趙紅菲，郭俊杰，莊 鑫，沈曉君*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春130117）

五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)。具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心的功效，用于久嗽虛喘，夢(mèng)遺滑精，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗盜汗，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，心悸失眠。臨床上主要有生品、醋五味子兩種炮制品[1]，2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)五味子醇甲的含量進(jìn)行了規(guī)定[1]，但蒸制時(shí)間、加輔料量、燜潤(rùn)時(shí)間尚沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，《中國(guó)藥典》也對(duì)醋五味子的炮制終

點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了規(guī)定，但其中涉及顏色指標(biāo)的描述較為“模糊”，主觀性較強(qiáng)，無(wú)法科學(xué)準(zhǔn)確判定炮制終點(diǎn)[2]。本研究采用單因素與正交設(shè)計(jì)相結(jié)合方法，對(duì)五味子醋制工藝進(jìn)行了優(yōu)選。利用色度空間理論，對(duì)與五味子炮制“火侯”相關(guān)的顏色指標(biāo)進(jìn)行了量化研究，為其炮制規(guī)范化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 材料

五味子藥材購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市宏檢藥業(yè)，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為正品；五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)110857，純度＞99.9%），五味子甲素對(duì)照品（批號(hào)PCS0875，純度＞99.5%），五味子乙素對(duì)照品（批號(hào)PCS0876，純度＞99.1%）均購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑為分析純；水為重蒸餾水。

1.2 儀器

LC210型高效液相色譜儀（上海儀電分析儀器有限公司）；NH310型色彩色差儀（深圳市三恩馳科技有限公司）；103型高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；YXQ-LS-50A型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)

本研究考察了最佳醋用量、悶潤(rùn)時(shí)間和蒸制時(shí)間，因素水平見(jiàn)表1。分別稱取5份五味子（每份100g）按各因素水平試驗(yàn)，在40℃烘箱中烘干，粉碎（通過(guò)30目篩），按“2.4”項(xiàng)下測(cè)定化學(xué)成分含量，結(jié)果見(jiàn)表6。以總木脂素含量的高低作為考察指標(biāo)，結(jié)果表明最佳的醋用量為30ml、燜潤(rùn)時(shí)間為2h、蒸制時(shí)間為4h。

表1 單因素考察水平表Table 1 The single factor investigation level table

2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]本研究選擇輔料用量、蒸制時(shí)間、燜潤(rùn)時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考察，因素水平見(jiàn)表2。以五味子醇甲、五味子甲素及五味子乙素3種木脂素的總量為考察指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3、4。從表4的方差分析結(jié)果看，A、C因素對(duì)五味子中總木脂素的含量具有顯著性影響，而B(niǎo)因素的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合直觀分析綜合考慮，醋炙五味子的最佳炮制工藝條件為A2B1C2，即將干凈的五味子，加30%的米醋燜潤(rùn)2h，蒸制3h，取出，晾涼，篩去碎屑，即可。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 The orthogonal experiment factor level table

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The orthogonal experiment results

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取3份五味子，按照最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表5，總木脂素的平均含量為1.2759%，RSD為0.2%，表明該最佳工藝合理可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Verify the test results

2.4 含量測(cè)定[4-6]

2.4.1 色譜條件

Hypersil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，0-17 min(A為50%)，17-25 min(A為50%~55%)，25-30 min，(A為55%~75%)，30-35min（A為75%），35-40min（A為75%~65%），40-45min（A為65%~50%）；體積流量1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)217nm；進(jìn)樣量10μL；柱溫30℃，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 樣品（C）與混合對(duì)照品（A）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC of sample(C)and mixed reference substances(A)

2.4.2 對(duì)照品溶液的配制

以甲醇為溶劑配制成含0.085mg/ml五味子醇甲、0.098mg/ml五味子甲素和0.01mg/ml五味子乙素的混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4.3 供試品溶液的配制

稱取樣品（過(guò)3號(hào)篩）約0.25g，精密稱定，置于錐形瓶中加甲醇25ml，精密稱定，超聲提取30min，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，取續(xù)濾液即得。

2.4.4 方法學(xué)考察

2.4.4.1 線性關(guān)系試驗(yàn)

取五味子混合對(duì)照品溶液3、6、9、12、15μL，按上述條件進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表6，表明呈良好的線性關(guān)系。

表6 3種成分回歸方程及線性范圍Table5 Regression equations and linear ranges of 3 constituents

2.4.4.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定木脂素含量，并記算其RSD值。結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的RSD值分別為1.54%、1.43%、0.67%，表明儀器的精密性較良好。

2.4.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10μL，室溫放置0、3、6、9、12、24h后，測(cè)定木脂素含量，并計(jì)算其RSD值。結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素在不同時(shí)間時(shí)的RSD分別為0.70%，0.58%、0.65%，表明五味子樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取五味子樣品0.25g共6份，精密穩(wěn)定，按照“2.4.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定木脂素含量，并計(jì)算其RSD值。結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素的RSD分別為0.37%、0.67%、0.59%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的五味子0.125g，共6份，分別精密加入各對(duì)照品適量，按“2.4.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，并測(cè)定含量。根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算加樣回收率，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的加樣回收率（RSD）分別為99.60%（1.28%）、101.43%（0.93%）、99.46%（1.03%），結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可行。

2.4.5 樣品含量測(cè)定

取供試品溶液10μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.5 樣品顏色值測(cè)量

將上述各樣品粉碎[7-9]，用色差儀在D65光源、4mm口徑、SCE模式下，測(cè)量顏色的L、a、b值，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 直線回歸方程與相關(guān)系數(shù)

2.6 指標(biāo)成分與色度值相關(guān)性分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，詳見(jiàn)表6，正態(tài)性檢驗(yàn)表明，色度a值與五味子醇甲、五味子乙素和總木脂素含量具有良好的正態(tài)性，且有極顯著負(fù)線性相關(guān)；色度L值與五味子乙素具有良好的正態(tài)性，且有顯著負(fù)線性相關(guān)；其它色度值與化學(xué)成分間無(wú)任何相關(guān)性。

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

醋五味子的最佳炮制工藝為：五味子加30%的米醋，悶潤(rùn)2h，蒸制3h；五味子醋蒸過(guò)程中，可以通過(guò)測(cè)定其L、a色度值，科學(xué)地判定炮制終點(diǎn)，也為深入研究中藥炮制終點(diǎn)判定方法奠定了基礎(chǔ)。

3.2 討論

3.2.1 五味子醋制工藝的研究雖有記載[10]，但均為多因素、多水平的正交試驗(yàn)研究，故本研究首先考察了輔料用量、燜潤(rùn)時(shí)間、蒸制時(shí)間等單一因素，對(duì)五味子化學(xué)成分的影響，為本研究正交試驗(yàn)的因素與水平選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

3.2.2 本文在五味子醋制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)方面，增加了五味子甲素、五味子乙素和總木脂素含測(cè)指標(biāo)，并量化了炮制終點(diǎn)的判定標(biāo)準(zhǔn)，為充分保證五味子醋制過(guò)程的科學(xué)性與準(zhǔn)確性奠定了基礎(chǔ)。

3.2.3 中藥炮制是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，在炮制過(guò)程中藥材內(nèi)部物理結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分，都會(huì)隨著外界環(huán)境的變化而變化，而現(xiàn)有的判定標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法準(zhǔn)確對(duì)炮制的“適中”顏色進(jìn)行定量闡述[11]。鑒于中藥炮制中存在的共性問(wèn)題，本文采用色差計(jì)對(duì)五味子炮制終點(diǎn)進(jìn)行了顏色量化研究，為解決中藥炮制的關(guān)鍵共性技術(shù)問(wèn)題—“顏色”的準(zhǔn)確把握，提供了一種高效、簡(jiǎn)便、精確、穩(wěn)定的新方法及新思路[12-13]。