阮洪生，張兆遠

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W校中藥學院，寧波315503；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶163316）

金蕎麥為蓼科植物金蕎麥Fagopyrum dibotrys(D.Don)Hara的干燥根莖，浙江習稱金鎖銀開，味微辛、澀，涼，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、排膿祛瘀的功效，臨床用于肺癰吐膿，肺熱喘咳，乳蛾腫痛等證的治療[1]。金蕎麥的主要活性成分為原矢車菊素、槲皮素、表兒茶素-3-沒食子酸酯等黃酮類化合物[2]?！吨袊幍洹分薪鹗w麥藥材的含量測定標準采用單一的表兒茶素作為對照品[1]，研究表明，金蕎麥中還含有金絲桃苷、槲皮苷等黃酮類成分[3-6]，為更好地控制金蕎麥的質量，本實驗建立了HPLC法測定金蕎麥中表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷的含量測定方法，為其質量標準的研究和相關產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Shimadzu LC2010HT高效液相色譜儀、LCsolution色譜工作站(日本島津)；電子天平FA2004N（上海精密科學儀器有限公司）；KQ-600E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE52-99旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 材料

金蕎麥，黑龍江康麥斯藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)鑒定為蓼科植物金蕎麥Fagopyrum dibotrys(D.Don)Hara的干燥根莖[1]；色譜甲醇（天津市福晨化學試劑廠）；色譜乙腈（天津市光復精細化工研究所）；分析純磷酸（沈陽市華東試劑廠）；表兒茶素標準品（批號：ZY151110）、槲皮苷標準品（批號：ZY151112）、金絲桃苷標準品（批號：ZY151109）（克拉瑪爾公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為waters C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠。表兒茶素測定的流動相為乙腈-0.004%磷酸水溶液（10∶90，v/v），測定波長為280nm[1]；金絲桃苷測定的流動相為甲醇-0.004%磷酸水溶液（50∶50，v/v），測定波長為345nm[4]；槲皮苷測定的流動相為甲醇-0.004%磷酸水溶液（45∶55，v/v），測定波長為345nm。流速均為1.0mL/min；柱溫均為35℃；進樣量均為10μL。洗脫方式均為等度洗脫。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷標準品各2mg置于10mL容量瓶中，加入色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲30min，經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）過濾，濾液作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取金蕎麥粉末20g，加240mL蒸餾水回流提取2次，每次3h，減壓抽濾，合并濾液，水浴蒸干，殘渣加乙腈-水（10∶90)混合溶液分次洗滌，洗液轉移至10mL量瓶中，加乙腈-水（10∶90)混合溶液至刻度，搖勻，離心5min（3000轉/min），精密量取上清液5mL，加于聚酰胺柱（80~100目，內徑為1.0cm，柱長為15cm，濕法裝柱）上，以蒸餾水50mL洗脫，棄去水液，再用95%乙醇100mL洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，殘渣用乙腈-水(10∶90)混合溶液溶解，轉移至10mL量瓶中，加乙腈-水(10∶90)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液[1]。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統(tǒng)適應性實驗

取表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷對照品溶液、金蕎麥供試品溶液在上述色譜條件下進行測定。由圖1可知，表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷對照品的色譜峰與金蕎麥供試品的色譜峰一一對應，且其峰形對稱，分離效果好。

圖1 色譜圖譜

2.4.2 線性關系

分別精密吸取表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷對照品溶液2.00、4.00、6.00、8.00、10.00μL，按“2.1”項下方法進樣，測定峰面積。以對照品溶液進樣體積X為橫坐標，峰面積積分值Y為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。結果見表1和圖2。試驗表明表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷在0.40~2.00μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

表1 標準曲線測定數(shù)據(jù)

2.4.3 精密度考察

取表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷對照品溶液，按“2.1”項下方法，分別連續(xù)6次進樣，每次10μL，測定表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷峰面積積分值。結果RSD分別為1.09%、0.46%、0.92%(n=6)。表明精密度符合要求。

2.4.4 穩(wěn)定性考察

取金蕎麥供試品溶液，按“2.1”項下方法進樣，測定6次，每次間隔2h，測定表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷峰面積積分值。結果RSD分別為1.16%、0.91%、0.48%(n=6)，表明樣品在12h內穩(wěn)定。

2.4.5 重現(xiàn)性考察

取金蕎麥供試品溶液，按“2.1”項下方法進樣，連續(xù)6次進樣，每次10μL，測定表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷峰面積積分值。結果RSD分別為0.93%、0.67%、0.81%(n=6)，表明重現(xiàn)性符合要求。

2.4.6 加樣回收率試驗

采用加樣回收法實驗。取已知含量的供試品5份，每份0.5g，分別加入一定量的表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷對照品，按“2.1”項下方法進樣，計算平均回收率和RSD值。表2結果表明，3種成分的平均回收率均接近于為100%，RSD均較小，表明本方法回收率較高，選擇的含量測定條件可行。

表2 加樣回收率實驗結果

2.5 樣品含量測定

精密稱取3份金蕎麥粉末，每份20g，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下方法進樣，測定表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷的峰面積積分值，以外標法測定并計算含量。結果見表3。

表3 金蕎麥中表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 流動相的選擇

溶劑的極性是選擇流動相的重要依據(jù)，反相色譜一般采用一定比例的甲醇或乙腈作為流動相。本研究中測定表兒茶素時選用乙腈作為有機相，測定金絲桃苷和槲皮苷時選用甲醇作為有機相。此外，待測的表兒茶素、金絲桃苷和槲皮苷均為酸性成分，為達到最佳的分離效果，流動相中添加極少量的磷酸。

3.2 流速對分離度的影響

根據(jù)速率理論，在一定范圍內降低流速可以提高柱效，增大分離度，但流速過慢，分析時間延長，縱向擴散的影響變大也會降低柱效，經(jīng)試驗后最終確定流速為1.0mL/min。

3.3 柱溫對分離效果的影響

柱溫會影響組分在兩相中的分配系數(shù)，實驗發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內升高柱溫，會縮短被測物質的保留時間，增大分離度，但柱溫太高會降低柱效，并會降低分離條件的可適用度。結果顯示當柱溫35℃時，金蕎麥各組分分離度已基本達到要求，因此，最終確定檢測溫度為35℃。

本研究建立了金蕎麥中表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷的HPLC含量測定方法。該方法操作簡便，重復性高，穩(wěn)定性好和專屬性強，并且分析時間短，迅速地提高了分析效率，可作為金蕎麥黃酮類成分的含量測定方法。