尹 暉，王亦琳，葉 妮，孫紅洋，孫 雷，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

近期，貴州首例雞蛋被查出禁用藥氟苯尼考案宣判，雞蛋中的獸藥殘留問題和隨之引發(fā)的食品安全問題再度引起社會(huì)關(guān)注。黏菌素(Colistin)屬于多肽類抗生素，是30多種成分的混合物，主要成分為黏菌素A和黏菌素B[1-2]，其結(jié)構(gòu)為由七環(huán)和末端的三肽組成的十肽菌素，對(duì)革蘭氏陰性桿菌具有較強(qiáng)的抗菌作用，廣泛應(yīng)用于治療豬及禽類腸道大腸桿菌感染，曾經(jīng)作為飼料添加劑還有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用[3]。大量使用黏菌素會(huì)對(duì)動(dòng)物的腎和神經(jīng)系統(tǒng)造成較大的毒害性[4]，并以藥物原形或其代謝產(chǎn)物形式在動(dòng)物可食性組織(如蛋、奶)中形成藥物殘留，影響食品質(zhì)量安全，進(jìn)而影響人類健康，因此歐盟制定了黏菌素在動(dòng)物可食用組織中的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[5]，我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019中規(guī)定的黏菌素最高殘留限量與歐盟一致，其中雞蛋中黏菌素的殘留標(biāo)志物為黏菌素A和黏菌素B之和，最大殘留限量(MRL)為300 μg/kg[6]。目前雞蛋中黏菌素殘留檢測(cè)方法的報(bào)道較少[7]，文獻(xiàn)報(bào)道多為對(duì)其他動(dòng)物組織、牛奶、飼料中黏菌素殘留檢測(cè)方法[8-11]。我國也尚未發(fā)布動(dòng)物性食品中黏菌素殘留量測(cè)定的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。本研究應(yīng)用三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)(QTRAP)，在四極桿的高靈敏度基礎(chǔ)上，增加了線性離子阱增強(qiáng)子離子掃描的定性功能，可以得到能夠二次定性的EPI指紋圖，進(jìn)一步提高了獸藥殘留檢測(cè)中痕量分析定性的準(zhǔn)確度[12]。本研究擬建立一種檢測(cè)雞蛋中黏菌素殘留的UPLC-MS/MS方法，應(yīng)用最新的三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)(QTRAP)，以為雞蛋的食品安全監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備 Shimadzu 30A-6500 QTRAP液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司-美國AB SCIEX公司； XS105DU分析天平，Mettler Toledo公司；AE260電子天平，Mettler Toledo公司；Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)，賀利氏公司；SIR4渦旋混合器，IKA公司；氮吹儀，Jnc公司。

1.2 藥品和試劑 黏菌素A、黏菌素B，純度均>98%。來自日本明治制果藥業(yè)株式會(huì)社；甲酸、乙腈為色譜純，均購自MERCK公司；所用水為超純水。

1.3 空白雞蛋 從超市購買不同批次的雞蛋，經(jīng)檢測(cè)篩選出不含黏菌素的雞蛋，充分勻漿后用作空白雞蛋。

1.4 對(duì)照溶液配制 精密稱取黏菌素A和黏菌素B標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，再用甲醇稀釋成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，流動(dòng)相A相為0.5%甲酸水溶液，B相為0.5%甲酸乙腈溶液，流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution conditions of mobile phase

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-信息依賴掃描-增強(qiáng)子離子掃描(MRM-IDA-EPI)方式采集，電噴霧電壓(IS)為5500 V，離子源溫度為550 ℃，氣簾氣(CUR)為30 psi，碰撞氣(CAD)為高等(High)，輔助氣(GS1)為50 psi，輔助氣(GS2)為60 psi；IDA參數(shù)：動(dòng)態(tài)背景扣除，從不排除之前的目標(biāo)離子，觸發(fā)閾值100 cps；EPI參數(shù)：掃描范圍為80～400m/z，掃描速度10000 Da/s，CE為20 eV，CES為5 eV。待測(cè)藥物定性定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)見表2。

表2 黏菌素定性定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的去簇 電壓(DP)和碰撞能量(CE)Tab 2 Qualitative ions, corresponding quota ions of Colistin and corresponding declustering potential(DP), collision energy(CE)

1.5.3 定性與定量 定性時(shí)試樣溶液中色譜峰的保留時(shí)間，應(yīng)與校正溶液的保留時(shí)間一致，容許偏差為±2.5%，試樣溶液中的離子豐度比應(yīng)與校正溶液的一致，容許偏差符合歐盟2002/657/EC決議要求。線性離子阱獲得增強(qiáng)子離子掃描(EPI)譜圖，應(yīng)與校正溶液的EPI譜圖匹配。定量方法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。

1.5.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取黏菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用0.5%甲酸水溶液稀釋成濃度為10、25、50、100、200和400 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，從中各取1.0 mL，分別加入到空白雞蛋試料經(jīng)提取、凈化和吹干后的殘余物中，充分溶解，過濾，過0.2 μm濾膜后，作為濃度為20、50、100、200、400和800 μg/kg的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定。按所得峰面積與相應(yīng)的對(duì)照溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.5.5 樣品前處理過程 稱取雞蛋(5±0.05)g于50 mL離心管中，加入25%甲醇水溶液25 mL，渦旋2 min，再加入1 mol/L硫酸2 mL，中速振蕩10 min，3000 r/min離心5 min，取上清液。向殘?jiān)屑尤?5%甲醇水溶液15 mL，同樣的方法重復(fù)提取1次，合并上清液。合并的提取液中加入正己烷25 mL，振蕩5 min，5000 r/min離心10 min，棄上層正己烷，并將下層提取液定容至50 mL，備用。Plexa固相萃取柱依次用10 mL甲醇、10 mL水活化，取備用液5 mL過柱，然后用10 mL水洗滌，最后用1%甲酸﹕甲醇(1∶4，V/V)溶液5 mL洗脫，洗脫液于40 ℃水浴氮?dú)獯蹈伞Ｏ驓堄辔镏屑尤?.5%甲酸水溶液1.0 mL，充分溶解，過0.22 μm微孔濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.5.6 方法靈敏度確定 將適量黏菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到空白雞蛋中，經(jīng)上述方法進(jìn)行前處理后，用UPLC-QTRAP檢測(cè)，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對(duì)應(yīng)藥物濃度，S/N>3者為方法的檢測(cè)限，S/N>10者為方法的定量限。

1.5.7 準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白雞蛋試料中分別添加30、150、300 μg/kg三個(gè)不同濃度藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求平均回收率、批內(nèi)、批間RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析 本研究使用MRM-IDA-EPI掃描模式，當(dāng)MRM通道采集的信號(hào)超過100 cps時(shí)觸發(fā)EPI增強(qiáng)離子掃描，在保留時(shí)間2.05～2.17 min左右獲得3個(gè)不同碰撞能量(15、20、25 eV)的EPI譜圖，得到更多子離子信息。將空白雞蛋添加試樣和黏菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的EPI譜圖進(jìn)行比對(duì)，得到6個(gè)匹配的子離子，表明本方法定性高度準(zhǔn)確。黏菌素基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白雞蛋添加試樣的EPI譜圖見圖1～圖2。

1. 黏菌素A; 2. 黏菌素B 1. Colistin A; 2. Colistin B圖1 黏菌素基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的EPI譜圖Fig 1 EPI(Enhanced Product Ion)of Colistin in matrix-matched standard solution

1. 黏菌素A; 2. 黏菌素B 1. Colistin A; 2. Colistin B圖2 空白雞蛋添加黏菌素試樣的EPI譜圖Fig 2 EPI(Enhanced Product Ion)of Colistin in blank eggs spiked samples

2.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照上述系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。從表中可以看出，雞蛋中黏菌素在20～800 μg/kg的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2大于0.990。

2.3 方法靈敏度 按上述方法進(jìn)行處理，當(dāng)添加濃度為30 μg/kg時(shí)，測(cè)得黏菌素的S/N>10，說明方法定量限為30 μg/kg；當(dāng)添加濃度為10 μg/kg時(shí)，測(cè)得黏菌素的S/N>3，說明方法檢測(cè)限為10 μg/kg。30 μg/kg空白雞蛋添加試樣中黏菌素的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖3。

表3 雞蛋中黏菌素基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 3 Matrix-matched standard curve of Colistin in Eggs

2.4 方法的回收率和精密度 在空白雞蛋中添加低、中、高三個(gè)不同濃度的黏菌素進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果匯總見表4?？梢钥闯?，空白雞蛋中黏菌素A和黏菌素B在30～300 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)的回收率為67.2%～106%，批內(nèi)、批間RSD均<20%。

3 討論與結(jié)論

3.1 提取溶劑的選擇 黏菌素屬于多肽類抗生素，分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)氨基，極性較強(qiáng)，易溶于水，可以使用極性溶劑進(jìn)行提取，經(jīng)過比較試驗(yàn)，本研究采用25%甲醇作為樣品的提取液，結(jié)果表明提取充分，回收率較高。

1. 黏菌素A(390.8>101.2); 2. 黏菌素A(390.8>385.0); 3. 黏菌素B(386.2>101.0); 4. 黏菌素B(386.2>380.1) 1. Colistin A(390.8>101.2); 2. Colistin A(390.8>385.0); 3. Colistin B(386.2>101.0); 4. Colistin B(386.2>380.1)圖3 空白雞蛋添加試樣溶液中得到的特征離子質(zhì)量色譜圖(30 μg/kg)Fig 3 Qualitative ions of Colistin in Eggs(30 μg/kg)

表4 空白雞蛋中黏菌素添加回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Recoveries of Colistin in Eggs spiked samples

3.2 凈化條件的選擇 雞蛋樣品中含有蛋白質(zhì)和脂肪等大量雜質(zhì)，會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，本研究通過高速離心去除蛋白質(zhì)等大量雜質(zhì)的干擾，采用正己烷去除脂肪，有效地提取黏菌素藥物殘留。固相萃取法是常見的凈化方式，黏菌素可采用Strata-X[7]或HLB[13]固相萃取柱凈化，考慮到黏菌素分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)氨基，經(jīng)過比較試驗(yàn)，本研究采用聚合陽離子交換Plexa固相萃取柱凈化，可以有效吸附基質(zhì)中的中性和酸性干擾物，降低基質(zhì)效應(yīng)。

3.3 定性分析 根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證黏菌素至少需要3個(gè)識(shí)別點(diǎn)(IP)，在大多數(shù)檢測(cè)方法中，一般選定母離子及兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定性定量依據(jù)，母離子是1個(gè)IP點(diǎn)，兩個(gè)子離子分別是1.5個(gè)IP點(diǎn)，共4個(gè)IP點(diǎn)，滿足檢測(cè)要求。本研究采用QTRAP質(zhì)譜儀特有的MRM-IDA-EPI掃描模式，對(duì)目標(biāo)母離子進(jìn)行EPI增強(qiáng)子離子掃描，在保留時(shí)間左右獲得更多子離子的信息，得到黏菌素子離子的特征性EPI指紋譜圖，該譜圖具有高度特異性，將空白雞蛋添加試樣和黏菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的EPI譜圖進(jìn)行比對(duì)后，進(jìn)行二次定性，得到母離子和6個(gè)匹配的子離子，共10個(gè)IP，極大地提高了定性的準(zhǔn)確性。

本研究利用超高效液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)建立了雞蛋中黏菌素的殘留檢測(cè)方法，前處理方法簡(jiǎn)便快速，定量準(zhǔn)確，EPI指紋圖二次定性特異性強(qiáng)，極大提高了定性的準(zhǔn)確性，為雞蛋的食品質(zhì)量安全監(jiān)控提供了重要的技術(shù)支持。