楊建平 李春君 羅文奇 陳肖瑜 黃冬梅 馬韻 曾麗霞

【摘要】 目的 T1期膀胱尿路上皮癌（urothelial bladder cancer，T1 UBC）的病理腫瘤分級對于患者的預后及治療決策有重要意義，但病理兩級分級系統(tǒng)的診斷可重復性有限，該研究旨在尋找客觀且易于檢測的標志物用于T1 UBC的病理分級。

方法 收集經尿道膀胱腫瘤電切術、病理診斷為膀胱尿路上皮病變共139例，其中非癌性病變24例，T1期的UBC 115例。聯(lián)合檢測一系列以往研究提示在UBC的診斷及預后判斷中常見的且有一定價值但尚存爭議的因子，如腫瘤細胞的核分裂象/核分裂指數（mitotic figure/index，MF/MI）、細胞增殖指數Ki67以及成纖維細胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3），評估它們在T1 UBC的病理分級診斷中的應用價值。

結果 MI、Ki67及FGFR3與T1 UBC的病理診斷和級別有關（P<0.05）。聯(lián)合檢測MI、Ki67及FGFR3多因素診斷模型可以提高T1 UBC病理級別診斷的準確性（AUC=0.906，95% CI：0.838～0.953，P<0.05）。

結論 MI、Ki67及FGFR3蛋白表達是UBC診斷中有意義的指標。聯(lián)合檢測MI、Ki67及FGFR3的多因素診斷模型可以提高T1 UBC的病變級別診斷準確性。

【關鍵詞】 膀胱尿路上皮癌;成纖維細胞生長因子受體3;Ki67;核分裂象

中圖分類號：R737.1 文獻標志碼： DOI：10.3969/j.issn.10031383.2021.06.004

Study on value of combined detection of FGFR3， MI and Ki67 in pathological grading of stage T1 bladder urothelial carcinoma

YANG Jianping， LI Chunjun， LUO Wenqi， CHEN Xiaoyu， HUANG Dongmei， MA Yun， ZENG Lixia▲

（Department of Pathology， Tumor Hospital Affiliated to Guangxi Medical University， Nanning 530021， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective The pathological grading of stage T1 urothelial bladder cancer （T1 UBC） is of great significance for the prognosis and treatment decisionmaking of patients. However， the diagnostic repeatability of the twostage pathologicaclassification system is limited. This study aims to find objective and easy to detect markers for the pathological grading of T1 UBC.

Methods A total of 139 patients with urothelial bladder lesions who diagnosed pathologically after transurethral resection of the bladder tumor （TURBT） were collected， including 24 cases of noncancerous lesions and 115 cases of T1 UBC. A series of previous studies have suggested some common and valuable but controversial factors in the diagnosis and prognosis of UBC， such as mitotic figure/index （MF/MI） of tumor cell， cell proliferation index Ki67， and fibroblast growth factor receptor 3 （FGFR3）， and the value of these factors in the pathological grading diagnosis of T1 UBC was evaluated.

Results MI， Ki67 and FGFR3 were correlated with pathological diagnosis and grade of T1 UBC （P < 0.05）. The combined detection of the MI， Ki67 and FGFR3 in a multivariate diagnostic model could improve the diagnostic accuracy of T1UBC pathological grade （AUC=0.906， 95% CI： 0.838-0.953， P < 0.05）.

Conclusion MI， Ki67 and FGFR3 protein expressions are significant indicators in the diagnosis of UBC. The combined detection of the MI， Ki67 and FGFR3 in a multivariate diagnostic model can improve the diagnostic accuracy of T1 UBC pathological grade.

【Key words】 UBC; FGFR3; Ki67; MF

膀胱尿路上皮癌（urothelial bladder cancer，UBC）是常見的惡性腫瘤，男性多于女性[1]。近年中國的發(fā)病率逐年上升[2]。約75%以上的患者初次診斷為非肌層浸潤性膀胱癌（nonmuscle invasive bladder cancer，NMIBC），其中約20%為T1期的膀胱癌，即腫瘤侵犯固有層尚未侵及固有肌層[3]。病理分級是影響T1 UBC預后和指導治療最重要的指標。目前UBC病理兩級分級系統(tǒng)的診斷可重復性有限[4～6]。因此，急需尋找客觀且易于檢測的標志物用于T1 UBC的病理分級，避免過度或不當的治療。成纖維細胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）基因異常是膀胱尿路上皮癌中常見的遺傳學事件，但目前研究表明FGFR3蛋白表達與UBC的分級及分期仍存在爭議。細胞增殖指數Ki67的過表達與UBC患者不良預后相關[7]。WHO腫瘤分類中提及核分裂象/核分裂指數（mitotic figure/index，MF/MI）與UBC的分級有關，但沒有給出具體的閾值[8]。本研究聯(lián)合檢測FGFR3蛋白表達、細胞增殖指數Ki67和MI，旨在評估它們對T1 UBC病理分級的診斷應用價值。

1 材料與方法

1.1 患者及樣本

收集廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科2016年1月至2017年12月間經尿道膀胱腫瘤電切術后病理診斷為膀胱尿路上皮性病變且臨床送檢切緣均陰性共139例，根據世界衛(wèi)生組織（WHO）2016年的膀胱癌分類，由兩位有豐富泌尿系統(tǒng)疾病診斷經驗的病理醫(yī)生對本研究樣本的組織切片進行回顧性分析。腫瘤的分期遵循the 8th edition of the International Union against Cancer/American Joint Committee on Cancer（UICC/AJCC），T1期膀胱癌指的是腫瘤浸潤到上皮下結締組織。離體標本用10%中性福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋、制成HE切片，光鏡下觀察。

1.2 核分裂象計數及核分裂指數

對139例膀胱尿路上皮性病變組織的HE切片進行光鏡下觀察，選取腫瘤組織中核分裂象（mitotic figure，MF）最活躍的區(qū)域進行計數，至少計數5個高倍視野（400×，0.2376 mm2），取平均值;核分裂指數（mitotic index，MI）是一種定量的核分裂象計數的方法，它將核分裂象的數目與腫瘤組織的面積（mm2）相結合，是指平均1個高倍視野下的核分裂象數目。

1.3 分子標記的免疫組化檢測

FGFR3（鼠抗人單克隆抗體：SC13121）及Ki67（鼠抗人單克隆抗體：MIB1）即用型一抗、SuperVision兩步法即用型免疫組化二抗和DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。采用免疫組化SuperVision兩步法檢測FGFR3及Ki67增殖指數的蛋白表達。存檔蠟塊5 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟和水化后，按試劑盒操作說明書依次完成抗原修復、一抗及二抗孵育，DAB顯色2分鐘，蘇木素復染及封片觀察。

結果判讀：Ki67陽性定位為細胞核著色;選取腫瘤組織中陽性細胞熱點的區(qū)域，至少計數5個高倍視野，得平均Ki67增殖指數（陽性細胞百分率）。FGFR3陽性定位為細胞膜及細胞質著色;結合每個樣本的陽性細胞百分率和染色強度綜合評分，（1）陽性細胞百分率：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。（2）陽性細胞染色強度：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項乘積作為表達強度的總分：0分為陰性（0），1～4分為弱陽性（1+），5～8分為中等陽性（2+），9～12分為強陽性（3+）。

1.4 統(tǒng)計學方法

計量資料采用t檢驗或方差分析。分類資料采用卡方檢驗。等級資料組間比較采用秩和檢驗。運用二元logistic回歸分析，構建MI、Ki67增殖指數及FGFR3三者聯(lián)合的T1 UBC病理級別診斷模型。所有上述統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0軟件進行。使用MedCalc V15.8軟件繪制受試者工作特性曲線（ROC曲線），計算單個腫瘤標志物和聯(lián)合診斷模型的ROC曲線下面積（AUC）、約登指數、靈敏度以及特異度，并對AUCs進行Z檢驗比較。檢驗水準：α= 0.05，雙側檢驗。

2 果

2.1 患者的特征

139例研究對象中，非癌性病變24例，包括17例良性病變（6例增生性/腺性膀胱炎、4例黏膜慢性炎、1例乳頭狀瘤、6例內翻性乳頭狀瘤）及7例低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤（papillary urothelial neoplasms of low malignant potential，PUNLMP）。T1 UBC 115例（42例低級別、73例高級別）。T1 UBC患者中男性102例，女性13例，男女比例為7.85∶1，中位年齡61歲。乳頭狀生長方式72例，非乳頭狀生長方式43例。病變個數>3的有74例，≤3的有41例。病變直徑≥3 cm的有66例，<3 cm的有49例。

2.2 FGFR3及細胞增殖標記與膀胱尿路上皮病變性質的關系

139例膀胱尿路上皮病變中，FGFR3、Ki67、MI與病變的性質有關（P<0.05）。在膀胱良性病變、PUNLMP、低級別UBC和高級別UBC各組中FGFR3蛋白的陽性率依次為23.53%，71.43%，80.95%及56.16%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）;在非良性病變中，FGFR3在PUNLMP以及低級別UBC中表達率較高。Ki67增殖指數及MI與病變程度呈正相關（r=0.749，r=0.685）;從良性病變、PUNLMP到低級別癌，Ki67及MI逐步增高。見表1。

2.3 FGFR3及細胞增殖標記與T1 UBC病理級別的關系

115例T1 UBC中，FGFR3在低級別T1 UBC的陽性表達率（80.95%）高于高級別（56.16%），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。高級別T1 UBC的Ki67及MI的分布高于低級別，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。而年齡、性別、病變個數及大小、乳頭狀生長方式與T1 UBC病理分級無關（P>0.05）。見表2。

2.4 聯(lián)合診斷模型在T1 UBC病理級別中的診斷效能

單因素分析結果顯示MI、Ki67、FGFR3與T1 UBC病理級別相關，將影響T1 UBC病理分級診斷的這三個參數賦值（表3）并納入多因素logistic回歸分析（表4），建立MI、Ki67及FGFR3三個指標的聯(lián)合診斷模型。圖1繪制了MI、Ki67及FGFG3單獨以及三者聯(lián)合在TI UBC病理學級別診斷的ROC曲線。聯(lián)合診斷模型AUC值（0.906）比Ki67、MI、FGFR3單獨檢測的AUC值（分別為0.862，0.818，0.695）高。通過Z檢驗，比較了聯(lián)合診斷模型和單獨檢測各標記的AUCs。在TI UBC中，與MI、Ki67及FGFR3三者聯(lián)合檢測相比，MI、Ki67和FGFR3的Z值分別為9.682、8.123和3.937（P均<0.001），表明在TI UBC中聯(lián)合檢測與單個標記檢測AUCs有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。此外，我們發(fā)現在診斷T1 UBC病理級別ROC中，MI的最佳閾值為2/HPF（視野面積：0.2376 mm2），即當MI>2時被診斷為高級別，MI≤2時被診斷為低級別;Ki67最佳閾值為20%，即當Ki67>20%時被診斷為高級別，Ki67≤20%時被診斷為低級別。綜上所述，聯(lián)合MI、Ki67增殖指數及FGFR3診斷模型可以更好地診斷T1 UBC病理學級別（表5，圖1）。

3 論膀胱癌患者的治療是基于疾病的分期和分級，復發(fā)和進展的風險往往通過UBC的腫瘤分級來衡量，因此準確的分級對T1 UBC患者獲得更好的治療決策和預后至關重要。在病理診斷中需要把組織結構和細胞的異型性，包括細胞的密度、極向，細胞核的大小、形態(tài)、染色質、核仁及核分裂象等各種形態(tài)學要素綜合考慮以得出正確的UBC分級診斷，但在實際工作中診斷可重復性不高。目前缺乏理想而客觀的標志物用于UBC的病理分級。本研究聯(lián)合檢測一系列以往研究提示在UBC的診斷及預后判斷中常見的且有一定價值，但尚存爭議的因子，旨在評估它們在T1 UBC的病理分級中的應用價值。

FGFR3屬于酪氨酸激酶受體家族（FGFR14）成員之一，在多發(fā)性骨髓瘤、宮頸癌、肺癌、腦膜瘤以及乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)現了FGFR3基因異常，尤其以膀胱癌多見。FGFR突變存在于70%以上的低級別、非浸潤性膀胱癌中，與較高的復發(fā)率相關，且是具有良好預后的膀胱癌亞組的特征[9]。大多數研究報道FGFR3蛋白表達與腫瘤分期、分級有顯著的相關性[10～13]。然而國內學者對84例膀胱癌患者進行FGFR3與臨床病理參數比較中并未發(fā)現差異[14]。本研究我們發(fā)現在T1 UBC中低級別和高級別FGFR3蛋白的陽性率分別為80.95%及56.16%，FGFR3蛋白表達與較低的UBC級別密切相關，與AKANKSHA等人[15]報道的FGFR3在NMIBC低級別（82.60%）及高級別（66.70%）表達結果類似。此外，除了低級別T1 UBC，我們還發(fā)現FGFR3在低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤高表達（71.43%），與BARBISAN等人[16]的研究報道一致?；蛲蛔儭⑷诤弦约癋GFR3的過表達可能是其致瘤作用的主要機制。研究表明FGFR3過度表達可導致MAPK和AKT信號通路的上調，導致癌細胞生長和轉移[17]。關于FGFR3過表達引起膀胱癌變的機制仍需要進一步的研究證實。我們的實驗結果顯示FGFR3主要在PUNLMP以及低級別T1 UBC中表達，提示FGFR3可能是低級別非浸潤性尿路上皮癌變過程中的重要事件。

在腫瘤中，MF的數量與類型是區(qū)別良、惡性和提示惡性程度及預后十分有效的指標[18]。一項310例膀胱腫瘤的多中心研究利用增殖和定量標記對Ta～T1期尿路上皮癌進行客觀分級，發(fā)現核大小和核分裂象這兩個可量化指標與NMIBC的級別和進展相關[19]。2016 WHO分類中提及MF與UBC的分級有關，但沒有推薦的閾值。研究表明用面積校正的核分裂指數（mitotic figure/volume，M/V）是UBC的獨立預后信息，M/V閾值為10/mm2[20]。本研究中采用的MI是一種類似于用M/V指數定量分析核分裂象數目的方法，它將核分裂象的數目與腫瘤組織的面積（mm2）相結合。在本研究中，我們發(fā)現MI與病變惡性程度以及T1 UBC的病理分級有關，MI的最佳閾值為2/HPF（視野面積：0.2376 mm2）接近10/mm2。作為組織形態(tài)學參數，MI的計數可操作性強，診斷重復性好，利于UBC個體化診療的精準評判。

Ki67是一種核蛋白，在除G0以外細胞周期的所有階段中高表達，使得Ki67被廣泛用作人類腫瘤細胞的增殖標志物[21]。研究表明，高的Ki67增殖指數作為細胞周期活性重要標記與UBC的復發(fā)和進展密切相關[22]。陳倩倩等[23]研究了Ki67在T1期非肌層浸潤性膀胱癌中的表達，與腫瘤分級具有相關性，但與復發(fā)無相關性。在本研究中，我們發(fā)現Ki67增殖指數與膀胱尿路上皮病變惡性程度以及T1 UBC的病理分級有關。目前Ki67過表達的閾值在UBC研究中差異很大，過表達閾值從5%到25%不等[24]，可能與樣本及檢測方法的選擇不同有關。本研究在診斷T1 UBC病理級別時，Ki67最佳閾值為20%，是診斷膀胱癌病理級別的有效指標。

目前關于聯(lián)合各分子/標記的UBC病理分級診斷模型研究較少。VAN RHIJN等人[25]對286例原發(fā)性UCC患者應用測序方法檢測FGFR3的基因突變，并用免疫組化檢測MIB1、P53和P27的表達水平，分別用分子分型、臨床病理形態(tài)學分級評估UCC的復發(fā)率和病變進展程度，并比較同一系列患者病理分級和分子分型的一致性，發(fā)現FGFR3突變以及Ki67、P53和P27分子分型系統(tǒng)與病理分級相比可以更準確地評估UCC患者的預后，比傳統(tǒng)的臨床病理學評估具有更高的重復性。BOSSCHIETER等人[19]利用細胞增殖標志物分析BC分級診斷價值，發(fā)現聯(lián)合MNA10和MAI對于高級別腫瘤的AUC為0.92，敏感性為92%，特異性為76%。本研究聯(lián)合檢測FGFR3、MI及Ki67，構建T1 UBC病理分級的診斷模型，AUC為0.906，敏感性為78.08%，特異性為95.24%。結果表明，聯(lián)合多變量（MI、Ki67及FGFR3）診斷模型可以提高T1 UBC級別診斷的準確性。

本研究結果提示MI、Ki67增殖指數及FGFR3蛋白表達是UBC診斷中有意義的指標。聯(lián)合檢測MI、Ki67及FGFR3的多因素診斷模型可以提高T1 UBC的病變級別診斷準確性。MI及Ki67增殖指數作為組織形態(tài)學和細胞增殖的重要標記，對其計數可操作性強，診斷重復性好，是現行的UBC病理分級和預后風險評估有意義的參數。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-01-20 修回日期：2021-04-25）

（編輯：潘明志）