琚可可， 王如月， 朱奇彪

(1.杭州笑哈哈生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，浙江 杭州 311107； 2.浙江農(nóng)藝師學(xué)院，浙江 杭州 310021；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)村發(fā)展研究所，浙江 杭州 310021)

鐵皮石斛是傳統(tǒng)名貴中藥材，其清補(bǔ)滋養(yǎng)的功效得到歷代名家的肯定。近30 a的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，在全國范圍內(nèi)形成以浙江省為中心的鐵皮石斛培育加工產(chǎn)業(yè)鏈，年產(chǎn)值超百億的龐大產(chǎn)業(yè)規(guī)模。鐵皮石斛滋陰清潤強(qiáng)免疫力的確切功效得到消費(fèi)市場(chǎng)的廣泛認(rèn)可，巨量的消費(fèi)需求，拉動(dòng)了產(chǎn)業(yè)鏈各環(huán)節(jié)的蓬勃發(fā)展，鐵皮石斛下游企業(yè)加工量的急劇增加帶動(dòng)上游藥材原料種植規(guī)?？焖贁U(kuò)張。浙江的鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化起步早，投入大，市場(chǎng)發(fā)育成熟，政府大力扶持引導(dǎo)加行業(yè)協(xié)會(huì)的規(guī)范自律，使浙江省在鐵皮石斛行業(yè)內(nèi)積累了顯著優(yōu)勢(shì)，占全國產(chǎn)業(yè)鏈70%以上的權(quán)重。特別是近10 a，鐵皮石斛單一品種的產(chǎn)業(yè)規(guī)模一舉超越傳統(tǒng)的“浙八味”，雄踞浙江中藥材產(chǎn)值榜首。

鐵皮石斛屬多年生作物，種苗一次投放可多年采收。2013—2014年，種苗需求由新增種植的增量市場(chǎng)轉(zhuǎn)入原有種植基地部分替換更新種苗的存量市場(chǎng)，種苗需求量表現(xiàn)為斷崖式下降探底再緩慢回升狀態(tài)。種植戶收益被壓縮后，對(duì)種苗價(jià)格的接受能力也顯著降低，種苗出廠單價(jià)塌落至高峰時(shí)期的1/5。鐵皮石斛組培育苗[1-3]作為勞動(dòng)密集型行業(yè)，因勞動(dòng)力成本急劇上升和頻繁遭遇用工緊缺，進(jìn)一步壓縮了育苗企業(yè)的利潤空間，多因素累加使行業(yè)內(nèi)育苗工廠陷入嚴(yán)峻境地。提升育苗效率、縮短培養(yǎng)周期、減少勞動(dòng)力消耗、降低單位苗產(chǎn)量的能源消耗及培養(yǎng)庫容和資本占用及大幅壓縮種苗生產(chǎn)成本是眼下鐵皮石斛育苗的急迫需求?；谝陨闲枨螅_展了鐵皮石斛無菌懸浮培養(yǎng)育苗工藝開發(fā)測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 材料

開發(fā)試驗(yàn)種源材料取自杭州余杭區(qū)鐵皮石斛種植基地。選取雁蕩山紅桿品系的鐵皮石斛4 a生植株為親本，采用人工授粉生成果莢，成熟后取蒴果內(nèi)種子進(jìn)行無菌育苗擴(kuò)繁。

1.2 方法

1.2.1 人工授粉育種源

于5月下旬盛花期，選取健壯鐵皮石斛4 a生盆栽植株，分別標(biāo)記為母本組和父本組。母本組植株上選取營養(yǎng)供應(yīng)旺盛的花朵，用接種針去雄，眼科鑷夾去唇瓣，其他花朵和花苞全摘去。父本組植株上選優(yōu)勢(shì)花朵，用接種針剝?nèi)ニ幟保┞痘ㄋ?，用接種針尖挑起花藥送入母本組植株已處理花朵的蕊柱腔內(nèi)黏液區(qū)，黏住花藥即可。完成授粉后的母本植株單獨(dú)隔離培養(yǎng)，以免沾染其他花藥引起串種。以此方法分別完成同花授粉、同株異花授粉、同品種異花授粉、不同居群異花授粉4組樣本的人工授粉。授粉次日即可見花瓣開始凋萎，5日后可觀察到子房膨大，完成坐果。

1.2.2 取種及預(yù)處理

授粉后150 d，蒴果發(fā)育成熟，摘取飽滿果莢，于正壓無菌層流罩下做蒴果整體無菌化處理。用純凈水清洗果莢后，采用吐溫-80和脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉(AES)稀釋液分別振蕩浸泡3 min完成表面浸潤。完成表皮浸潤的蒴果分別轉(zhuǎn)入2%次氯酸鈉、0.5%高錳酸鉀、0.5%升汞、70%乙醇溶液中振蕩浸泡10 min，之后用無菌水清洗去除果莢表面殘留殺菌劑。處理后果莢置于無菌培養(yǎng)皿中。后續(xù)測(cè)試中比較2種表面活性劑以及4種殺菌劑用于蒴果無菌處理的效果。

1.2.3 種子提取及懸浮液制備

在嚴(yán)格的無菌操作環(huán)境中，用解剖鑷剝開果莢，將果莢內(nèi)含粉狀種胚撒入預(yù)裝有80 mL無菌水的玻璃錐瓶內(nèi)，密封錐瓶后，置于搖床上振蕩，使粉末狀種胚從營養(yǎng)支撐纖維上脫落，分散于無菌水中，同時(shí)成團(tuán)種胚受晃動(dòng)水力沖擊，分散成均勻懸液。

(1)2000年運(yùn)營指南中學(xué)習(xí)工具的領(lǐng)域名稱以“計(jì)算機(jī)”為主，2005年使用了“信息”一詞，更加強(qiáng)調(diào)信息技術(shù)教育代替計(jì)算機(jī)運(yùn)營技術(shù)的優(yōu)勢(shì)；2015年，用“信息文化”一詞來凸顯信息通信技術(shù)教育的內(nèi)涵——從信息的特點(diǎn)延伸到信息道德，體現(xiàn)了人類文明逐漸發(fā)展的形態(tài)。

1.2.4 懸浮培養(yǎng)

在5升容量的玻璃發(fā)酵罐內(nèi)，灌注2 L的N6全配方無菌培養(yǎng)液[4]，pH 5.8，控制培養(yǎng)液溫度25±2 ℃。在正壓層流罩保護(hù)下，用無菌注射器抽取前述錐瓶內(nèi)制備的無菌種胚懸液注入發(fā)酵罐內(nèi)，完成發(fā)酵罐接種。將發(fā)酵罐本體整體移入光照培養(yǎng)箱內(nèi)，箱內(nèi)分別用色溫4 500 K和6 300 K白光，采用12和24 h不同時(shí)長照明[5]，光照度800 lx，測(cè)試光照色溫和時(shí)長對(duì)種胚球莖發(fā)育的影響。開啟罐內(nèi)空氣循環(huán)和罐底電磁攪拌。連續(xù)培養(yǎng)20 d后，罐底取樣口加裝無菌微孔過濾器，負(fù)壓抽排出N6培養(yǎng)液，截留培養(yǎng)物種胚球莖于發(fā)酵罐內(nèi)。通過補(bǔ)料口注入滅菌后制備的B5+NAA 0.3 mg·mL-1培養(yǎng)液3 L，進(jìn)入懸浮增殖培養(yǎng)，此階段培養(yǎng)過程中，需每2 d通過換氣閥注入過濾除菌后的無菌空氣進(jìn)行培養(yǎng)罐內(nèi)氣體更換。持續(xù)培養(yǎng)20 d后，罐體內(nèi)懸浮液呈現(xiàn)整體淺綠色，經(jīng)過增殖后的種胚球莖充滿培養(yǎng)液。其間取樣，將培養(yǎng)液滴注于96孔板內(nèi)，解剖鏡下清點(diǎn)計(jì)數(shù)培養(yǎng)液含種胚球莖微粒密度和單體直徑。種胚球莖密度超過200粒·mL-1后，用于下階段固態(tài)培養(yǎng)基上無菌播種。

1.2.5 種胚球莖無菌播種

參照文獻(xiàn)[6]。以1/2B5+1/3 MS+5%椰子胚乳提取液+3.2%蔗糖+4.5‰瓊脂制備增殖分化培養(yǎng)基，調(diào)整pH值為5.8，分裝培養(yǎng)瓶后經(jīng)過121 ℃蒸汽保溫保壓15 min滅菌，冷卻固結(jié)后即可進(jìn)行種胚球莖播種。在發(fā)酵罐內(nèi)導(dǎo)入過濾無菌空氣，維持罐內(nèi)微正壓，開啟發(fā)酵罐磁力攪拌保持培養(yǎng)懸浮液均質(zhì)狀態(tài)，在嚴(yán)格無菌操作環(huán)境中，通過取樣口連接醫(yī)用輸液膠管，向每個(gè)培養(yǎng)瓶注入1 mL種胚球莖懸浮液，用微孔濾膜透氣蓋封口后，搖勻使種胚球莖細(xì)微顆粒均勻分散平鋪于培養(yǎng)基表面。

1.2.6 球莖增殖分化及種苗建株培養(yǎng)

完成種胚球莖無菌播種的培養(yǎng)瓶，靜置于光照培養(yǎng)架上，保持培養(yǎng)溫度25±2 ℃，不間斷給予800～1 000 lx照度6 300 K色溫頂照光[7]，促使播種后的種胚球莖完成增殖擴(kuò)增后快速建立極性，10～15 d即可觀察到種胚球莖數(shù)量呈5～8倍的增長，并建立極性，頂端顏色加深，萌發(fā)芽尖端，球莖底部接觸培養(yǎng)基側(cè)膨大，萌發(fā)根原基。繼續(xù)靜置培養(yǎng)40 d，可獲得苗高10～15 mm、直立向上、一致性優(yōu)良、根系交叉少、密度分布均勻的鐵皮石斛無菌原種苗。

1.2.7 生根和壯苗培養(yǎng)

將上一步驟獲得的原種苗，換瓶接種至2/3 MS+7%香蕉提取液+3.5%蔗糖+4.2‰瓊脂的生根壯苗培養(yǎng)基中，于人工光照下培養(yǎng)至苗高40±5 mm后，整批次移瓶至控溫日光溫室中繼續(xù)培養(yǎng)[8]，使石斛苗適應(yīng)自然光譜和光周期。待苗長至60～80 mm高、莖稈直徑3 mm以上、單苗3條以上根、根長30 mm以上、頂部兩葉片V形張且葉色加深時(shí)，即可用于商品苗出售或溫室馴化煉苗種植。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工授粉環(huán)節(jié)親本選取對(duì)育苗全過程的影響

表1 不同授粉方式對(duì)育苗過程及幼苗質(zhì)量的影響

2.2 不同方法取種預(yù)處理方法的選擇及效果評(píng)估

測(cè)試比較2種浸潤劑和4種殺菌劑浸泡處理蒴果后，培養(yǎng)過程中的菌類污染情況，統(tǒng)計(jì)增殖分化階段有害菌感染表現(xiàn)情況。由表2可知，在蒴果無菌處理環(huán)節(jié)，采用吐溫-80預(yù)浸潤+0.5%氯化汞浸泡可獲得可靠的無菌種胚。

表2 不同殺菌劑的效果評(píng)估

2.3 發(fā)酵罐懸浮階段培養(yǎng)

培養(yǎng)罐無菌空氣持續(xù)導(dǎo)入有利于種胚球莖增殖及細(xì)胞分化能力獲得。懸浮培養(yǎng)全程保持罐底120 r·min-1磁力攪拌是維持種胚細(xì)胞團(tuán)在培養(yǎng)液內(nèi)均勻懸浮分布的必要條件。4 500 K暖白光和6 300 K正白光2種色溫的光照對(duì)于種胚球莖的擴(kuò)增影響差異不顯著。

表3 不同光照時(shí)長對(duì)鐵皮石斛種胚懸浮培養(yǎng)的效果

由表3可知，懸浮培養(yǎng)階段，24 h不間斷光照能顯著縮短種子轉(zhuǎn)綠時(shí)間，加快種胚細(xì)胞團(tuán)增殖，所得種胚包含細(xì)胞數(shù)量多，營養(yǎng)積累量大，發(fā)育程度好，有利于后期更快進(jìn)入分化建株，縮短整體育苗時(shí)間。

球莖播種入瓶后的分化培養(yǎng)階段，6 300 K的高色溫的光照能促進(jìn)種胚發(fā)育進(jìn)入分化建株。垂直于培養(yǎng)基表面800～1 000 lx的不間斷頂照光是促進(jìn)球莖發(fā)育，獲得整齊一致分化苗的重要條件。

2.4 百萬苗批量中試實(shí)測(cè)各細(xì)分階段指標(biāo)對(duì)比分析

新開發(fā)工藝相對(duì)于傳統(tǒng)玻璃瓶固體培養(yǎng)基工藝，在每百萬苗批次鐵皮石斛無菌育苗中試生產(chǎn)中，各細(xì)分階段生產(chǎn)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 新工藝和傳統(tǒng)工藝各細(xì)分階段分析

由表4可知，新開發(fā)工藝在初始階段引入發(fā)酵罐進(jìn)行懸浮培養(yǎng)擴(kuò)增種胚球莖，以及由此衍生出前后段配套改進(jìn)，從全程培養(yǎng)時(shí)間縮短、擴(kuò)增倍數(shù)大、庫容占用減少、接種用工量減少、降低育苗能耗、換瓶操作種苗損傷小、種苗一致性好等方面優(yōu)于傳統(tǒng)玻璃培養(yǎng)瓶固體培養(yǎng)基上起始播種流程。

3 小結(jié)與討論

本次鐵皮石斛無菌懸浮培養(yǎng)育苗工藝開發(fā)過程，經(jīng)過4個(gè)鐵皮石斛育苗季中試規(guī)模育苗生產(chǎn)實(shí)踐檢驗(yàn)和逐步完善，初步具備實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。新工藝借助發(fā)酵罐內(nèi)懸浮培養(yǎng)，初期種胚萌動(dòng)及增殖過程中培養(yǎng)物全程浸泡于全營養(yǎng)配比的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)物得到營養(yǎng)的飽和供給，且代謝廢物能及時(shí)排出至培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過程中實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液的無菌更換，避免自身代謝廢物積累毒害導(dǎo)致生長抑制；分化建株培養(yǎng)時(shí)球莖懸浮液滴加分瓶播種的方法革新，替代了傳統(tǒng)工藝接種鏟挖取后平鋪球莖顆粒的操作，播種后的種胚球莖無須經(jīng)歷損傷修復(fù)休眠期即可進(jìn)入芽萌發(fā)階段，實(shí)現(xiàn)種胚在培養(yǎng)過程中生長的連續(xù)性。140～180 d的全程育苗時(shí)間是傳統(tǒng)工藝的一半時(shí)長，10月鐵皮石斛蒴果成熟取種，經(jīng)過5～6個(gè)月的培育成苗過程，商品苗批量出瓶高峰在次年第二季度，正好是浙閩贛一帶行業(yè)集中產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛苗定植最佳季節(jié)，相比較傳統(tǒng)工藝于次年秋季到來的出苗高峰，新開發(fā)育苗工藝更好的銜接了種植用苗需求，使大田種植石斛苗有充足時(shí)間經(jīng)歷當(dāng)年暖季的生長期，完成適應(yīng)種植環(huán)境的生理過度，提升第一個(gè)越冬季植株抗凍能力，解決了瓶苗脫瓶煉苗種植初期嚴(yán)重的低溫凍害難題，降低種植保溫設(shè)施要求和養(yǎng)護(hù)成本，由此可縮短近一年的種植時(shí)間，種植戶提前可產(chǎn)出鐵皮石斛成品藥材。

新開發(fā)工藝實(shí)現(xiàn)了育苗培養(yǎng)初期培養(yǎng)條件的均一可控，種胚球莖發(fā)育一致性好，結(jié)合培養(yǎng)基成分的調(diào)控，刪減人工換瓶操作次數(shù)，種苗發(fā)育過程中受到的轉(zhuǎn)接損傷少，有效改善了轉(zhuǎn)接過程苗損傷導(dǎo)致的頂芽休眠誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)造成商品苗規(guī)格參差不齊，顯著提升商品苗的品質(zhì)。

在生產(chǎn)過程中，新開發(fā)工藝種苗萌發(fā)一致，換瓶接種操作時(shí)避免了必須在無菌操作條件下繁瑣的規(guī)格分選過程，轉(zhuǎn)接效率得以提高，單位產(chǎn)苗的用工量降低。操作的簡化，附加帶來轉(zhuǎn)接污染率的減低，也降低了生產(chǎn)線操作員工的培訓(xùn)難度。育苗周期的壓縮，降低了組培育苗工廠光照及控溫能耗，同時(shí)使育苗工廠能在夏季到來前基本騰空鐵皮石斛瓶苗對(duì)恒溫光照培養(yǎng)室?guī)烊菡加?，釋放的生產(chǎn)能力可快速轉(zhuǎn)移至草莓、小薯、菊花等秋冬季種植作物脫毒苗的繁育業(yè)務(wù)。在降低石斛種苗生產(chǎn)成本的同時(shí)拓展了業(yè)務(wù)收入，多元化生產(chǎn)亦增強(qiáng)育苗企業(yè)的抗風(fēng)險(xiǎn)能力。

本次基于鐵皮石斛無菌懸浮培養(yǎng)育苗工藝的開發(fā)改進(jìn)，降低了鐵皮石斛種苗生產(chǎn)成本，增強(qiáng)了種苗的市場(chǎng)競爭力，提升了育苗生產(chǎn)企業(yè)在銷售時(shí)的議價(jià)能力，也為其他物種育苗開辟新通道。