盧軍,董麒鋒,沈壯虹

盧軍,浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院藥劑科 浙江省杭州市 311200

董麒鋒,浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院普外科 浙江省杭州市 311200

沈壯虹,浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院腫瘤內(nèi)科浙江省杭州市 311200

0 引言

在我國,由于胃癌的臨床前篩查率低,使其已成為導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因[1].目前,隨著治療技術(shù)和方法的改進(jìn),GC患者的長期生存率盡管有所提高,但中晚期患者的復(fù)發(fā)率和死亡率仍然居高不下[2].而,深入探索影響胃癌進(jìn)展的分子靶點有可能為開發(fā)新的胃癌療法和提高患者生存率提供新的策略.

外被體蛋白復(fù)合物β2亞基(coatomer protein complex subunit beta 2,COPB2)是構(gòu)成高爾基體的外被體包被蛋白復(fù)合體I,主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[3,4].而,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的完整性對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要意義.近來研究發(fā)現(xiàn),COPB2除參與囊泡運(yùn)輸外,還參與細(xì)胞周期調(diào)控[5]和細(xì)胞凋亡[6,7].特別是最近的研究顯示,COPB2可參與調(diào)節(jié)肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[5,8,9].然而,COPB2在胃癌中表達(dá)和臨床意義仍不完全明確.因此,本實驗探索COPB2在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況,隨后探討COPB2對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其初步機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌組織與癌旁組織樣本的收集:本研究經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn),所有患者均提供書面同意.收集10例接受胃癌切除術(shù)的患者的胃癌組織和配對的癌旁組織.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系、裸鼠和實驗試劑:人正常胃上皮細(xì)胞(GES-1)和胃癌細(xì)胞(SGC-7901、MKN45、AGS)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所.10只6-7周齡SPF級雄性BALB/c裸鼠購于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司.胎牛血清(FBS)、Dulbecco改良版Eagle培養(yǎng)基(DMEM)購于美國Life Technologies公司;LipofectamineTM2000和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司;RIPA、CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒、BCA試劑盒和GAPDH抗體購于上海碧云天生物科技有限公司;COPB2和Ki67抗體購自英國Abcam公司;p-Akt和Akt抗體購自美國CST公司;COPB2-shRNA的慢病毒載體和對照shRNA慢病毒載體(ConshRNA)購自上海吉瑪基因公司;pcDNA-COPB2和對照pcDNA載體(pcDNA-Con)購自上海吉凱基因公司.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:將GES-1、SGC-7901、MKN45和AGS細(xì)胞接種在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,置于細(xì)胞孵箱中培養(yǎng).

將SGC-7901細(xì)胞按2×105個/孔接種至24孔板中,次日,將培養(yǎng)基更換為含6 μg/mL聚凝胺培養(yǎng)基并分別加入30 MOI的COPB2-shRNA和Con-shRNA,48 h后加入嘌呤霉素篩選1 wk,用Western blot檢測COPB2的相對表達(dá),以評估穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果.

將SGC-7901細(xì)胞按5×105個/孔接種至6孔板中,待細(xì)胞約80%融合時,用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染pcDNA-Con和pcDNA-COPB2,48 h后,用Western blot檢測COPB2的相對表達(dá),以評估瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果.

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot):在冰上用RIPA裂解細(xì)胞,并在4 ℃下以1.2×104g離心10 min收集蛋白溶液.用BCA試劑盒對蛋白溶液定量后,每樣本取40 μg蛋白樣品,通過SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜.封閉膜后,在4 ℃下將膜與一抗[p-Akt (1:1000)、COPB2和Akt (均1:2000)、GAPDH (1:5000)]一起孵育過夜.洗膜后,在室溫下將膜與與二抗一起孵育1 h.再次洗膜后,通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒對條帶顯影.用Image J軟件對COPB2的表達(dá)進(jìn)行定量.

1.2.4 細(xì)胞增殖測定:將已轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞按5×103個/孔接種至96孔板中,培養(yǎng)24、48和72 h,加入CCK-8試劑并孵育2.5 h,用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長的吸光度OD值.

1.2.5 細(xì)胞集落形成測定:將已轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞按1000個/mL的細(xì)胞密度接種于6孔板中,每3 d換液一次,兩周后,用甲醇固定細(xì)胞后,用姬姆薩染色,對細(xì)胞集落(肉眼可見或顯微鏡下大于50個細(xì)胞簇)進(jìn)行計數(shù).

1.2.6 細(xì)胞遷移和侵襲測定:將已轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制備成2×104個/mL的細(xì)胞懸液.細(xì)胞遷移測定:取200 μL細(xì)胞懸液加入transwell板的上室中,600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基加入下室.細(xì)胞侵襲測定:取200 μL細(xì)胞懸液加入基質(zhì)膠涂覆膜的transwell板的上室中,600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基加入下室.培養(yǎng)24 h后,分別取出上室,擦除膜的上表層的細(xì)胞,然后甲醇固定膜的下表層的細(xì)胞并用結(jié)晶紫染色.在顯微鏡下對染色的細(xì)胞進(jìn)行拍照并計數(shù).

1.2.7 腫瘤異體移植模型:本研究經(jīng)過動物倫理委員會批準(zhǔn).將穩(wěn)轉(zhuǎn)COPB2-shRNA或Con-shRNA的SGC-7901細(xì)胞分別接種于BALB/c裸鼠的頸部皮下,每只小鼠接種5×106個細(xì)胞.接種后,每5天測量一次瘤體體積(V(mm3)=長徑×寬徑2× 0.5).第15天,麻醉并處死小鼠,分離瘤體組織.

1.2.8 免疫組織化學(xué)(IHC):取臨床樣本組織和腫瘤異體移植模型瘤體組織,分別用4%多聚甲醛固定后,用常規(guī)石蠟包埋法包埋組織.石蠟組織切為4 μm后的切片,然后用二甲苯脫蠟和梯度分級的乙醇再水化后,用3%的過氧化氫處理以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性.將切片放入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中在微波爐中煮沸5 min以修復(fù)抗原.切片用10%的正常山羊血清封閉后,在4 ℃下與一抗(COPB2和Ki67,1:200;p-Akt,1:100)孵育過夜.用PBS清洗組織切片后,在室溫下與生物素標(biāo)記二抗(1:200)孵育30 min.用PBS清洗組織切片后,在室溫下與鏈霉親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物(1:200)孵育45 min.用PBS清洗組織切片后,用DAB顯色和蘇木素復(fù)染后,常規(guī)脫水、封片和顯微鏡下觀察.

統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism 6軟件將實驗中所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析.數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組之間比較采用t檢驗,多組之間比較采用單因素方差分析;以P<0.05為界限判斷有無統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 COPB2在胃癌組織和癌細(xì)胞系中表達(dá)情況 免疫組化染色(圖1A)顯示,COPB2在癌旁組織陰性表達(dá),而在胃癌組織中呈現(xiàn)彌漫強(qiáng)陽性表達(dá).Western blot結(jié)果(圖1B)顯示,相對于正常胃上皮細(xì)胞系GES-1,COPB2在3種胃癌細(xì)胞系蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.01).

圖1 COPB2在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中表達(dá)情況. A:免疫組化檢測癌旁組織及胃癌組織中COPB2表達(dá)的代表性圖.B:Western blot檢測正常胃上皮細(xì)胞系及胃癌細(xì)胞系中COPB2蛋白水平,與GES-1細(xì)胞比較:bP<0.01;n=3.

2.2 敲低和過表達(dá)COPB2效果的驗證 通過Western blot分析COPB2-shRNA及pcDNA-COPB2的轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果(圖2)表明,相對于Con-shRNA組,COPB2-shRNA組的SGC-7901細(xì)胞中COPB2蛋白表達(dá)降低(圖2A,P<0.01);相對于pcDNA-Con組,pcDNA-COPB2組的SGC-7901細(xì)胞中COPB2蛋白表達(dá)增加(圖2B,P<0.01).

圖2 COPB2-shRNA與pcDNA-COPB2的轉(zhuǎn)染效率檢測.A:轉(zhuǎn)染COPB2-shRNA或Con-shRNA后,Western blot檢測COPB2蛋白表達(dá)水平;與Con-shRNA組比較:bP<0.01;n=3.B:轉(zhuǎn)染pcDNA-COPB2或pcDNA-Con后,Western blot檢測COPB2蛋白表達(dá)水平;與pcDNA-Con組比較:dP<0.01;n=3.

2.3 敲低和過表達(dá)COPB2對胃癌細(xì)胞生長的影響 用CCK-8法檢測了敲低及過表達(dá)COPB2后SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞活性,結(jié)果顯示,相對于Con-shRNA組,COPB2-shRNA組的SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著降低(圖3A,P<0.01);相對于pcDNA-Con組,pcDNA-COPB2組的SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著升高(圖3B,P<0.01).集落形成實驗檢測了敲低及過表達(dá)COPB2后SGC-7901細(xì)胞的集落形成,結(jié)果顯示,相對于Con-shRNA組,COPB2-shRNA組的SGC-7901細(xì)胞的集落形成能力顯著降低(圖3C,P<0.01);相對于pcDNA-Con組,pcDNA-COPB2組的SGC-7901細(xì)胞的集落形成能力顯著升高(圖3D,P<0.01).

圖3 敲低或過表達(dá)COPB2對胃癌細(xì)胞系集落形成的影響.A:CCK-8法檢測敲低COPB2對細(xì)胞活性的影響;與Con-shRNA組比較:aP<0.05,bP<0.01;n=3.B:CCK-8法檢測過表達(dá)COPB2對細(xì)胞活性的影響;與pcDNA-Con組比較:cP<0.05,dP<0.01;n=3.C:集落形成實驗檢測敲低COPB2對細(xì)胞集落數(shù)的影響;與Con-shRNA組比較:fP<0.01;n=3.C:集落形成實驗檢測過表達(dá)COPB2對細(xì)胞集落數(shù)的影響;與pcDNACon組比較:hP<0.001;n=3.

2.4 敲低和過表達(dá)COPB2對胃癌細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響 Transwell法評估細(xì)胞遷移和侵襲的結(jié)果顯示,相對于Con-shRNA組,COPB2-shRNA組的SGC-7901胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著降低(圖4A,P<0.01);相對于pcDNA-Con組,pcDNA-COPB2組的SGC-7901細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著升高(圖4B,P<0.01).

圖4 敲低或過表達(dá)COPB2對胃癌細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響.A:集落形成實驗檢測敲低COPB2對SGC-7901細(xì)胞的遷移和侵襲的影響;與Con-shRNA組比較:bP<0.01,dP<0.01;n=3.B:集落形成實驗檢測過表達(dá)COPB2對SGC-7901細(xì)胞的遷移和侵襲的影響;與pcDNA-Con組比較,fP<0.01,hP<0.01;n=3.

2.5 敲低和過表達(dá)COPB2對p-Akt蛋白表達(dá)的影響Western blot法檢測p-Akt蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示,相對于Con-shRNA組,COPB2-shRNA組的SGC-7901細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)降低(圖5A,P<0.01);相對于pcDNA-Con組,pcDNA-COPB2組的SGC-7901細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)增加(圖5B,P<0.01).

圖5 敲低或過表達(dá)COPB2對胃癌細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)的影響. A:Western blot檢測敲低COPB2對SGC-7901細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)的影響;與Con-shRNA組比較:bP<0.01;n=3.B:Western blot檢測過表達(dá)COPB2對SGC-7901細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)的影響;與pcDNA-Con組比較:dP<0.01;n=3.

2.6 敲低COPB2對胃癌細(xì)胞系在體內(nèi)生長的影響 與Con-shRNA組比較,COPB2-shRNA組瘤體生長明顯減緩(圖6A,P<0.001),瘤體普遍縮小(圖6B).免疫組化結(jié)果(圖6C)顯示,發(fā)現(xiàn)COPB2-shRNA組COPB2、Ki-67及p-Akt染色強(qiáng)度低于Con-shRNA組.上述結(jié)果表明,敲低COPB2可以降低SGC-7901細(xì)胞在體內(nèi)的生長.

圖6 敲低COPB2對胃癌細(xì)胞系在體內(nèi)生長的的影響.A:各組瘤體體積的統(tǒng)計結(jié)果;與Con-shRNA組比較:bP<0.01;n=5.B:各組瘤體的大體形態(tài).C:免疫組化檢測各組瘤體組織中COPB2、Ki67和p-Akt表達(dá)的代表性圖.

3 討論

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,據(jù)最新研究數(shù)據(jù)顯示,其病死率位居所有癌癥相關(guān)死亡的第3位[10].盡管,化療仍是中晚期胃癌患者主要的治療手段,其可在一定程度上延長患者生存期,但化療的不良反應(yīng)突出,且易導(dǎo)致耐藥.近年來,隨著對胃癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制的深入研究,致使胃癌的分子靶向治療越來越受到研究者們的關(guān)注,且個體化靶向治療已為許多癌癥患者帶來了明顯的益處[11].提示,繼續(xù)深入研究影響胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵靶點,可能會為靶向療法提供更多的參考策略.

近年來,研究發(fā)現(xiàn)COPB2參與調(diào)控許多腫瘤的進(jìn)展與預(yù)后.如,Bhandari等[12]研究發(fā)現(xiàn)COPB2在乳腺癌組織中呈高表達(dá)水平,且其表達(dá)水平與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期以及腫瘤大小成相關(guān);Zhou等[13]研究結(jié)果顯示COPB2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào),且其高表達(dá)水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后呈正相關(guān).以上這些數(shù)據(jù)表明COPB2可能與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān),但其在胃癌中的表達(dá)以及作用尚不清楚.本研究顯示,COPB2在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá).腫瘤細(xì)胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展甚至患者死亡的最主要因素.為探索COPB2對胃癌的作用,本研究采用敲低或過表達(dá)的方式研究了COPB2對胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的作用,結(jié)果顯示,過表達(dá)COPB2能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,而敲低COPB2則能抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲.同時,這一結(jié)果在體內(nèi)得證實.

本研究進(jìn)一步對COPB2影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制進(jìn)行了初步探索.眾多研究[14-16]顯示,Akt信號的激活在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用,而抑制Akt信號活性能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲.本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)COPB2能促進(jìn)p-Akt的表達(dá),相反敲低COPB2則能抑制p-Akt的表達(dá);說明COPB2能影響胃癌細(xì)胞中Akt信號活性,但COPB2是如何影響Akt信號活性以及COPB2是否影響其他影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的信號途徑仍有待更多的研究.

4 結(jié)論

總之,就目前結(jié)果而言,COPB2在胃癌中表達(dá)上調(diào),而敲低COPB2表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力;另外,本研究提示,靶向COPB2可能會是胃癌的一個潛在的治療策略.

文章亮點

實驗背景

目前,人們對胃癌的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制并不完全清楚,探索胃癌的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制有助于今后對其診斷和治療開發(fā)新方法.

實驗動機(jī)

外被體蛋白復(fù)合物β2亞基(coatomer protein complex subunit beta 2,COPB2)在乳腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤和結(jié)腸癌等多種腫瘤中高表達(dá),且其可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展.而其在胃癌中表達(dá)和作用并不清楚.

實驗?zāi)繕?biāo)

檢測COPB2在胃癌組織以及胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況,并分析其表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響.

實驗方法

檢測COPB2在人胃癌組織樣本以及胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況.敲低或過表達(dá)胃癌細(xì)胞中COPB2表達(dá)后,檢測胃癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移、侵襲以及Akt信號的改變情況.用腫瘤異體移植模型評估敲低COPB2對體內(nèi)胃癌細(xì)胞生長能力的影響.

實驗結(jié)果

COPB2在人胃癌組織樣本和胃癌細(xì)胞系中高表達(dá).敲低COPB2后,SGC-7901細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移與侵襲以及Akt信號活性均降低;過表達(dá)COPB2后,SGC-7901細(xì)胞的上述指標(biāo)均呈增加.另外,敲低COPB2后,SGC-7901細(xì)胞在體內(nèi)生長減緩.

實驗結(jié)論

COPB2在胃癌中發(fā)揮促癌進(jìn)展作用,而敲低COPB2能抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲.

展望前景

開發(fā)COPB2靶向抑制劑可能會成為研究胃癌治療藥物的一個潛在方向.

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