劉孟楠，羅 鋼，何清位，劉 平，劉 顏，楊思進*

（1.國家中醫(yī)藥臨床研究基地及心血管內(nèi)科，西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，瀘州646000；2.澳門科技大學中醫(yī)藥學院，氹仔999078）

慢性心臟病是目前最常見的重大疾病之一。2019年發(fā)布的《中國心血管健康與疾病報告》顯示2017年我國心血管疾病死亡人數(shù)占比高達31%[1]。心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是慢性心臟病的主要病理改變，表現(xiàn)為心肌成纖維細胞過度增殖以及細胞外基質(zhì)過度沉積[2]。MF不僅是導致心力衰竭的一個主要原因，而且與心血管死亡風險直接相關。目前常規(guī)治療方案雖能緩解慢性心臟病的臨床癥狀，但由于引起心肌纖維化的因素繁多、機制欠清，尚缺乏有效阻逆心肌纖維化的藥物[3]。近年來中醫(yī)藥治療MF的實驗研究不斷深入，阻止甚至逆轉MF的發(fā)展是研究的一致目標，分子生物水平及基因領域的探索也日趨深入。MF的中醫(yī)病機屬本虛標實、久病入絡，本虛為陰陽虧虛，標實為痰濁、瘀血等[4]。人參是常見的滋補類藥物，在虛癥及急癥中運用廣泛，其提取物人參皂苷及多糖等為主要有效成分，其有效成分在治療MF方面療效顯著[5-7]。

中草藥人參為五加科植物人參（Panax ginsengC.A.Mey）的根，是補氣的常用藥物。人參因集中制作的方法、栽培技術不同、產(chǎn)地區(qū)別而有別直參（朝鮮參、高麗參）野山參、紅參等不同名稱[8]?！叭藚⑽陡?，主補五臟、安精神、定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目、開心、益智，久服輕身延年”是《神農(nóng)本草經(jīng)》對人參功效的描述[9]?！侗静菥V目》亦記載人參能“治男女一切虛癥”[10]。人參在食療保健上可調(diào)理亞健康狀態(tài)，是一種滋補強壯藥，現(xiàn)代研究表明人參對于治療心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)衰弱癥、癌癥等均有一定的療效[11-13]。雖然人參在治療心衰、心肌病及改善MF上具有比較明確的效果，但其潛在的分子機制尚待進一步研究探討。

由于中藥多成分、多途徑和多靶點的特點，很難明確藥效物質(zhì)基礎及作用機制，其作用機制的研究主要停留在療效性指標層面，應用網(wǎng)絡藥理學方法的研究較少。因此，本研究旨在運用網(wǎng)絡藥理學方法尋找人參中具有類藥性、口服吸收較好的成分，并預測這些成分治療MF的作用靶點及相關通路，為深入研究人參及其中藥復方治療MF的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 人參化學成分的收集和篩選

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology Platform，TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php）是基于系統(tǒng)藥理學收錄《中國藥典》收錄的中藥材的作用靶點、成分、藥物關鍵參數(shù)的平臺，可用于中藥材藥動學、靶標預測等分析，借助平臺信息可以從整體水平研究藥物靶標網(wǎng)絡和疾病網(wǎng)絡，從而揭示中藥性質(zhì)與作用機制[14]。從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取人參的化學成分，輸入關鍵詞“人參”，得到活性成分信息。本研究通過篩選出同時滿足生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18的化學成分以及文獻報道的有活性的成分。

1.2 預測潛在靶點

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索出人參的活性成分的作用靶點，作為候選藥物靶點。然后，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將所的藥物靶點轉換成基因名稱[15]。以“myocardial fibrosis”為關鍵詞，通過在GeneCards（https://www.genecards.org/）收集與MF相關的基因，將挖掘得到的MF相關基因與藥物靶點基因映射篩選出共同靶點，從而得到人參活性成分治療MF的目標作用靶點。

1.3 活性成分-疾病靶點構建

將候選化學成分與MF靶點通過Cytoscape3.8.2建立人參的化合物-MF靶點群網(wǎng)絡，節(jié)點（node）代表藥物化學成分與潛在作用靶點；邊（edge）展現(xiàn)了人參有效成分和其作用靶點之間的聯(lián)系，根據(jù)化合物與靶點連接情況篩選出人參作用于MF的關鍵化合物。

1.4 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建

為分析人參治療MF靶蛋白之間的相互作用，以STRING數(shù)據(jù)平臺（https://string-db.org/）構建人參治療MF靶蛋白PPI網(wǎng)絡。將藥物-疾病交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，物種設為“homo sapiens”（人類），最低相互作用閾值設為中等置信度0.4“medium confidence”，勾選“hide disconnected nodes in the network”以隱藏游離點，其余參數(shù)保持默認設置，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡關系，結果保存成PNG及TSV格式。TSV文件與R語言鏈接并使用barplot包進行編譯，以各基因連接節(jié)點數(shù)量為變量繪制PPI網(wǎng)絡核心基因柱狀圖。

1.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析

將藥物-疾病交集基因導入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），輸入靶基因名稱列表，限定物種為“Homo Sapiens”，將靶點基因修正為官方名稱，得到基因的ID，設定閾值P＜0.05，進行基因本體（Gene Onotology，GO）生物過程富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，結果用R語言制作柱狀圖及氣泡圖。

2 結果

2.1 候選化合物及靶點的篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫中，獲得化合物190個，以OB≥30%，DL≥0.18作為篩選條件，得到候選成分21個，結果見表1。逐一對應靶點，得到256個靶點。

表1 人參候選化合物成分

2.2 疾病靶點獲取結果

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到個3125個MF相關靶點基因。

2.3 網(wǎng)絡構建及分析結果

將256個化合物靶點與3125個MF相關靶點基因進行映射，得到38個共同靶點基因，對應人參17個候選化合物。利用cytoscape3.8.2軟件構建中藥化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡。詳見圖1。

圖1 人參有效成分-靶點網(wǎng)絡圖

藍色橢圓形為藥物，紅色菱形為疾病，綠色六邊形為藥物，紫色三角形為藥物有效成分。

2.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建及關鍵靶點篩選

將映射得到的38個交集靶點基因導入STRINGS數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡分析，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡圖，如圖2示，除去1個游離節(jié)點后，PPI網(wǎng)絡包含37個靶蛋白節(jié)點，共有151條邊代表了蛋白之間互作用，處于該蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中心的蛋白質(zhì)包括B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL2），含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)1/3/8/9，絲裂原激活蛋白激酶8（Recombinant Mitogen Activated Protein Kinase 8，MAPK8）和B細胞κ輕肽基因增強子核因子抑制因子（αnuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in Bcells inhibitor，NFKBIA）等，這些關聯(lián)的基因或蛋白可能是人參治療MF的重要靶點。這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡中非常重要，通過計算每個因的連接節(jié)點數(shù)目，找出前15個PPI核心基因，這些即為人參治療MF的核心基因。詳見圖3。

圖2 人參治療MF靶蛋白PPI網(wǎng)絡圖

圖3 PPI核心基因

2.5 GO功能分析

38個藥物-疾病交集基因影響了78個生物學過程（P＜0.05），選取P值排名前20的功能信息，詳見表2，圖4。圖表結果顯示，人參的活性成分主要富集在核受體的活動，配體激活的轉錄因子活性，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號通路，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程，轉錄輔激活結合，G蛋白偶聯(lián)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性，類固醇結合，神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動，轉錄輔因子結合，G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等方面。

表2 藥物-疾病交集基因具有的功能信息

圖4 GO功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG富集通路分析

結果通路富集分析發(fā)現(xiàn)，該38個靶點顯著富集在88條通路上（P＜0.05），其中20條通路與MF密切相關。詳見圖5，其中，主要通路包括腫瘤壞死因子信號通路，弓形體病通路，流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路，前列腺癌通路，糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路，乙型肝炎通路，甲型流感通路，細胞凋亡通路，麻疹通路，軍團病通路等，提示人參可以通過以上多條通路作用于MF。得到相關的通路圖，詳見圖6。

圖5 人參治療MF關鍵靶點參與的通路富集信息氣泡圖圓點越大，富集基因數(shù)目越多

圖6 人參治療MF的相關通路

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，篩選出人參中21個活性成分，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫得到3125個MF的相關靶點，通過映射找到了17個與MF直接相關的化合物及38個藥物與疾病共同直接作用的蛋白靶點，構建了“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡圖，并對靶點進行GO富集分析和KEGG通路分析，明確了相關蛋白靶點的功能類別及參與改善MF作用的信號通路。GO功能富集分析結果顯示，人參改善MF的基因功能主要體現(xiàn)涉及核受體的活動，配體激活的轉錄因子活性，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號通路，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程，轉錄輔激活結合，G蛋白偶聯(lián)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性，類固醇結合，神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動，轉錄輔因子結合，G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等生物過程，這與MF及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展都有一定的聯(lián)系。通過String數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析，我們發(fā)現(xiàn)這些蛋白之間存在著復雜的聯(lián)系，因此靶點之間的相互作用調(diào)節(jié)可能是人參治療MF的潛在機制之一。另外，通過David數(shù)據(jù)庫對這38個蛋白進行KEGG信號通路富集分析，我們得到P＜0.05的信號通路，KEGG富集通路分析發(fā)現(xiàn)88條通路與MF發(fā)病顯著相關，包括腫瘤壞死因子信號通路，弓形體病通路，流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路，前列腺癌通路，糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路，乙型肝炎通路，甲型流感通路，細胞凋亡通路，麻疹通路和軍團病通路等。

引起慢性心臟病的因素頗多，其中，高血壓是最重要和最常見因素[16]。目前認為，高血壓和腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）的激活是慢性心衰心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的主要因素[2]。臨床防治心肌纖維化主要依賴抗高血壓藥物，RAS抑制劑及他汀類藥物[17]。雖然這些藥物可一定程度上改善MF，但仍存在諸多不良反應或禁忌癥。如沙庫巴曲纈沙坦鈉片可加重阿爾茲海默癥病情，ACEI類藥物禁用于高血肌酐及高血鉀患者[18]。目前針對MF的新型藥物如尼達尼布、波生坦等，雖有基礎研究證實其可抑制MF的進展，但還缺少大型循證醫(yī)學的證據(jù)[19]。中醫(yī)藥在治療高血壓心肌病、心力衰竭、心肌缺血等慢性心臟病具有巨大優(yōu)勢，從傳統(tǒng)醫(yī)學獲得靈感并取得現(xiàn)代循證醫(yī)學的支持是推動中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展方向[20]。歷代醫(yī)家的記載及現(xiàn)代藥理研究均表示人參的藥用及保健價值在治療MF中具有巨大的潛力。

MF是因持續(xù)性或反復加重的心肌缺血缺氧所產(chǎn)生的心肌病理改變，亦是多種慢性心臟病的共同結局，分子層面上表現(xiàn)為纖維細胞外基質(zhì)膠原分泌增加、降解減少，以膠原（Collagen）Ⅰ/Ⅲ比例失調(diào)以及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積為主要特征[2]。MF具有雙重特性，一方面，其保證了因為各種原因導致的心肌損傷后，心肌仍最大限度保持原有結構與功能，是某種意義上的“瘢痕修復”。另一方面，過度的MF會導致心室僵硬度增加，造成心律失常，促進心肌細胞肥大，極大地影響心臟的收縮和舒張功能，最終導致心肌順應性下降、心力衰竭[16]。心肌纖維化形成機制非常復雜，尚未完全闡明。比如血液動力學障礙導致壓力過負荷、長期炎癥反應、代謝毒素影響、腎素-血管緊張素的激活、各種生長因子的異常分泌及氧化應激、多條信號通路的激活等，上述諸多因素均參與了MF的發(fā)生發(fā)展[2]。本研究通過GO功能分析發(fā)現(xiàn)38個藥物-疾病交集基因影響了78個生物學過程，該38個靶點顯著富集在88條通路上，其中包括對器官纖維化研究較為深入的腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信號通路，核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路，核苷酸結合寡聚域樣受體（NOD-like receptor，NLR）信號通路，網(wǎng)絡樣受體（toll-like receptor，TLR）信號通路，PI3K/Akt信號通路，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，RAS信號通路等，而目前對于器官纖維化聯(lián)系最為直接的TGF-β/Smad信號通路未列其中，但通過查閱人參相關提取物對于纖維化疾病的研究亦可發(fā)現(xiàn)其對該通路具有調(diào)控作用，考慮與通路之間相關下游蛋白的交叉有關。在本研究中發(fā)現(xiàn)TNF信號通路對MF具有顯著的影響。TNF-α是重要的促炎性細胞因子，作為激活細胞級聯(lián)反應的主要介質(zhì)，在細胞因子網(wǎng)絡中發(fā)揮關鍵作用[21]。NF-κB是調(diào)控多種基因轉錄的關鍵因子，活化后能調(diào)控包括TNF-α在內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)的轉錄，作為炎性反應的整合者在免疫調(diào)節(jié)和炎癥發(fā)生過程中具有重要作用[22]。本研究亦發(fā)現(xiàn)人參提取物對于炎癥相關信號通路具有調(diào)節(jié)作用。

MF在中醫(yī)學中可根據(jù)其臨床表現(xiàn)歸屬于“心衰”“心悸”“胸痹”等范疇[5]。導致MF的病因多樣，病機有別故存在諸多證型，需選擇不同治則來進行治療。多數(shù)醫(yī)家認為該病的病機多以肝腎虧虛為本，痰瘀互結為標，故多采用補益肝腎、化痰祛瘀等方法治療[23]。人參作為滋補強壯之要藥多用于虛癥的補益之法，大量的基礎研究證實人參提取物豆甾醇、山柰酚、人參二醇及人參皂苷等均具有保護受損心肌、抑制心肌纖維化的作用。此外還有很多中藥的有效成分例如小檗堿、熊果酸、白藜蘆醇等被證實具有抑制MF的作用[5]。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法對人參活性成分和MF進行靶標挖掘和通路分析，預測出人參治療MF可能存在的17個化合物，38個靶點及88條潛在的通路，初步揭示了人參治療MF的作用機制，證實了中藥治療疾病的多成分、多靶點、多通路的特點，為其后續(xù)基礎研究及臨床試驗提供依據(jù)和方向。然而僅利用網(wǎng)絡藥理學技術研究人參的活性成分和作用靶點，可能存在相當?shù)木窒扌?，如原始信息來源于不一致，各?shù)據(jù)庫存在的各種差異等，因此，未來還需大量基礎研究來驗證本次研究成果。