趙建偉，陳藝欣，林 碩，陳 勇，田厚軍

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福州作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/國(guó)家農(nóng)業(yè)生物安全科學(xué)中心華東分中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】土荊芥Chenopodium ambrosiodesL.，黎科黎屬，又稱臭草、殺蟲(chóng)芥，是一種一年生或多年生的芳香性草本入侵植物，莖葉和果實(shí)都有強(qiáng)烈氣味，原產(chǎn)美洲熱帶，極易擴(kuò)散于農(nóng)田中，廣泛分布于世界熱帶及溫帶地區(qū)[1-3]。我國(guó)主要分布于福建、江西、浙江、江蘇、臺(tái)灣、廣東、廣西等省[4]。土荊芥作為一種入侵雜草，資源豐富，而土荊芥精油本身對(duì)害蟲(chóng)具有趨避、毒殺作用[5]，對(duì)病原菌有抑制作用[6]，還可作為化感物質(zhì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)[7]，因此，如何將土荊芥變廢為寶，發(fā)揮其在病蟲(chóng)害防治方面的作用具有重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有關(guān)土荊芥精油化學(xué)成分及生物活性[8-12]等方面已有一些研究報(bào)道。植物精油作為重要的殺蟲(chóng)劑增效劑，其藥效一方面取決于它的毒性大小及有機(jī)體對(duì)他的解毒能力，另一方面則取決于穿透生物體表的難易[13]。昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性一個(gè)重要原因就是農(nóng)藥對(duì)昆蟲(chóng)表皮滲透率降低，而植物精油則是改變昆蟲(chóng)表皮滲透率，從而影響其生長(zhǎng)發(fā)育，相關(guān)研究已在家蠅（Musca domesticaL.）[14]、灰茶尺蠖（Ectropis GrisescensWarren）[15]、斜紋夜蛾（Spodoptera lituraFabricius）[16]、菜青蟲(chóng)（Pieris rapae）[5]、棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigeraHübner）[17]等多種昆蟲(chóng)中報(bào)道。土荊芥精油的殺蟲(chóng)活性還表現(xiàn)對(duì)幼蟲(chóng)體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶呈明顯的抑制作用，對(duì)羧酸酯酶呈激活后抑制的作用[18]。小菜蛾（Plutella xylostellaL.）屬于鱗翅目菜蛾科，是世界上分布最廣、對(duì)十字花科蔬菜危害最嚴(yán)重的蔬菜害蟲(chóng)。由于過(guò)度依賴化學(xué)藥劑防治，小菜蛾對(duì)多種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了嚴(yán)重抗藥性[19,20]。全世界用于小菜蛾的防控成本以及小菜蛾對(duì)蔬菜造成的損失已超過(guò)50 億美元[21]。目前土荊芥精油對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)表皮的滲透作用以及對(duì)化學(xué)藥劑作用于昆蟲(chóng)表皮的滲透效果尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)研究土荊芥精油對(duì)小菜蛾表皮滲透促進(jìn)作用，可以更深入地了解土荊芥精油對(duì)殺蟲(chóng)劑的滲透促進(jìn)作用機(jī)理，并尋找小菜蛾表皮靶標(biāo)作用位點(diǎn)的有效藥劑，達(dá)到藥劑減量高效殺蟲(chóng)的目的?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用掃描電鏡觀察土荊芥精油對(duì)小菜蛾表皮超微結(jié)構(gòu)的變化，以揭示其促滲機(jī)理；并利用氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定了土荊芥精油對(duì)殺蟲(chóng)劑透皮吸收量的變化，為合理開(kāi)發(fā)利用雜草資源及植物精油促進(jìn)害蟲(chóng)持續(xù)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土荊芥精油

土荊芥Chenopodium ambrosiodesL.采自福建省福州市新店鎮(zhèn)埔垱村福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)田（北緯26°07′30.74″，東經(jīng)119°18′23.98″，海拔 6.3 m），生育期為開(kāi)花前期，提取部位為花、葉、莖、種子。參照國(guó)家藥典委員會(huì)[22]提取方法。

1.2 供試蟲(chóng)源

小菜蛾飼養(yǎng)參照田厚軍等[23-24]的方法。小菜蛾蛹采自福建省福州市新店鎮(zhèn)埔垱村福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)菜田（北緯26°07′30.74″，東經(jīng)119°18′23.98″，海拔 6.3 m），種群擴(kuò)繁飼養(yǎng)于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所養(yǎng)蟲(chóng)室，飼養(yǎng)過(guò)程中未接觸殺蟲(chóng)劑，飼養(yǎng)代數(shù)至少30 代以上。幼蟲(chóng)用甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.var.capitata）葉片飼養(yǎng)，待化蛹后將其單頭分裝到指形管中，用10%蜜糖水對(duì)羽化后的成蟲(chóng)進(jìn)行養(yǎng)分補(bǔ)充，取生理狀態(tài)和蟲(chóng)齡一致的試蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)定。飼養(yǎng)溫度25 ℃±1.0 ℃，光照時(shí)間16 h·d-1，相對(duì)濕度（RH）65%～75%。

1.3 試劑與儀器

毒死蜱（Chlorpyrifos，純度92%，浙江新農(nóng)化工有限公司），氮酮（Aazone Laurocapram，純度95%，鄭州市新瑞化工有限公司），敵百蟲(chóng)（Trichlorfon，純度90%，山東大成農(nóng)藥股份有限公司），氟蟲(chóng)腈（Fipronil，純度96%，江西省宜春遠(yuǎn)大化工有限公司），戊二醛（Glutaraldehyde，純度50%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），叔丁醇（Tert-butanol，純度99.5%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、0.1 mol·L-1pH=7.2磷酸緩沖液，KI（Potassium iodide，純度99%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），I2（Iodine，純度99.5%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、蔗糖（Sucrose，純度99.5%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蒸餾水。JFC-型鍍儀鍍膜，JSM-5310LV 型掃描電鏡（上海凱悅電子科技有限公司）。氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（Trace Gc ultra/DSQ，美國(guó)菲利根公司）。

1.4 掃描電鏡觀察

選取個(gè)體大小一致的小菜蛾3 齡幼蟲(chóng)，每個(gè)處理10 頭，用尼龍紗籠將小菜蛾3 齡幼蟲(chóng)分別浸入500、1 000 mg·L-1的土荊芥精油、氮酮以及丙酮和蒸餾水中5 s 后取出，吸去試蟲(chóng)體上多余的藥液，置于培養(yǎng)皿（Ф=9 cm），用甘藍(lán)葉正常飼喂24 h[25]。

由于小菜蛾幼蟲(chóng)身體較軟，為了使固定液滲入表面蠟質(zhì)，用少量去污劑與固定液結(jié)合。首先將小菜蛾用體積分?jǐn)?shù)為2.5% 的戊二醛（pH=7.2）固定24 h 后，用KI 組織導(dǎo)電液（2.0 g KI、0.2 g I2、100 mL雙蒸水、0.2 g 蔗糖）浸泡8～10 h，然后用蒸餾水清洗樣品，并用系列叔丁醇脫水，之后用叔丁醇浸沒(méi)，置冰箱（≤4 ℃）中10 min 后，放人真空干燥器中干燥40～60 min，將干燥好的樣品觀察面朝上粘臺(tái)，用JFC-1200 型鍍儀鍍膜，置于掃描電鏡（20 kV加速電壓）下觀察，拍照。掃描后對(duì)圖片的亮度、對(duì)比度稍作處理[26]。

1.5 幼蟲(chóng)表皮滲透率測(cè)定

小菜蛾處理方法：參照魏方林等[27]的方法，選取室內(nèi)長(zhǎng)期飼養(yǎng)、大小一致的小菜蛾3 齡幼蟲(chóng)，各藥劑配置成丙酮液后，用點(diǎn)滴法（0.5 μL·頭-1）以LD50劑量處理試蟲(chóng)。處理后置于墊有濾紙和放有新鮮甘藍(lán)葉的培養(yǎng)皿（Ф=9 cm）中，光照培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，在處理后1、2、6、12、24 h 分別取出10 頭試蟲(chóng)，置于淋洗器內(nèi)，并用移液槍1 mL 丙酮，分10 次淋洗試蟲(chóng)表皮，淋洗液收集于3 mL 的容量瓶中，用丙酮定容。另取10 頭未經(jīng)任何藥劑處理的3 齡幼蟲(chóng)，同樣用1 mL 丙酮分10 次淋洗并定容至3 mL，作為對(duì)照。

菲尼根（Finngin）氣質(zhì)聯(lián)用儀；檢測(cè)器：離子肼質(zhì)譜、電子轟擊源（EI）；色譜柱：DB-5 MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣：氦氣（99.999%）；柱流量：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：220 ℃，離子源溫度250 ℃；色譜柱程序升溫：初始溫度80 ℃保持1 min，后以20 ℃·min-1升至280 ℃，保持11 min；標(biāo)樣進(jìn)樣量：1 μL。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均采用DPS 軟件[28]。透皮吸收量和表皮滲透率數(shù)據(jù)均以采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）”，采用單因素方差分析，鄧肯氏新復(fù)差檢驗(yàn)法（Duncan’s Multiple Range Test，DMRT）進(jìn)行多重比較其顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 土荊芥精油對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)表皮蠟質(zhì)層超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖1 所示，掃描電鏡觀察結(jié)果表明，蒸餾水處理組（圖1-A 和圖1-B）小菜蛾幼蟲(chóng)體壁蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)緊密，有許多完整的刺狀突起，蠟花之間的空隙非常??；土荊芥處理組（圖1-C 與圖1-D）的蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)較為松散，蠟花間隙較大，可以看到明顯的結(jié)構(gòu)性損傷，刺狀突起變得比較平滑，刺狀突下面表皮產(chǎn)生褶皺或不規(guī)則變形，部分刺狀突起發(fā)生斷裂。

圖1 土荊芥精油對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)表皮蠟質(zhì)層超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of WEO on cuticle wax layer of DBM larvae

丙酮處理組（圖1-E 和圖1-F）的蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)排列，蠟花間空隙小，但與蒸餾水處理組相比，部分刺狀突起不完整的，有些微破損；氮酮處理組（圖1-G 與圖1-H）蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)的刺狀突起排列較為松散，間隙較大，刺狀突起變得比較平滑，刺狀突下面表皮產(chǎn)生褶皺或不規(guī)則變形，與土荊芥精油處理組相當(dāng)。表明土荊芥精油與氮酮對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)表皮具有相似的影響。

2.2 土荊芥精油對(duì)殺蟲(chóng)劑的透皮吸收量的影響

表1 結(jié)果表明，處理后1 h，土荊芥精油處理組的敵百蟲(chóng)在小菜蛾幼蟲(chóng)表皮的滲透率達(dá)62.27%，而敵百蟲(chóng)單劑處理組的滲透率僅為45.16%，氮酮處理組敵百蟲(chóng)的表皮滲透率為64.51%。而處理后24 h，土荊芥精油處理組敵百蟲(chóng)的滲透率為99.65%，氮酮處理組的為97.57%，表明土荊芥精油對(duì)敵百蟲(chóng)的表皮滲透有更好的促進(jìn)作用，而且比滲透促進(jìn)劑氮酮對(duì)敵百蟲(chóng)的表皮滲透促進(jìn)作用更好。處理后1～2 h后，土荊芥精油與敵百蟲(chóng)混配后在小菜蛾幼蟲(chóng)表皮的累積透皮量與敵百蟲(chóng)單劑比較，差異均顯著，達(dá)到氮酮水平。

表1 敵百蟲(chóng)的累積透皮量及表皮滲透率Table 1 Accumulative quantity and rate of trichlorphon penetrated through DBM exoskeleton

表2 結(jié)果表明，土荊芥精油對(duì)氟蟲(chóng)腈有顯著的滲透促進(jìn)作用，隨著時(shí)間的增加，總體上氟蟲(chóng)腈的累積透皮量和表皮滲透率都逐漸增加。處理12 h 后，土荊芥精油處理組的氟蟲(chóng)腈表皮滲透率達(dá)99.08%，而氟蟲(chóng)腈單劑處理組的表皮滲透率僅為24.52%，氮酮的表皮滲透率為60.88%；處理24 h 后土荊芥精油與氟蟲(chóng)腈混配、氮酮的滲透率分別為99.34%和55.12%，由此表明土荊芥精油的促滲效果強(qiáng)于氮酮。處理后各個(gè)時(shí)間段，土荊芥精油與氟蟲(chóng)腈混配的累積透皮量與氟蟲(chóng)腈單劑比較，均有顯著差異，達(dá)到氮酮水平。

表2 氟蟲(chóng)腈的累積透皮量及表皮滲透率Table 2 Accumulative quantity and rate of fipronil penetrated through DBM exoskeleton

表3 結(jié)果表明，土荊芥精油對(duì)毒死蜱的表皮滲透一定程度的促進(jìn)作用，隨處理后時(shí)間的增加，毒死蜱的累積透皮量和表皮滲透率都逐漸增加。與毒死蜱單劑相比，處理后12 h 的表皮滲透率增幅較大，達(dá)92.05%，而毒死蜱單劑的滲透率僅為88.72%，滲透促進(jìn)劑氮酮的滲透率也只有89.50%。在處理后各個(gè)時(shí)間段，土荊芥精油和毒死蜱混配的累積透皮量與毒死蜱單劑比較，差異不顯著，氮酮也是如此。

表3 毒死蜱的累積透皮量及表皮滲透率Table 3 Accumulative quantity and rate of chlorpyrifos penetrated through DBM exoskeleton

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，土荊芥精油處理后，小菜蛾的表皮可以看到明顯的結(jié)構(gòu)性損傷，蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)的刺狀突起排列變得比較松散，刺狀突起變得平滑，刺狀突下部變得褶皺或開(kāi)裂，有助于化學(xué)藥劑透過(guò)表皮層進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)。而土荊芥精油通過(guò)對(duì)灰茶尺蠖（Ectropis GrisescensWarren）和菜青蟲(chóng)（Pieris rapae）幼蟲(chóng)表皮的滲透作用進(jìn)而影響其生長(zhǎng)發(fā)育，主要表現(xiàn)在化蛹率、后代產(chǎn)卵量、蛹重等生長(zhǎng)指標(biāo)均下降[5,15]；通過(guò)葉碟法測(cè)定薰衣草精油對(duì)斜紋夜蛾（Spodoptera lituraFabricius）的非選擇取食和生長(zhǎng)抑制，結(jié)果表明，薰衣草精油在較低濃度時(shí)會(huì)促進(jìn)3 齡幼蟲(chóng)取食，在高濃度時(shí)會(huì)導(dǎo)致幼蟲(chóng)表皮結(jié)構(gòu)破壞從而抑制其生長(zhǎng)發(fā)育[16]；八角茴香果實(shí)精油對(duì)昆蟲(chóng)表皮的損害性較強(qiáng)，不僅對(duì)棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigeraHübner）的生長(zhǎng)發(fā)育有顯著的抑制作用，而且大幅提高其3 齡幼蟲(chóng)的死亡率[17]。綜上所述，植物精油對(duì)昆蟲(chóng)的生物活性均表現(xiàn)在與昆蟲(chóng)接觸后對(duì)其表皮結(jié)構(gòu)造成一定的損傷以提高其滲透速率。

促進(jìn)藥物經(jīng)皮吸收有多種方法，其中促滲劑的利用最為廣泛，將藥物與促滲劑結(jié)合，利用促滲劑與皮膚類脂或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用而增加藥物滲透[29]。根據(jù)昆蟲(chóng)抗性機(jī)理研究報(bào)道，影響藥劑滲透的主要因子是昆蟲(chóng)的上表皮結(jié)構(gòu)，尤其是上表皮最外面的水泥層－蠟質(zhì)層的組成和厚度[30]。藥劑要首先溶入蠟質(zhì)層，然后再按照其分配系數(shù)滲透上表皮和原表皮[31]。從掃描電鏡觀察結(jié)果可知，土荊芥精油處理后，小菜蛾幼蟲(chóng)表皮蠟質(zhì)層受到了一定程度的損傷或影響，刺狀突間隙增大，結(jié)構(gòu)排列比較松散，部分刺狀突發(fā)生斷裂現(xiàn)象，這與土荊芥精油作為滲透促進(jìn)劑的作用機(jī)理，即改變角質(zhì)層的通透性，減低藥物經(jīng)皮滲透的阻力，提高藥物在皮膚角質(zhì)層的擴(kuò)散系數(shù)是相一致的[32]。因此，把土荊芥精油作為一種滲透促進(jìn)劑來(lái)研究開(kāi)發(fā)是完全符合土荊芥精油本身特點(diǎn)。本研究結(jié)果也可為土荊芥精油應(yīng)用于其他有機(jī)磷、苯基吡唑類和硫代磷酸酯類殺蟲(chóng)劑提供理論依據(jù)。

脂質(zhì)是昆蟲(chóng)表皮的重要組成成分，其中體表脂質(zhì)是昆蟲(chóng)維持正常生命活動(dòng)的第一道防護(hù)屏障。對(duì)于化學(xué)藥劑來(lái)說(shuō)，突破昆蟲(chóng)表皮的防護(hù)屏障來(lái)殺死昆蟲(chóng)至關(guān)重要，本研究初步探討土荊芥精油對(duì)小菜蛾表皮的滲透效果，并與幾種化學(xué)藥劑復(fù)配以驗(yàn)證土荊芥精油對(duì)化學(xué)藥劑的增效作用，發(fā)現(xiàn)土荊芥精油的確具有提高農(nóng)藥殺蟲(chóng)效果的潛力，后續(xù)我們將深入開(kāi)展土荊芥精油對(duì)復(fù)合藥劑的增效作用研究以及對(duì)重要害蟲(chóng)的表皮滲透促進(jìn)作用，如采用透射電鏡掃描，進(jìn)一步觀察土荊芥精油對(duì)小菜蛾表皮結(jié)構(gòu)及其皮下結(jié)構(gòu)的影響，更加深入地闡明土荊芥精油對(duì)小菜蛾表皮的滲透促進(jìn)機(jī)制；同時(shí)，篩選土荊芥精油中重要的植物源活性物質(zhì)，作為農(nóng)藥助劑或者增效劑。田間藥效試驗(yàn)是新藥劑評(píng)價(jià)和農(nóng)藥登記的必需步驟，在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)，可為新藥劑的開(kāi)發(fā)提供必要的科學(xué)依據(jù)；而植物精油是植物源殺蟲(chóng)劑天然寶庫(kù)，如何加快植物精油殺蟲(chóng)產(chǎn)品全面推向市場(chǎng)有待進(jìn)一步探討。