張慶軍，王輝，張健，張苗苗，毛雯，吳迪

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是脂代謝紊亂性血管疾病，AS常引起心肌梗死、冠心病、腦卒中等一系列致命疾病，嚴(yán)重威脅人們生命健康[1]。研究表明，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是AS進(jìn)展的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素，可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，加速AS斑塊形成，促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展[2]。因此，探討ox-LDL誘導(dǎo)的AS潛在機(jī)制具有重要意義。環(huán)狀RNA（circRNA）是由前體mRNA反向剪切形成的具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子，研究指出circRNA通過(guò)與miRNA相互作用參與AS進(jìn)程。如敲減circRNA脫氫膽固醇還原酶基因-24（DHCR24）通過(guò)上調(diào)miR-149-5p表達(dá)可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換，從而防止血管再狹窄[3]。circNT5E是一種膠質(zhì)瘤致癌性circRNA，其高表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著的促增殖、促遷移侵襲作用[4]。然而，circNT5E是否影響血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲未見報(bào)道。miR-377-3p是一種AS相關(guān)性miRNA，研究指出動(dòng)脈粥硬化小鼠模型中miR-377-3p表達(dá)降低，恢復(fù)其表達(dá)能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[5]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示miR-377-3p是circNT5E的靶基因。circNT5E是否靶向miR-377-3p參與血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲尚未可知。本研究分析了circNT5E、miR-377-3p在ox-LDL誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMCs）增殖、遷移、侵襲中的作用，旨在揭示AS進(jìn)展的潛在機(jī)制，為AS提供有價(jià)值的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料HASMCs購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；Lipofectamine 2000、Superscrpt Ⅱ試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Green mix購(gòu)于中國(guó)大連Takara公司；miRNA模擬物（mimics）、miRNA抑制物（anti-miRNA）、小干擾RNA（si-RNA）、過(guò)表達(dá)載體（pcDNA-RNA）、雙熒光素酶報(bào)告載體（WT-circNT5E、MUT-circNT5E）購(gòu)于上海生工生物工程公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購(gòu)于上海弗元生物公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒武漢博士德生物工程公司；羊抗兔IgG二抗、兔源Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、MMP-9單克隆抗體購(gòu)于上海艾博抗公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、模型構(gòu)建采用DMEM培養(yǎng)基在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HASMCs，每隔24 h換液一次，每48 h傳代一次。采用50 μg/ml的ox-LDL處理HASMCs 24 h制備細(xì)胞模型[6]。

1.2.2 轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組取2×105個(gè)HASMCs接種6孔板，利用Lipofectamine 2000將si-circNT5E、si-NC、miR-NC、miR-377-3p mimics、sicircNT5E+anti-miR-NC、si-circNT5E+ anti-miR-377-3p分別轉(zhuǎn)染60%融合細(xì)胞，收獲轉(zhuǎn)染48 h。用含50 μg/ml的ox-LDL培養(yǎng)液孵育上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h，ox-LDL組、ox-LDL+si-NC組、ox-LDL+sicircNT5E組、ox-LDL+miR-NC組、ox-LDL+miR-377-3p組、ox-LDL+si-circNT5E+anti-miR-NC組、ox-LDL+si-circNT5E+anti-miR-377-3p組。正常培養(yǎng)的細(xì)胞記為對(duì)照（Con）組。模型細(xì)胞記為ox-LDL組。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)circNT5E和miR-377-3p表達(dá)收集不同組細(xì)胞，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。使用Superscrpt II試劑盒將3 μg的RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用SYBR Green mix在ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR。2-ΔΔCt法分析circNT5E和miR-377-3p表達(dá)量。circNT5E上游引物序列5’-AGATAAGCTCTTTGG TCGGA-3’，下游引物序列5’-CGAATGTCCCA GTGCAATAA-3’；GAPDH上游引物序列5’-T GTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’，下游引物序列5’-ATG GCATGGACTGTGGTCAT-3’；miR-377-3p上游引物序列5’-ATCACACAAAGGCAACTTTTG T-3’，下游引物序列5’-GGTGCAGGGTCCGAG GTAT-3’；U6上游引物序列5’-CTCGCTTCGG CAGCACA-3’，下游引物序列5’-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3’。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力將各組HASMCs（5×103個(gè)/孔）接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后每孔加入CCK-8溶液（10 μl/well），再孵育3 h后，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲向24孔板中加入600 μl含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入Transwell小室。向上室內(nèi)加入200 μl細(xì)胞懸液（無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，細(xì)胞數(shù)約4×104）。37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，除去上腔室中的細(xì)胞。0.4%多聚甲醛固定10 min。用600 μL結(jié)晶紫室溫染色15 min。最后Transwell小室置于倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)，以平均值表示遷移細(xì)胞數(shù)量。為了進(jìn)行細(xì)胞侵襲測(cè)定，將100 μg/ml的Matrigel均勻包被Transwell小室膜，其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)放射免疫沉淀緩沖液在冰上裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量（50 μg）蛋白，利用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜封閉后，用一抗溶液室溫孵育膜2 h，再用二抗溶液室溫孵育膜1 h。最后加入化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色。ImageJ軟件檢測(cè)蛋白條帶、內(nèi)參GAPDH條帶灰度值，以二者比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)使用StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)circNT5E的潛在結(jié)合位點(diǎn)。將HASMCs（1×105個(gè)/孔）接種24孔板，用Lipofectamine 2000將WT-circNT5E、MUT-circNT5E分別與miR-377-3p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染HASMCs。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定相對(duì)熒光素酶活性。同時(shí)分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circNT5E、si-NC、si-circNT5E至HASMCs，采用RT-qPCR計(jì)數(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后miR-377-3p表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每次3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較多組間差異，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circNT5E和miR-377-3p在ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)與Con組比較，ox-LDL組HASMCs中circNT5E表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而miR-377-3p表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）（表1）。

表1 circNT5E和miR-377-3p在ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)（n=9）

2.2 干擾circNT5E表達(dá)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響與Con組比較，ox-LDL組HASMCs中circNT5E表達(dá)量、細(xì)胞活力、Ki-67蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與ox-LDL+si-NC組比較，ox-LDL+si-circNT5E組HASMCs中circNT5E表達(dá)量、細(xì)胞活力、Ki-67蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）（表2，圖1）。

表2 干擾circNT5E表達(dá)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響（n=9）

圖1 不同組Ki-67蛋白表達(dá)

2.3 干擾circNT5E表達(dá)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移和侵襲的影響與Con組比較，ox-LDL組HASMCs遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與ox-LDL+si-NC組比較，ox-LDL+si-circNT5E組HASMCs遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）（表3，圖2）。

表3 干擾circNT5E表達(dá)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移和侵襲的影響（n=9）

圖2 各組遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 circNT5E靶向調(diào)控miR-377-3p的表達(dá)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具StarBase在線分析顯示，miR-377-3p與circNT5E序列間存在特異結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-377-3p mimics能夠顯著降低HASMCs中WT-circNT5E的相對(duì)熒光素酶活性（P＜0.05），而對(duì)MUT-circNT5E的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)顯著影響（表4）。pcDNA-circNT5E組HASMCs中miR-377-3p表達(dá)量與pcDNA組比較顯著降低（P＜0.05）；而si-circNT5E組HASMCs中miR-377-3p表達(dá)量與si-NC組比較顯著升高（P＜0.05）（表5）。

圖3 circNT5E的序列中含有與miR-377-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（n=9）

表5 circNT5E調(diào)控miR-377-3p的表達(dá)（n=9）

2.5 miR-377-3p過(guò)表達(dá)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響與ox-LDL+miR-NC組比較，ox-LDL+miR-377-3p組HASMCs中miR-377-3p表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）（表6，圖4）。

圖4 不同組增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 miR-377-3p過(guò)表達(dá)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（n=9）

2.6 抑制miR-377-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circNT5E表達(dá)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用與ox-LDL+si-circNT5E+anti-miR-NC組比較，ox-LDL+si-circNT5E+anti-miR-377-3p組HASMCs中miR-377-3p表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）（表7，圖5）。

圖5 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表7 干擾miR-377-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circNT5E表達(dá)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用（n=9）

3 討論

AS是臨床常見的心血管疾病，但發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，且尚無(wú)特效治療藥物。越來(lái)越多證據(jù)表明，circRNA在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并在調(diào)節(jié)多種生物學(xué)和病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，異常表達(dá)的circRNA已被確認(rèn)是AS斑塊形成的作用因素[7]。如circRNA 0044073在AS中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)HASMCs和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[8]。circ_0029589在ox-LDL誘導(dǎo)的HASMCs中表達(dá)上調(diào)，其下調(diào)通過(guò)調(diào)控miR-424-5p/IGF2軸抑制HASMCs增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。因此，circRNA在AS中具有潛在治療價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導(dǎo)后HASMCs中circNT5E表達(dá)量顯著增加，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增加，說(shuō)明circNT5E表達(dá)上調(diào)可能與HASMCs的異常生物學(xué)行為有關(guān)。此外，研究顯示干擾circNT5E表達(dá)可能通過(guò)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HASMCs增殖、遷移和侵襲進(jìn)而抑制AS進(jìn)程。類似地，Dong等[10]證實(shí)敲減circNT5E表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移具有抑制作用。Ki-67被廣泛用于細(xì)胞增殖標(biāo)記物[11]。研究表明MMP家族可破壞細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，MMP2和MMP9是最常見的腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志物[12]。本研究顯示，干擾circNT5E表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)ox-LDL處理對(duì)HASMCs中Ki-67、MMP2和MMP9表達(dá)的促進(jìn)作用，與干擾circNT5E的抗增殖、抗遷移侵襲作用一致。以上研究表明干擾circNT5E表達(dá)可能是一種潛在的AS治療策略。

miR-377-3p是一種抑癌因子，研究指出神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胃癌中miR-377-3p表達(dá)降低促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[13,14]。在宮頸癌中，Circ_0000388過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)miR-337-3p表達(dá)并增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[15]。此外，Circ_0000284通過(guò)調(diào)控miR-377-3p表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導(dǎo)的HASMCs中miR-377-3p表達(dá)顯著降低，circNT5E與miR-377-3p序列直接結(jié)合，且circNT5E對(duì)miR-377-3p表達(dá)具有顯著的負(fù)調(diào)控作用，說(shuō)明circNT5E可能靶向miR-377-3p參與對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HASMCs增殖和凋亡的調(diào)控。進(jìn)一步驗(yàn)證miR-377-3p功能顯示，過(guò)表達(dá)miR-377-3p顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HASMCs增殖、遷移和侵襲，抑制Ki-67、MMP2和MMP9表達(dá)，與前人研究結(jié)論基本吻合。類似地，Tang[17]、Zhang等[18]研究證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-377-3p對(duì)卵巢癌、宮頸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移具有抑制作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-377-3p表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)干擾circNT5E表達(dá)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HASMCs增殖、遷移和侵襲以及Ki-67、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的影響，這間接說(shuō)明circNT5E靶向miR-377-3p參與調(diào)控ox-LDL誘導(dǎo)的HASMCs增殖、遷移和侵襲。

本研究表明干擾circNT5E通過(guò)上調(diào)miR-377-3p表達(dá)可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，對(duì)AS進(jìn)展具有潛在抑制作用。circNT5E/miR-377-3p分子軸可作為AS的潛在治療靶點(diǎn)。