duì)氣道神經(jīng)源性炎癥相關(guān)機(jī)制的調(diào)節(jié)作用，為其臨床防治急性支氣管炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物及試劑 前胡湯水煎液，參照鄭橋醫(yī)案選“自擬前胡湯”，組方：前胡10 g，杏仁10 g，桑葉15 g，生甘草6 g。中藥飲片均由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房采購(gòu)及質(zhì)控，根據(jù)常規(guī)方法煎制濃縮為1.37 g(生藥量，下同)/kg的藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫患敝菨{(批號(hào)：18120437)，太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司；美敏偽麻溶液(惠菲寧，批號(hào)：AL7483)，Wyeth惠氏制藥有限公司。紅梅香煙(84mm烤煙型)，紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司生產(chǎn)；大鼠SP、NKA、NKB、CGRP和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)試劑盒，南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液(強(qiáng))、PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、DEPC水，碧云天生物科技研究所；RNA Isolator(R401-01)、HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(R123-01)，南京諾唯贊生物有限公司；30%丙烯酰胺，生工生物工程(上海)股份有限公司；過(guò)硫酸銨(7727-54-0)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GAPDH、NK-1、VR1和p38 MAPK抗體，英國(guó)Abcam公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180-200 g，上海市西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0006。

1.3主要設(shè)備儀器 -20 ℃低溫冷凍冰箱(BCD-249CF)，合肥美菱股份有限公司；-80 ℃超低溫冰箱，美國(guó)Thermo公司；中通量組織研磨儀，北京鼎昊源科技有限公司；mini-PROTEAN 3 Cell電泳槽、GelDocXR 凝膠成像儀、梯度 PCR儀(MyCycler)，美國(guó)Bio Rad公司；電子分析天平(BSA124S)，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)(NP2000)、純水儀、多功能酶標(biāo)儀(3020-183)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(StepOne Plus)，美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物造模及給藥 大鼠購(gòu)入后適應(yīng)飼養(yǎng)一周，將大鼠隨機(jī)分為模型組(蒸餾水20 mL/kg)、急支糖漿治療組(10 mL/kg)、惠菲寧治療組(10 mL/kg)、前胡湯高劑量治療組(27.3 g/kg)、前胡湯低劑量治療組(13.7 g/kg)、空白對(duì)照組(蒸餾水20 mL/kg)，每組16只。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠參考文獻(xiàn)[8-9]，采用煙熏法復(fù)制大鼠急性支氣管炎模型(每組用鋸末和煙絲各50 g置于熏爐內(nèi)引燃，避免明火，對(duì)煙熏箱內(nèi)大鼠進(jìn)行煙熏刺激，30分鐘/次，2次/日)，連續(xù)2周，造模完成后各組大鼠連續(xù)給藥7天，每天1次。

1.4.2指標(biāo)檢測(cè) 分別于給藥第3天和第7天，于給藥后2h，眼眶采血，采用ELISA試劑盒測(cè)定血清中SP、NKA、NKB、NGF和CGRP。分別于給藥第3天和第7天，于給藥后2 h，每組取8只大鼠，10%水合氯醛麻醉后收集肺泡灌洗液，采用試劑盒測(cè)定灌洗液中SP、NKA、NKB、NGF和CGRP水平；大鼠肺泡灌洗完畢，取左肺下葉組織0.3 g左右，制備10%生理鹽水勻漿，取上清液按試劑盒要求，用ELISA 法測(cè)定SP和NGF水平。

取給藥大鼠肺臟組織，采用Real-time PCR以及Western blot分別檢測(cè)NK-1、VR1和p38 MAPK的mRNA和蛋白表達(dá)水平。相關(guān)引物序列如下表所示。

Real-time PCR檢測(cè)引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1對(duì)大鼠血清中神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平的影響 與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠血清中神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而逐步顯著升高，其中SP、NKA和CGRP水平自造模第3天開(kāi)始明顯升高(p<0.05，p<0.01)，而造模7天時(shí)5種因子水平均顯著升高(p<0.05，p<0.01)。與模型組相比，惠菲寧可明顯抑制血清中神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平，改善作用相對(duì)較強(qiáng)(p<0.05，p<0.01)，急支糖漿和高劑量前胡湯對(duì)神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平也具有明顯的改善作用(p<0.05，p<0.01)，低劑量前胡湯改善作用強(qiáng)度相對(duì)較弱(表1-1，1-2)。

表1-1 對(duì)急性支氣管炎大鼠血清中神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平的影響

表1-2 對(duì)急性支氣管炎大鼠血清中神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平的影響

2.2對(duì)大鼠BALF中神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平的影響 與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠BALF中神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而逐步顯著升高，造模第3天開(kāi)始，5種因子水平均明顯升高(p<0.01)，而造模第7天時(shí)進(jìn)一步升高(p<0.01)。與模型組相比，惠菲寧可明顯抑制BALF中神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平，改善作用相對(duì)較強(qiáng)(p<0.05，p<0.01)，急支糖漿和高劑量前胡湯對(duì)神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平也具有明顯的改善作用(p<0.05，p<0.01)，低劑量前胡湯改善作用強(qiáng)度相對(duì)較弱(表2-1，2-2)。

表2-1 對(duì)急性支氣管炎大鼠BALF中神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平的影響

表2-2 對(duì)急性支氣管炎大鼠BALF中神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平的影響

2.3對(duì)大鼠肺組織中SP和NGF水平的影響 與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠肺組織中SP和NGF水平隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而逐步顯著升高，造模第3天開(kāi)始明顯升高(p<0.01)，而造模7天時(shí)進(jìn)一步升高(p<0.01)。與模型組相比，惠菲寧可明顯抑制肺組織中SP和NGF水平，改善作用相對(duì)較強(qiáng)(p<0.05，p<0.01)，急支糖漿和高劑量前胡湯對(duì)神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平也具有明顯的改善作用(p<0.05，p<0.01)，低劑量前胡湯改善作用強(qiáng)度相對(duì)較弱(表3)。

表3 對(duì)急性支氣管炎大鼠肺組織中SP和NGF水平的影響

2.4對(duì)大鼠肺組織中NK-1、VR1和p38 MAPK表達(dá)量的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示，煙熏造模自第3天可以明顯增加肺組織中NK-1和p38MAPK的mRNA表達(dá)(p<0.01)，第7天后變化更加顯著；但對(duì)于VR1的mRNA表達(dá)未見(jiàn)顯著影響。與模型組相比，惠菲寧對(duì)于模型大鼠肺組織NK-1和p38MAPK的mRNA表達(dá)具有顯著抑制作用(p<0.01)，急支糖漿和前胡湯也有不同程度的抑制作用(p<0.05，p<0.01)。各受試藥物組對(duì)模型大鼠肺組織VR1的mRNA表達(dá)均未見(jiàn)明顯影響(圖1)。

圖1 前胡湯對(duì)急性支氣管炎大鼠肺組織中SP通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平的影響(M±SD，N=8)**p<0.01，與對(duì)照組相比；#p<0.05，##p<0.01，與模型組相比。

Western blot結(jié)果顯示，煙熏造模自第3天可以明顯增加肺組織中NK-1和p38 MAPK的蛋白表達(dá)(p<0.01)，第7天后變化更加顯著，而VR1蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化，蛋白水平變化趨勢(shì)與mRNA表達(dá)水平一致。與模型組相比，惠菲寧對(duì)肺組織NK-1和p38 MAPK的蛋白表達(dá)具有顯著抑制作用，急支糖漿和前胡湯也有不同程度的抑制作用。各受試藥物組對(duì)模型大鼠肺組織VR1的蛋白表達(dá)均未見(jiàn)明顯影響(圖2)。

圖2 前胡湯對(duì)急性支氣管炎大鼠肺組織中SP通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平的影響(C：對(duì)照組；M：模型組；JZT：急支糖漿組；HFN：惠菲寧組；QTH、QTL：前胡湯高、低劑量組)

3 討論

SP、NKA和CGRP等神經(jīng)肽類(lèi)分布于呼吸道C纖維末梢中，它們通過(guò)多種形式影響氣道組織并可誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥[10,11]。氣道神經(jīng)源性炎癥發(fā)病機(jī)制在于感染及炎癥刺激導(dǎo)致氣道上皮損傷甚至脫落，導(dǎo)致上皮下感覺(jué)神經(jīng)元末梢暴露于炎癥介質(zhì)而易被刺激，使得神經(jīng)肽或遞質(zhì)釋放增多[12,13]。增多的神經(jīng)肽類(lèi)物質(zhì)可直接刺激感覺(jué)神經(jīng)末梢導(dǎo)致咳嗽敏感性增高；也可以收縮氣道平滑肌、增加氣道腺體分泌、擴(kuò)張血管和增加血管通透性、活化氣道炎癥細(xì)胞等促進(jìn)氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠血清、BALF和肺組織中SP、NKA、NKB 和CGRP等神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而逐步顯著升高，表明氣道神經(jīng)源性炎癥參與了急性支氣管炎的病理過(guò)程，而前胡湯可明顯抑制模型大鼠體內(nèi)神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平，抑制作用具有一定的劑量相關(guān)性。

NGF是氣道神經(jīng)源性炎癥的上游調(diào)控因子，其與神經(jīng)肽共同調(diào)控氣道炎癥反應(yīng)。在炎癥刺激下，NGF受體表達(dá)上調(diào)，由神經(jīng)元的軸突末稍攝取，逆行運(yùn)輸?shù)奖掣?jié)，使神經(jīng)元敏感性增加，釋放SP，介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥[16]。SP是氣道神經(jīng)源性炎癥的核心介質(zhì)，更是導(dǎo)致咳嗽敏感性增高的重要因素[17]。其與NK1結(jié)合，作用于多種效應(yīng)細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞)等，引起氣管滲出、氣道收縮，介導(dǎo)氣道神經(jīng)源性炎癥，導(dǎo)致咳嗽敏感性增高[18,19]。蛋白激酶 p38屬于絲裂原活化蛋白激酶 MAPK家族，是細(xì)胞生物信號(hào)跨膜傳遞的重要信號(hào)分子，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中具有廣泛的參與，是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)之一[20]。p38 MAPK是SP的重要下游信號(hào)分子，SP可以通過(guò)NK1受體，激活p38 MAPK，進(jìn)而活化免疫細(xì)胞，釋放炎癥介質(zhì)[21]。與正常大鼠相比，模型組大鼠肺組織中NGF和SP水平隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而逐步顯著升高，且肺組織中NK-1及p38 MAPK的mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，表明NGF/SP/p38 MAPK通路參與了此模型呼吸道炎癥反應(yīng)，而前胡湯可明顯抑制模型大鼠肺組織內(nèi)此通路信號(hào)分子水平，抑制作用具有一定的劑量和時(shí)間相關(guān)性。

VR1屬于瞬時(shí)受體電位類(lèi)香草酸受體亞型[22]。呼吸道C纖維末梢上有VR1的功能性表達(dá)，在呼吸道疾病中，VR1可作為感受器將刺激信息傳至中樞神經(jīng)，也可以作為效應(yīng)器，引起局部炎癥，即氣道神經(jīng)源性炎癥[23]。VR1常與神經(jīng)肽在同一軸突中共存在，VR1活化可誘導(dǎo)C纖維末梢釋放神經(jīng)肽SP等[24,25]。本實(shí)驗(yàn)中，模型大鼠肺組織中VR1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均未見(jiàn)顯著改變，而前胡湯等治療組對(duì)VR1的表達(dá)水平也未見(jiàn)明顯影響，提示VR1在此模型中作用較弱。

綜上，煙熏可引起大鼠出現(xiàn)明顯的急性支氣管炎癥反應(yīng)，同時(shí)伴有神經(jīng)源性炎癥物質(zhì)水平顯著升高，提示炎性分子信號(hào)通路被激活和神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的參與。前胡湯灌胃給藥對(duì)于此模型氣道神經(jīng)源性炎癥具有較好的改善作用，其作用機(jī)理與調(diào)節(jié)NGF/SP/p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。