齊堯堯，趙 耀，石曉玲

（1.臨沂職業(yè)學(xué)院，山東 臨沂 276017；2.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000）

0 引言

【研究意義】炭疽菌屬（Colletotrichum）是世界植物致病真菌中分布最廣、種類最豐富的屬之一[1]，該屬的典型代表禾谷炭疽菌（C.graminicola）是半活體營養(yǎng)病原菌，其引發(fā)的葉枯病和莖腐病造成玉米大幅減產(chǎn)，是制約玉米生產(chǎn)的主要因素，嚴(yán)重威脅世界糧食安全[2-3]。禾谷炭疽菌的侵染過程經(jīng)歷了分生孢子的萌發(fā)、附著胞的形成、侵入栓的產(chǎn)生、初生侵染菌絲和次生侵染菌絲的形成及侵染過程[4-5]。盡管對禾谷炭疽菌致病的整個過程有了較清晰的認(rèn)識，但是調(diào)控禾谷炭疽菌生長發(fā)育和侵染致病過程的具體機制尚不清楚?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Rab 家族蛋白作為分子開關(guān)，能靶定到特異的細(xì)胞器上，通過與上游調(diào)控因子和下游特定效應(yīng)子進(jìn)行互相作用，實現(xiàn)GTP 活性態(tài)和GDP 失活態(tài)的循環(huán)，從而精確調(diào)控囊泡運輸?shù)母鱾€過程，進(jìn)而參與真菌的侵染致病過程[6-8]。其成員Rab4 蛋白在哺乳動物和植物中研究較多，有Rab4A、Rab4B 和Rab4C 等3 個亞型，且不同亞型的功能不盡相同，但真菌中發(fā)現(xiàn)的Rab4 蛋白只有一個，例如，裂殖酵母中ypt4 主要維持細(xì)胞周期發(fā)育過程中液泡的大小和穩(wěn)態(tài)[9]，而玉米黑粉菌中Rab4 參與調(diào)控囊泡的移動和分裂[10]。禾谷炭疽菌中關(guān)于Rab4 的功能有待深入研究?！颈狙芯壳腥朦c】前期通過生物信息學(xué)的方法鑒定到禾谷炭疽菌中有一個Rab4 蛋白（GLRG_08562），333 個氨基酸，含有Rab 蛋白保守的結(jié)構(gòu)域[11]，其在禾谷炭疽菌生長發(fā)育和侵染致病過程中的作用值得探究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用同源重組的原理對CgRAB4 基因進(jìn)行敲除，利用潮霉素作為篩選標(biāo)記且經(jīng)PCR 驗證后獲得缺失突變體菌株，進(jìn)而分析缺失突變體菌株在禾谷炭疽菌菌絲生長、孢子產(chǎn)量、附著胞萌發(fā)及對玉米毒性等方面的作用，以期闡明CgRAB4 在禾谷炭疽菌的生長發(fā)育和侵染致病過程中的作用，為尋找炭疽病的防控策略提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 禾谷炭疽菌株M2，pCX62 為本實驗室課題組保存。

1.1.2 試劑耗材 超保真酶和KOD 酶購自Vazyme公司；2 ×TaqPCR Master Mix、DNA Marker 和核酸染料購自天根公司；溶壁酶、潮霉素和熒光增白劑（Calcofluor White Stain，CFW）購自Sigma 公司；氨芐青霉素和硫酸鏈霉素購自上海生工生物工程有限公司；剛果紅（Congo，CR）和山梨醇（DSorbitol）購自索寶來公司；NaCl、KCl、SDS 購自國藥；瓊脂糖、TAE 緩沖液配置所需試劑、PCR 管和離心管購自博尚公司；培養(yǎng)皿購自廣州杰特公司；疏水載玻片（Gelbond film）購自BMA 公司。

引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基如表1 所示。

表1 供試培養(yǎng)基Table 1 Culture media applied

1.2 方法

1.2.1 同源重組的基本原理 根據(jù)同源重組原理，利用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPH）替代CgRAB4 基因進(jìn)行敲除，其基本策略如圖1A 所示。首先以禾谷炭疽菌基因組DNA 為模板，利用CgRAB4 基因的上游和下游2 000 bp AF/AR 和BF/BR 為引物分別擴增A 片段和B 片段；然后以pCX62 質(zhì)粒DNA 為模板，以潮霉素內(nèi)部引物HYG/F 和YG/R、YG/F 和HY/R 為引物分別擴增NH 和HC 片段；最后利用重疊延伸PCR（Splicing by overlap extension，SOE-PCR）擴增AH和HB 片段，50 μL 反應(yīng)體系包括A 片段和NH 片段（或B 片段和HC 片段）各1 μL、25 μL 2 × Phanta Max Buffer、1.0 μL 10 mmol·L-1dNTP Mix、Primer-AF 和Primer-HY/R（或YG/F 和BR）各2 μL、1.0 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、17 μL ddH2O，反應(yīng)體系如圖1-B 所示，將純化回收的AH和HB 共轉(zhuǎn)化到禾谷炭疽菌的原生質(zhì)體后最終重組形成A+HPH+B 片段，從而成功敲除掉CgRAB4 基因。

圖1 同源重組的敲除策略（A）和SOE-PCR 熱循環(huán)體系（B）Fig.1 Homologous recombination knockout (A) and SOC-PCR system (B)

1.2.2 禾谷炭疽菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體的制備：首先將新活化的野生型菌株M2 切成40 小塊，放入200 mL PDB 中，置于28 ℃、150 r·min-1的氣浴恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)36～48 h 后過濾、研磨后收集菌絲，用30 mL·個-1樣品的溶壁酶溶液進(jìn)行 裂 解，30 ℃、90 r·min-1裂解3.5 h。然后利用STC 重懸沉淀和Sorbitol淋洗，最終調(diào)整濃度至5 × 107～5 × 108個·mL-1。最后混勻后用剪過尖端的槍頭吸取250 μL 原生質(zhì)體分裝至無菌的離心管中。原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：通過聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，即將CgRAB4 的AH 和HB 片段各10 μL 與上述250 μL 原生質(zhì)體混勻后冰上靜置20 min，加入1.5 mL PTC 溶液(40% PTC 3350，50 mmol·L-1Tris-HCl pH8.0，50 mmol·L-1CaCl2）混勻冰上靜置20 min，4 000 r·min-1離心10 min 后倒掉上清液，加入5 mL 液體TB3 培養(yǎng)基，30 ℃，90 r·min-1孵育12 h 后與加入35 mL 含有100 mg·mL-1潮霉素的TB3 培養(yǎng)基混合倒下層板，靜置20 min 凝固，再在上層倒入50 mL 含有300 mg·mL-1潮霉素的TB3 培養(yǎng)基，于26 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 左右長出轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 轉(zhuǎn)化子DNA 的提取和驗證 轉(zhuǎn)化子DNA 的提?。菏紫葘⒋蟀澹?5 cm）上長出來的轉(zhuǎn)化子挑取到PDA（6 cm）上培養(yǎng)4 d 左右，然后刮取轉(zhuǎn)化子的菌絲到含有適量石英砂和400 μL DNA 提取buffer（50 mmol·L-1Tris-HCl pH8.0、50 mmol·L-1EDTA pH8.0、2% SDS、0.5 mol·L-1NaCl）的1.5 mL 離心管中，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)3～4 h；最后用氯仿抽提，70%酒精沖洗DNA，適量無菌水溶解DNA。轉(zhuǎn)化子DNA 的驗證：首先用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA，然后用OF/OR 和UAF/H853兩對引物從DNA 水平驗證轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 禾谷炭疽菌菌絲生長相關(guān)試驗 生長速率測定：首先將新鮮活化的CgM2、△Cgrab4-2、△Cgrab4-7和△Cgrab4-Ect菌株用打孔器獲取大小相等的菌絲塊，然后分別接種于PDA、CMII 和MK 培養(yǎng)基（9 cm）的正中央，置于26 ℃ 2 000 lx 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，最后測量直徑拍照。本試驗重復(fù)3 次，每次每個菌株至少3 個重復(fù)。菌絲形態(tài)觀察：首先分別將CMII 培養(yǎng)基上生長2 d 的CgM2、△Cgrab4-2、△Cgrab4-7 和△Cgrab4-Ect菌株切取2.0 cm × 0.5 cm菌絲塊，然后倒置于干凈無菌的載玻片上，最后顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)并拍照。生長脅迫試驗：首先將新鮮活化的CgM2、△Cgrab4-2、△Cgrab4-7 和△Cgrab4-Ect菌株用打孔器獲取大小相等的菌絲塊，然后分別轉(zhuǎn)接到含有0.7 mol·L-1NaCl、0.7 mol·L-1KCl、1 mol·L-1Sorbitol、200 μg·mL-1CFW、200 μg·mL-1CR、0.01% SDS的培養(yǎng)基上，置于26 ℃2 000 lx 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，最后測量直徑拍照。本試驗重復(fù)3 次，每次每個菌株至少3 個重復(fù)。

抑制率=[（未加抑制劑的菌落直徑-添加抑制劑的菌落直徑）/未加抑制劑的菌落直徑]×100%

1.2.5 禾谷炭疽菌孢子產(chǎn)量統(tǒng)計和形態(tài)觀察 孢子產(chǎn)量測定：首先將新鮮活化的CgM2、△Cgrab4-2、△Cgrab4-7 和△Cgrab4-Ect菌株用打孔器獲取大小相等的菌絲塊，轉(zhuǎn)接3 塊到含有氨芐抗生素的50 mL PDB培養(yǎng)基里，于28 ℃ 110 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，最后離心收集孢子，棄上清后加入5 mL無菌ddH2O，混勻后吸取10 μL 到血球計數(shù)板上計數(shù)，計數(shù)所得個數(shù)換算成單位面積的產(chǎn)孢量。試驗重復(fù)3 次，每次每個菌株至少3 個重復(fù)。孢子形態(tài)觀察：將上述計數(shù)后的分生孢子置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 禾谷炭疽菌附著胞的形成和形態(tài)觀察 首先將CgM2、△Cgrab4-2、△Cgrab4-7和△Cgrab4-Ect的分生孢子定量至5 × 105個，然后分別吸取15 μL·滴-1到Gelbond film 疏水表面上，置于26 ℃黑暗培養(yǎng)，最后分別于0、6、12、24、48 h 統(tǒng)計孢子和附著胞的萌發(fā)率，并于顯微鏡下觀察附著胞形態(tài)。其中每個載玻片3 滴，每個樣品重復(fù)3 次。

1.2.7 禾谷炭疽菌致病力的測定 玉米葉片造傷接種：將生長15 d 左右（三葉一心）的Mo13 玉米葉片取下粘貼于濾紙上，然后用無菌牙簽輕輕點擊玉米葉片（葉片不能穿透），然后接種大小相等的CgM2、△Cgrab4-2、△Cgrab4-7 和△Cgrab4-Ect菌絲塊，最后加水浸潤濾紙，覆蓋保鮮膜于26 ℃黑暗培養(yǎng)24 h后光照培養(yǎng)5 d，觀察玉米葉片的發(fā)病情況。孢子懸浮液噴霧接種玉米葉片：將定量好的分生孢子懸浮液（加吐溫）噴霧接種于三葉一心的玉米葉片上，黑暗處理24 h 后，26 ℃光照培養(yǎng)7 d，觀察玉米葉片的發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 CgRAB4 缺失突變體相關(guān)引物的設(shè)計

本研究利用primer5 設(shè)計引物，具體的序列如表2 所示。

表2 供試引物序列Table 2 Sequence of primer employed

2.2 SOE-PCR 擴增獲得CgRAB4 缺失突變體的長片段

SOE-PCR 在設(shè)計引物時有兩條是常規(guī)的引物，另外兩條引物是特殊設(shè)計的，其序列上一端與自身的目的片段互補，另外一端卻是另外一段目的基因的序列（表2）。兩段基因的引物經(jīng)過各自的PCR克隆后，在各自的產(chǎn)物其中的一端加上特別的接頭。利用接頭的特異互補進(jìn)行PCR 擴增，從而將兩段PCR 產(chǎn)物連接到了一起，形成了不靠限制性內(nèi)切酶連接的雜交基因片段。

利用PCR 擴增CgRAB4 的上游A 片段、下游B片段、潮霉素NH 片段和潮霉素HC 片段，然后將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，上樣3.0 μL，結(jié)果如圖2 所示，得到A 片段大小為783 bp，介于750～1 000 bp，B 片段大小為1 048 bp，略高于1 000 bp 的條帶，而NH 片段（768 bp）和HC 片段（918 bp）的片段也大小正確，條帶單一。然后將獲得的A 片段、NH 片段、B 片段和HC 片段，通過SOE-PCR 擴增AH片段和HB片段，擴增得到AH（1 582 bp）和HB（1 966 bp）條帶單一大小正確，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)化試驗。

圖2 SOE-PCR 擴增AH 和HBFig.2 SOE-PCR amplifications of AH and HB

2.3 CgRAB4 敲除轉(zhuǎn)化子的篩選驗證

本試驗共轉(zhuǎn)化了2 批，共得到了11 個轉(zhuǎn)化子。提取DNA 后利用CgRAB4 基因ORF 內(nèi)部一對引物OF/OR、AF 上游一條引物UAF 與潮霉素基因內(nèi)部一條特異性引物H853（UA）對11 個候選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA 水平的驗證。結(jié)果如圖3 所示，凡是ORF 無陽性擴增（503 bp）且UA 有陽性擴增（1 475 bp）的轉(zhuǎn)化子即為敲除突變體，共獲得Cgrab4-2、Cgrab4-6、Cgrab4-7 三個敲除突變體。而ORF 未被潮霉素基因替換，即ORF 有陽性擴增，且潮霉素基因隨機整合到基因組具備潮霉素抗性但UA 無陽性擴增的轉(zhuǎn)化子即為異位整合突變體，共獲得Cgrab4-1 一個異位整合突變體。本試驗取缺失突變體Cgrab4-2、Cgrab4-7 和異位整合突變體Cgrab4-1 用于后續(xù)的表型分析試驗。

圖3 轉(zhuǎn)化子的DNA 提取與驗證Fig.3 DNA extraction and verification on transformants

2.4 CgRAB4 缺失對禾谷炭疽菌生長發(fā)育的影響

將CgM2、△Cgrab4-2、△Cgrab4-7 和△Cgrab4-Ect菌株分別于CMII、PDA 和MK 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，6 d后測量直徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與CgM2 相比，缺失突變體△Cgrab4-2、△Cgrab4-7 的生長速率略微加快（圖4-A和4-B）；將培養(yǎng)基縱切，觀察到野生型和缺失突變體的氣生菌絲量沒有顯著變化（圖4-A）；異位整合突變體△Cgrab4-Ect與野生型CgM2 的生長速率和氣生菌絲與野生型無明顯變化。進(jìn)一步觀察菌絲的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與野生型CgM2 相比，CgRAB4 缺失突變體和異位整合突變體的菌絲形態(tài)沒有變化，都產(chǎn)生細(xì)長的菌絲（圖4-C）。以上結(jié)果表明CgRAB4 缺失后促進(jìn)了菌絲的生長，但并不影響菌絲的形態(tài)發(fā)育。

圖4 禾谷炭疽菌CgRAB4 缺失突變體的生長發(fā)育Fig.4 Development of CgRAB4-deleted mutants

2.5 CgRAB4 缺失對禾谷炭疽菌脅迫響應(yīng)的影響

胞吞過程在真菌細(xì)胞應(yīng)對各種環(huán)境刺激和脅迫的過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，而Rab 蛋白調(diào)控胞吞過程，因此本研究分析了CgRAB4 應(yīng)對高滲脅迫和細(xì)胞壁抑制劑條件下的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是在CMII培養(yǎng)基（圖5-A）還是PDA培養(yǎng)基（圖5-C）上，與野生型CgM2 相比，CgRAB4 缺失后菌落生長略有增長，抑制率都略有增加（圖5-B、D），表明CgRAB4不參與調(diào)控外界脅迫的響應(yīng)過程。

圖5 CgRAB4 缺失突變體脅迫響應(yīng)試驗Fig.5 Stress responses of CgRAB4-deleted mutants

2.6 CgRAB4 缺失對禾谷炭疽菌孢子產(chǎn)量和形態(tài)的影響

進(jìn)一步對CgRAB4 缺失突變體和異位整合突變體的產(chǎn)孢量進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果如圖6-A 所示，與野生型相比，CgRAB4 缺失突變體中孢子量沒有變化。觀察孢子形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與野生型一樣，CgRAB4缺失突變體也會產(chǎn)生鐮刀型分生孢子，形狀和大小并無變化，表明CgRAB4 不參與調(diào)控禾谷炭疽菌分生孢子的產(chǎn)生和發(fā)育過程。

圖6 CgRAB4 缺失突變體產(chǎn)孢量和孢子形態(tài)Fig.6 Conidiations and spore morphology of CgRAB4-deleted mutants

2.7 CgRAB4 缺失對禾谷炭疽菌附著胞的影響

通過對分生孢子萌發(fā)形成附著胞的過程進(jìn)行觀察，與野生型一樣，CgRAB4 缺失突變體在6 h 后分生孢子會在兩端或中間進(jìn)行萌發(fā)，12 h 后產(chǎn)生近球狀的附著胞（圖7），48 h 幾乎全部萌發(fā)產(chǎn)生附著胞。此外，兩者的菌絲頂端都可以直接萌發(fā)產(chǎn)生多邊形不規(guī)則的附著胞，表明CgRAB4 不參與禾谷炭疽菌分生孢子和附著胞的發(fā)育過程。

圖7 CgRAB4 缺失突變體的孢子萌發(fā)和附著胞形態(tài)Fig.7 Spore germination and appressorium morphology of CgRAB4-deleted mutants

2.8 CgRAB4 缺失對禾谷炭疽菌致病性的影響

為了明確CgRAB4 是否參與禾谷炭疽菌的致病過程，本試驗通過對玉米葉片進(jìn)行造傷接種（圖8-A）和噴霧接種（圖8-B），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型CgM2一樣，CgRAB4 缺失突變體能在玉米葉片上造傷口附近產(chǎn)生梭形的擴展斑（圖8-A），噴霧接種到玉米葉片上，病斑連接成片，玉米葉片發(fā)黃，表明CgRAB4并不參與調(diào)控禾谷炭疽菌的致病過程。

圖8 CgRAB4 缺失突變體對玉米的致病性Fig.8 Pathogenesis of CgRAB4-deleted mutants on corn

3 討論與結(jié)論

前期生物信息學(xué)鑒定出禾谷炭疽菌共有10 個Rab候選蛋白[11]，其成員之一Rab4 在動物、植物和真菌中均有研究[12-14]，主要定位于網(wǎng)格包被囊泡、早期內(nèi)涵體和循環(huán)囊泡上，有Rab4A、Rab4B 和Rab4C等3 個亞型，Rab4A 的同源基因存在于人類、斑馬魚等生物中，Rab4B 在裂殖酵母等高等多生物中均存在同源基因，而目前Rab4C 的結(jié)構(gòu)與功能尚不清楚[15]，是貨物循環(huán)和內(nèi)涵體分選的關(guān)鍵調(diào)控因子[16]。例如，在人類細(xì)胞中，Rab4 與效應(yīng)蛋白Rabenosyn-5 相互作用參與貨物從早期內(nèi)涵體到質(zhì)膜的循環(huán)[17]；Rab4 與Rab5 共同參與非洲爪蟾視覺系統(tǒng)中突觸的伸長過程[18]；擬南芥中的Rab4b 極性定位于根毛細(xì)胞[19]，其效應(yīng)蛋白PI-4Kβ1 通過新同源結(jié)構(gòu)域IIIβ PI-4Ks 與Rab4b 相互作用，并利用NH2 末端與AtCBL1 相互作用，從而將Ca2+通道和PI-4,5P2 信號通路建立聯(lián)系，進(jìn)而調(diào)控根毛細(xì)胞頂端細(xì)胞壁成分的極性分泌[14]。到目前為止，真菌中僅報道了裂殖酵母和玉米黑粉菌中均只有一個Rab4 蛋白，分別維持細(xì)胞周期發(fā)育過程[9]和液泡的大小以及穩(wěn)態(tài)[10]，但在真菌的生長發(fā)育和侵染致病過程的作用尚有待深入研究。因此對不同真菌中Rab4 功能的研究有助于揭示Rab4 蛋白的保守型和功能差異性，對禾谷炭疽菌中CgRAB4的研究能豐富Rab4 在真菌中的研究，并為Rab 蛋白的功能研究提供理論支持。

為進(jìn)一步分析Rab4 是否參與調(diào)控禾谷炭疽菌的生長發(fā)育和侵染致病過程，本研究首先根據(jù)同源重組的原理對CgRAB4 基因進(jìn)行敲除，利用SOE-PCR擴增長片段AH 和HB，將其共同轉(zhuǎn)化至禾谷炭疽菌的原生質(zhì)體中，經(jīng)潮霉素抗性篩選和PCR 驗證，成功獲得3 個缺失突變體和1 個異位整合突變體。然后分析CgRAB4 缺失突變體在菌絲生長發(fā)育、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)、對玉米致病力等方面的作用，發(fā)現(xiàn)與野生型CgM2 相比，CgRAB4 缺失后促進(jìn)了禾谷炭疽菌的生長，但不影響菌絲的形態(tài)，且不參與調(diào)控外界脅迫的響應(yīng)過程，孢子產(chǎn)量和形態(tài)、附著胞的發(fā)育以及對玉米的致病力都沒有明顯變化，表明CgRAB4可能只參與調(diào)控禾谷炭疽菌的生長過程。

本研究中只進(jìn)行了兩次禾谷炭疽菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，共獲得11 個候選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率不是很高，但經(jīng)驗證后得到3 個缺失突變體，CgRAB4 基因敲除的效率卻較高。另外本研究對CgRAB4 基因進(jìn)行回補，經(jīng)過多次嘗試均未獲得互補突變體。本研究對CgRAB4 功能的初探有助于解析Rab4 調(diào)控禾谷炭疽菌的致病機理，也豐富了Rab4 蛋白在真菌中的研究，為尋找炭疽病的防控策略提供理論指導(dǎo)。