蘇楠楠，董 貴，劉金環(huán)，王夢華，尹夢麗,羅萬和，陳 偉

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)

兼性或?qū)Ｐ园麅?nèi)菌感染給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。因胞內(nèi)寄生菌可在宿主細(xì)胞中定植并長期生存，不僅能通過許多巧妙的機(jī)制抵御宿主的防御系統(tǒng)，而且還會隨著宿主細(xì)胞的游走而在機(jī)體內(nèi)擴(kuò)散，導(dǎo)致持續(xù)性、潛在性和復(fù)發(fā)性的感染[1-2]。因此，兼性胞內(nèi)菌[(金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus,S.aureus)、沙門菌(Salmonella)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)、單核細(xì)胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)、布魯氏菌(Brucella)]和專性胞內(nèi)菌[胞內(nèi)勞森菌(Lawsoniaintracellularis, LI)]感染的治療在獸醫(yī)臨床上面臨著巨大的挑戰(zhàn)。如由胞內(nèi)S.aureus所引起的奶牛乳房炎，因常規(guī)抗菌藥物難以進(jìn)入宿主細(xì)胞中，導(dǎo)致其治愈率不高[3]。加上抗菌藥物的不合理使用，已導(dǎo)致多重耐藥(multidrug resistance, MDR)菌株的產(chǎn)生[3]，給奶牛乳房炎的防治工作增添了難度。因此，迫切需要新的策略來治療胞內(nèi)S.aureus的感染。

目前，設(shè)計和研發(fā)新型的抗菌藥物和新的抗菌藥物遞送系統(tǒng)被認(rèn)為是治療胞內(nèi)菌感染的一種有效方法[4]。但是設(shè)計和研發(fā)一種新型的抗菌藥物耗時長，花費(fèi)巨大，投入精力大，給科研單位和工作人員帶來了一定的困難。納米技術(shù)通過將抗菌藥物制成納米粒，經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)和炎性部位毛細(xì)血管的滲透作用輸送到感染的靶部位或靶細(xì)胞，從而提高胞內(nèi)藥物濃度和延長有效胞內(nèi)停留時間，改善抗菌藥物遞送系統(tǒng)，以此提高胞內(nèi)菌感染的治療效果[5]。

本文通過歸納和總結(jié)常見兼性或?qū)Ｐ园麅?nèi)菌的特性以及納米抗菌藥物治療胞內(nèi)菌感染的現(xiàn)狀，討論并分析納米抗菌藥物在治療胞內(nèi)菌感染所面臨的挑戰(zhàn)，并提出相應(yīng)展望，為進(jìn)一步深化納米抗菌藥物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究，提高抗胞內(nèi)菌感染效果提供理論基礎(chǔ)。

1 胞內(nèi)菌感染

由兼性和專性胞內(nèi)菌所引起的感染，其感染機(jī)制和臨床常用藥物如表1所示。

表1 兼性和專性胞內(nèi)菌的感染機(jī)制和常用藥物Tab 1 Infection mechanism and common drugs of facultative and specific intracellular bacteria

1.1 兼性胞內(nèi)菌

1.1.1 胞內(nèi)S.aureus據(jù)報道，在美國和日本，每頭奶牛每年因乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失分別高達(dá)161美元和5萬日元，其中日本隱性乳房炎患牛產(chǎn)奶量約降15%，而臨床型乳房炎患牛的產(chǎn)奶量可下降40%。我國奶牛臨床型乳房炎的平均發(fā)病率為33.14%，而隱性奶牛乳房炎的陽性率高達(dá)73.91%。

S.aureus作為一種常見的兼性胞內(nèi)菌，以一種小菌落變異體(Small Colony Variants, SCVs)的方式，在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在[6]。研究表明，當(dāng)S.aureus由正常狀態(tài)變?yōu)镾CVs時，更易入侵宿主細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)形成細(xì)菌貯源地后，可巧妙地抵御胞內(nèi)防御體系[11]。且由于SCVs持續(xù)存在于細(xì)胞內(nèi)，可能會導(dǎo)致長期和反復(fù)感染，且SCVs的出現(xiàn)與奶牛乳腺炎的亞臨床感染和反復(fù)感染密切相關(guān)[6]。當(dāng)S.aureus入侵奶牛乳房后，可粘附并定植于乳腺上皮細(xì)胞中，完全游離于細(xì)胞質(zhì)中，吸取細(xì)胞質(zhì)中的營養(yǎng)，以供自己繁殖生存[6]。

目前，在獸醫(yī)臨床上治療S.aureus感染的抗菌藥物有頭孢洛寧、利福昔明、氨芐青霉素、硫酸頭孢喹肟。其中薛梅等[7]采用頭孢洛寧和利福昔明乳房注入劑治療干乳期奶牛乳房炎，治愈率為87.23%和85.29%。馬志明等[8]采用氨芐青霉素治療早期臨床型乳房炎，治愈率為43.75%。魏占勇等[9]采用硫酸頭孢喹肟乳房注入劑治療干乳期奶牛乳房炎，其治愈率為66.7%。這些抗菌藥物對治療奶牛乳腺炎雖具有較高的治愈率，但由于細(xì)胞膜的生物屏障作用，抗菌藥物難以在胞內(nèi)感染靶位達(dá)到有效的治療濃度和時間。其次抗菌藥物對S.aureus毒力因子的作用欠佳，且在抗菌藥物反復(fù)的刺激作用下，細(xì)菌會釋放更多毒素，加重感染[10]。同時，多重耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生也使胞內(nèi)S.aureus感染的治療面臨著更大的挑戰(zhàn)。

1.1.2 胞內(nèi)Salmonella由胞內(nèi)Salmonella引起的雞白痢，可導(dǎo)致雞的受精率和產(chǎn)蛋率下降[11]。據(jù)報道，雞白痢在我國發(fā)病率為20%～40%，致死率為10%～60%[12]。同時，Salmonella在食品生產(chǎn)中的高檢出率，給食品安全和公共衛(wèi)生造成了重大隱患，并引起了廣泛關(guān)注。Salmonella感染動物后，主要侵襲于腸粘膜淋巴上皮細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞，引發(fā)炎癥。且在毒力島編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(tyre three secretion system, TTSS)的調(diào)控下，在囊泡內(nèi)大量繁殖生存，以此來躲避宿主免疫系統(tǒng)的識別與攻擊，并在宿主細(xì)胞內(nèi)釋放多種毒力因子，引發(fā)嚴(yán)重感染[13]。目前，在獸醫(yī)臨床上常用氟苯尼考、卡那霉素、土霉素和呋喃唑酮等抗菌藥物來治療Salmonella感染。劉立軍等[14]用氟苯尼考、卡那霉素、土霉素和呋喃唑酮等藥物治療雞Salmonella病，其治愈率分別為91.7%、85%、80%和53.3%。這些抗菌藥物雖在體外對Salmonella均有一定的效果，但難以跨細(xì)胞擴(kuò)散，因而在體內(nèi)不能有效治療胞內(nèi)Salmonella感染。因此，在選擇有效抗菌藥物的基礎(chǔ)上，急需設(shè)計和研發(fā)新型抗菌藥物遞送系統(tǒng)，提高胞內(nèi)藥物濃度和延長有效時間，改善納米藥物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而提高治療胞內(nèi)Salmonella感染的效果。

1.1.3 胞內(nèi)M.tb由M.tb引起的結(jié)核病是世界危害最大的人獸共患傳染病之一[15]。全球每年約有5000萬的牛感染M.tb，每年造成約30億美元的損失[16]。M.tb通過感染吞噬細(xì)胞，在胞內(nèi)分泌毒力因子并抑制機(jī)體免疫機(jī)制，造成細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性感染[17]。Monika等[18]通過4種藥物(鏈霉素、異煙胼、利福平、乙胺丁醇)對134株M.tb分離菌株的藥敏試驗(yàn)檢測其敏感性，結(jié)果表明M.tb對4種抗菌藥物均敏感。但因牛結(jié)核病的治療費(fèi)用高，且不易根治，故目前在獸醫(yī)臨床上對于牛結(jié)核病以預(yù)防為主[18]。李少晗等[19]所開發(fā)的新型檢測奶牛結(jié)核病技術(shù)，可為防控和凈化牛結(jié)核病提供幫助。孫婭莉[20]認(rèn)為養(yǎng)殖場應(yīng)堅持自繁自養(yǎng)的原則，落實(shí)檢疫與消毒管理等防治策略，可起到凈化結(jié)核病的效果。

1.1.4 胞內(nèi)LM 經(jīng)口感染后的LM在黏附毒力因子(內(nèi)化素)的作用下，入侵宿主腸上皮細(xì)胞，并分泌α-溶血素，介導(dǎo)其從吞噬體中逃逸進(jìn)入到宿主細(xì)胞的胞漿內(nèi)。通過掠奪宿主細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行增殖分化，引起全身性感染[21]。目前，常用克林霉素、青霉素、四環(huán)素、氯霉素等抗菌藥物測定其敏感性。Garedewd等[22]從埃塞俄比亞食品中分離得到LM對青霉素、四環(huán)素和氯霉素的耐藥率分別為66.7%、37.5%和16.6%。Gómez等[23]從西班牙肉產(chǎn)品中分離得到的LM對克林霉素和四環(huán)素分別耐藥率為35.0%和0.5%。由此可見，LM對以上抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。

1.1.5 胞內(nèi)Brucella由Brucella引起的布病是畜牧業(yè)中危害嚴(yán)重的疾病之一。近些年來，布病陽性率逐年升高，如羊發(fā)病率為0.26%～4.11%，牛發(fā)病率為0.51%～1.78%。同時Brucella通過污染肉和乳制品而間接性導(dǎo)致布病發(fā)病率為11.5%。Brucella可在吞噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)大量繁殖后，隨著血液的流動，并分泌多種毒力因子，到達(dá)內(nèi)臟器官，引發(fā)感染[24]。Brucella主要通過消化道、黏膜、呼吸道等途徑進(jìn)入到宿主內(nèi)，黏附于吞噬細(xì)胞。且Brucella細(xì)胞膜上的多糖可抑制吞噬細(xì)胞的凋亡，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，并在宿主細(xì)胞內(nèi)掠奪營養(yǎng)大量繁殖生存，Brucella所釋放內(nèi)毒素與多種毒力因子可引發(fā)菌血癥，嚴(yán)重時會形成膿毒血癥，致使宿主死亡。該菌也可通過感染上皮細(xì)胞，釋放纖維素性膿性分泌物，導(dǎo)致母畜流產(chǎn)[25]。目前，在獸醫(yī)臨床上對待布病主要以預(yù)防為主，因?yàn)殚L時間的使用抗菌藥物會增加耐藥率，且治療成本過高，會給畜牧業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)帶來一定的損失[26-27]。

1.2 專性胞內(nèi)菌 作為專性胞內(nèi)寄生菌的LI能在豬腸道細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，引起一種以回腸和結(jié)腸隱窩內(nèi)未成熟的腸上皮細(xì)胞發(fā)生腺瘤樣增生為特征的豬增生性腸炎(Porcine Proliferative Enteropathy, PPE)，其感染潛伏期長，一般為2～3周[28]。在獸醫(yī)臨床上主要采用氧氟沙星、泰妙菌素等抗菌藥物治療PPE。肖和良等[29]采用注射氧氟沙星注射液和泰妙菌素顆粒劑拌料，其治愈率為89%。龍星[30]采用泰妙菌素治療PPE，其治愈率為100%。這些抗菌藥物雖抑菌效果好，但大多數(shù)藥物由于問世和使用年限較長，其耐藥性已非常嚴(yán)重，導(dǎo)致臨床治療效果不理想。如β-內(nèi)酰胺類藥物雖被廣泛應(yīng)用，但其與細(xì)胞膜的親和力不高，難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，氟喹諾酮類藥物雖能滲入宿主細(xì)胞內(nèi)，且能達(dá)到較高的濃度，但對LI的敏感性不高，所以在獸醫(yī)臨床氟喹諾酮類藥物很少用于治療PPE。

2 納米抗菌藥物治療胞內(nèi)菌感染現(xiàn)狀

目前已有多種抗菌藥物通過納米技術(shù)，被研制成納米抗菌藥物，用來治療胞內(nèi)菌的感染，如圖1所示。不同納米抗菌藥物抗胞內(nèi)菌感染的實(shí)例如表2所示。

表2 不同納米抗菌藥物抗胞內(nèi)菌感染的實(shí)例Tab 2 The examples of different nano-antibacterial agents against intracellular infection

2.1 β-內(nèi)酰胺類 作為許多細(xì)菌感染首選藥物之一的β-內(nèi)酰胺類藥物，已有頭孢曲松鈉殼聚糖硫酸鹽納米膠囊、頭孢曲松鈉殼聚糖納米粒等納米藥物被報道。其中Prakash等[31]制備的頭孢曲松鈉殼聚糖硫酸鹽納米膠囊被用來治療胞內(nèi)Salmonella的感染，將殼聚糖硫酸鹽作為聚合物載藥體時，頭孢曲松鈉殼聚糖硫酸鹽納米膠囊相比游離藥物以更低的劑量有效地殺滅Salmonella。Zaki等[32]所制備的頭孢曲松鈉殼聚糖納米粒，相比游離藥物可顯著降低巨噬細(xì)胞中鼠傷寒沙門菌的數(shù)量，提高頭孢曲松抗胞內(nèi)Salmonella的效果。以上β-內(nèi)酰胺類納米抗菌藥物雖具有改善胞內(nèi)抗生素遞送能力，但難以完全根除胞內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量，且還存在載藥量、穩(wěn)定性、聚合物的降解性和粒徑大小等諸多問題[32]。

2.2 氨基糖苷類 具有廣譜抗菌的氨基糖苷類抗菌藥物，已有慶大霉素-嵌段離聚復(fù)合物、慶大霉素聚乳酸-羥基乙酸等氨基糖苷類納米抗菌藥物被報道。Pothayee等[33]制備的慶大霉素-嵌段離聚復(fù)合物被用來治療胞內(nèi)Brucella的感染，該納米藥物由聚醚-聚丙烯酸酯共聚物與慶大霉素類結(jié)合，形成直徑為170～340 nm的嵌段離聚復(fù)合物。慶大霉素-嵌段離聚復(fù)合物遞送系統(tǒng)可顯著降低鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)Brucella的數(shù)量，增強(qiáng)慶大霉素抗菌活性。Imbuluzqueta[34]所制備的慶大霉素聚乳酸-羥基乙酸可提高慶大霉素在胞內(nèi)的蓄積能力，從而提高了其抗胞內(nèi)LM感染的活性。以上氨基糖苷類納米藥物雖證明了它們的能力，即改善細(xì)胞外和體內(nèi)抗生素遞送的能力，具有很好的穩(wěn)定性和藥物有效載荷，但和β-內(nèi)酰胺類納米藥物一樣，難以完全根除胞內(nèi)菌數(shù)量[35]。且由于氨基糖苷類藥物極性較高，穿透細(xì)胞膜的速率非常緩慢，即使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，也幾乎只保留在溶酶體中，而在溶酶體內(nèi)的氨基糖苷類藥物活性會因溶酶體的低pH值而降低，因此在臨床上難以達(dá)到理想的治療效果。

2.3 四環(huán)素類 目前已有鹽酸多西環(huán)素懸浮劑、負(fù)載四環(huán)素的殼聚糖功能化MoS2納米片、多西環(huán)素脂質(zhì)體等四環(huán)素類納米抗菌藥物被報道。Li等[36]制備的鹽酸多西環(huán)素懸浮劑以0.15 μg/mL的濃度可維持在胞內(nèi)72 h以上，延長了鹽酸多西環(huán)素的有效濃度和體外釋放時間，且消除半衰期增加到9.77 h、平均停留時間增加到18.81 h，生物利用度提高了1.74倍。張旭[37]制備的殼聚糖功能化MoS2納米片可有效抑制S.aureus生物膜的形成并破壞已建立的生物膜，且其最小抑菌濃度比四環(huán)素下降數(shù)十倍，增強(qiáng)了四環(huán)素對于胞內(nèi)S.aureus和胞內(nèi)Salmonella的抗菌活性。Franklin等[38]制備的多西環(huán)素脂質(zhì)體被用來治療胞內(nèi)M.tb的感染，利用硫酸負(fù)載的方法制備多西環(huán)素脂質(zhì)體，該藥物遞送系統(tǒng)可成功靶向巨噬細(xì)胞，且可以在胞內(nèi)停留25～48 h，增強(qiáng)了多西環(huán)素的抗菌活性。以上四環(huán)素類納米藥物雖能夠有較好的抑菌效果，但需頻繁給藥，費(fèi)用高，且四環(huán)素類藥物由于細(xì)胞膜穿透能力差，導(dǎo)致胞內(nèi)藥物濃度達(dá)不到抑菌水平，還易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥[39]。

2.4 大環(huán)內(nèi)酯類目前已有替米考星納米凝膠、替米考星脂質(zhì)體納米粒、替米考星-脂質(zhì)核納米膠囊、克拉霉素脂質(zhì)體等大環(huán)內(nèi)酯類納米抗菌藥物被報道。Zhou等[40]制備的替米考星納米凝膠被用來治療胞內(nèi)S.aureus的感染，采用固體脂質(zhì)納米技術(shù)與水凝膠技術(shù)相結(jié)合制備替米考星納米凝膠，可顯著降低替米考星用量和治療奶牛乳腺炎成本。Rassouli等[41]制備的替米考星納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體和替米考星-脂質(zhì)核納米膠囊相對于對照組替米考星，可有效降低替米考星對S.aureus的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。Li等[42]制備的克拉霉素脂質(zhì)體被用來治療胞內(nèi)S.aureus的感染，利用脂質(zhì)體改善克拉霉素的抗菌活性，可顯耐著降低胞內(nèi)S.aureus載量。以上大環(huán)內(nèi)酯類納米藥物雖有較好的抗菌效果，利用脂質(zhì)體納米技術(shù)來改善抗菌藥物的活性，與傳統(tǒng)藥物相比，具有低毒、減少給藥頻率的優(yōu)勢，但也存在藥物滯留率低(3%～8%)、穩(wěn)定性低，載藥量少、容易被氧化和水解等問題[33]。且大環(huán)內(nèi)酯類藥物在胞內(nèi)蓄積性能較弱和胞內(nèi)酸性條件下活性較差，達(dá)不到理想治療效果。

2.5 氟喹諾酮類 目前已有恩諾沙星固體脂質(zhì)體納米粒、托氟沙星納米乳、復(fù)方恩諾沙星納米乳等氟喹諾酮類納米藥物被報道。其中Xie等[43]制備的恩諾沙星固體脂質(zhì)體納米粒被用來治療胞內(nèi)Salmonella的感染，利用固體脂質(zhì)體納米技術(shù)改善恩諾沙星的抗菌活性，且恩諾沙星固體脂質(zhì)體納米粒是游離藥物胞內(nèi)蓄積能力的27.06～37.71倍，延長了恩諾沙星的抑菌時間，提高了恩諾沙星的抗菌效果。高嫻[44]等制備的托氟沙星納米乳被用來治療胞內(nèi)S.aureus和Salmonella的感染，托氟沙星納米乳成功的解決托氟沙星難溶于水的問題，增強(qiáng)了托氟沙星的抗菌活性。王波臻等[45]制備的復(fù)方恩諾沙星納米乳被用來治療胞內(nèi)S.aureus的感染，采用納米乳技術(shù)和聯(lián)合用藥的方法，該復(fù)方恩諾沙星納米乳可有效滲入皮膚，經(jīng)皮膚給藥后，成功靶向感染細(xì)胞，發(fā)揮更強(qiáng)的抗菌活性。以上氟喹諾酮類納米藥物雖有較好的抗菌效果，可滲入宿主細(xì)胞內(nèi)，且能達(dá)到較高的濃度，但其在胞內(nèi)停留時間短，難以達(dá)到有效抑菌時間。

2.6 其他 目前已有克拉唑銀固體脂質(zhì)體納米粒、鹽酸萬古霉素固體脂質(zhì)體納米粒、利福平固體脂質(zhì)體納米粒、達(dá)托霉素固體脂質(zhì)體納米粒、克拉霉素固體脂質(zhì)體納米粒等納米抗菌藥物被報道。Kalhapur等[46]制備的克拉唑銀固體脂質(zhì)體納米、鹽酸萬古霉素固體脂質(zhì)體納米被用來治療胞內(nèi)S.aureus的感染，通過固體脂質(zhì)體納米載藥系統(tǒng)延長了鹽酸萬古霉素和克拉唑銀對S.aureus的有效抑菌時間，從而提高了其對S.aureus的治療效果。Bibi等[47]制備的利福平固體脂質(zhì)體納米粒被用來治療S.aureus的感染，利用固體脂質(zhì)體納米粒載藥系統(tǒng)將利福平成功釋放于胞內(nèi)，且顯著減少S.aureus的生物被膜的形成，從而有效降低細(xì)菌的致病力。Li等[48]用制備的達(dá)托霉素固體脂質(zhì)體納米粒、克拉霉素固體脂質(zhì)體納米粒被用來治療胞內(nèi)S.aureus的感染，利用脂質(zhì)體納米技術(shù)提高了達(dá)托霉素和克拉霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌活性。以上納米藥物雖有較好的抗菌效果，利用脂質(zhì)體納米技術(shù)改善抗菌藥物的活性，但還缺乏毒性和穩(wěn)定性等相關(guān)研究。

3 結(jié) 語

通過納米技術(shù)所制備的納米抗菌藥物可經(jīng)過多種不同的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，顯著提高抗菌藥物對胞內(nèi)菌感染的治療效果。目前，納米抗菌藥物還存在著生產(chǎn)成本、穩(wěn)定性、安全性等多種問題。故應(yīng)根據(jù)抗菌藥物的理化性質(zhì)，采用合適的高分子載體材料，克服安全性、穩(wěn)定性和載藥量低等問題。深入納米抗菌藥物的相關(guān)研究，如粒徑、電荷和分散系數(shù)等因素對于胞內(nèi)納米抗菌藥物濃度和有效胞內(nèi)停留時間的影響；同時根據(jù)特定胞內(nèi)菌的生存策略，開發(fā)相應(yīng)的納米載藥系統(tǒng)，通過納米抗菌藥物靶向性、持續(xù)性釋放，提高胞內(nèi)藥物濃度和延長有效胞內(nèi)停留時間。此外，應(yīng)加強(qiáng)中草藥納米抗菌藥物對胞內(nèi)菌感染的相關(guān)研究[49]，通過藥動學(xué)-藥效學(xué)模型制定出納米抗菌藥物對胞內(nèi)菌感染的合理給藥方案[50]。相信隨著納米技術(shù)不斷地成熟，更多的納米抗菌藥物將會應(yīng)用到解決胞內(nèi)菌感染的難題上來，提高其治愈率，避免其耐藥性。