林小英，任星橋，曾凡群，黃 波，李葉麗，楊丹莉

(遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

心肌纖維化可以降低心臟的順應(yīng)性，抑制心臟功能，引發(fā)心源性猝死[1]。由心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)代謝失衡是引發(fā)心肌纖維化的重要原因[2]。α平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)是成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)是調(diào)控心肌ECM合成與降解的重要酶系，其相互作用與ECM的動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)[4- 5]。

淫羊藿苷(icariin，ICA)是中藥淫羊藿的主要活性成分，具有改善高血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗心肌缺血等作用[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ICA可以調(diào)控MMP-9和TIMP-1的mRNA表達(dá)，抑制自發(fā)性高血壓大鼠的心室重構(gòu)[7]。異丙腎上腺素(ISO)是公認(rèn)的制備左心室重構(gòu)、心肌纖維化動(dòng)物模型的工具藥[8, 9]。但I(xiàn)CA對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌纖維化的干預(yù)鮮有報(bào)道。本研究借助造模工具藥ISO，觀察ICA對(duì)C57BL/6小鼠左心室心肌纖維化的干預(yù)作用，并基于α-SMA，MMP-2/9、TIMP-1探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物及試劑C57BL/6小鼠，♂，7周齡，SPF級(jí)，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014。ISO(貨號(hào)：HY-B0468，MCE公司)；ICA(純度≥98%，批號(hào)：FY17420615，購(gòu)于江蘇省南京澤朗醫(yī)藥有限公司)；氯沙坦(貨號(hào)：HY-17512A，MCE公司)；Masson三色染色液(貨號(hào)：G1345，Solarbio公司)；α-SMA兔抗小鼠抗體(貨號(hào)：55135-1-AP，Proteintech公司)；MMP-2兔抗小鼠抗體(貨號(hào)：D261446，BBI Life Sciences公司)；MMP-9兔抗小鼠抗體(貨號(hào)：10375-2-AP，Proteintech公司)；TIMP-1兔抗小鼠抗體(貨號(hào)：bs-0415R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；GAPDH兔抗小鼠抗體(貨號(hào)：10494-1-AP，Proteintech公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體(貨號(hào)：S0001，Affinity公司)；ECL化學(xué)發(fā)光劑(貨號(hào)：180-501，Tanon公司)

1.2 儀器Vevo 2100小動(dòng)物超聲檢測(cè)儀(加拿大VisualSonics公司)；RM2245組織切片機(jī)(德國(guó)LeicaBiosystems公司)；BX43顯微鏡(日本Olympus公司)；Eppendorf 5417R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Supply Mini-Protean3電泳儀、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、ChemiDoc成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模和給藥60只♂ C57BL/6小鼠，于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白組(Control)、模型組(ISO)、ICA低劑量組(15 mg·kg-1，ICA-L)、ICA中劑量組(30 mg·kg-1，ICA-M)、ICA高劑量組(60 mg·kg-1，ICA-H)和氯沙坦組(9 mg·kg-1，LOS)，每組各10只。ISO組、ICA組和LOS組于頸背部皮下注射異丙腎上腺素(5 mg·kg-1)誘導(dǎo)心肌纖維化小鼠模型，Control組注射等體積生理鹽水。ICA組按劑量灌胃ICA，LOS組灌胃氯沙坦，Control組和ISO組灌胃等體積雙蒸水。造模和給藥每日1次，持續(xù)14 d。

1.4 檢測(cè)小鼠左心室功能造模及給藥14 d后，禁食12 h，稱小鼠體質(zhì)量，常規(guī)性麻醉后剃除小鼠胸毛，將其固定在小動(dòng)物超聲檢測(cè)臺(tái)，在胸腔上涂抹適量超聲耦合劑，將MS400探頭置于小鼠左胸前，采用Vevo2100系統(tǒng)檢測(cè)小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)。

1.5 計(jì)算小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)打開(kāi)小鼠胸腔，取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈殘留血液，濾紙吸干后稱重，計(jì)算小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)(HMI)，HMI=心臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.6 觀察小鼠左心室膠原纖維沉積情況分離小鼠左心室，取左心室組織，使用4%甲醛溶液固定24 h后脫水，石蠟包埋，組織切片機(jī)切片，進(jìn)行Masson染色，用光學(xué)顯微鏡觀察小鼠左心室膠原纖維沉積情況。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，用ImageJ軟件計(jì)算小鼠左心室心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，取平均值。CVF/%=膠原面積/視野總面積×100%。

1.7 檢測(cè)小鼠左心室α-SMA、MMP-2、MMP-9和TIMP-1的蛋白表達(dá)取小鼠左心室組織50 mg，剪碎，加500 μL RIPA裂解液和5 μL PMSF溶液，勻漿器冰上勻漿，靜置30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液。BCA試劑盒測(cè)定上清液蛋白含量，配制8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，半干轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，8%脫脂牛奶室溫封閉2.5 h，TBST洗PVDF膜，4 ℃過(guò)夜孵育抗體：α-SMA(1 ∶2 000)、MMP-2(1 ∶1 000)、MMP-9(1 ∶1 000)、TIMP-1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)，TBST洗PVDF膜，室溫孵育山羊抗兔抗體(1 ∶5 000)1 h，TBST洗PVDF膜，ECL發(fā)光劑顯色，ChemiDoc成像系統(tǒng)獲取圖像。

2 結(jié)果

2.1 小鼠左心室功能變化與Control組相比，ISO組小鼠LVEF降低31.8%(P<0.05)，LVFS降低48.9%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠LVEF分別升高28.2%、38.5%、40.7%(P<0.05)，LVFS分別升高42.5%、54.7%、63.8%(P<0.05)，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Effects of ICA on left ventricular function

2.2 小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)變化與Control組相比，ISO組小鼠HMI升高16.2%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠HMI分別降低7.2%、10.5%、11.8%(P<0.05)，見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Effects of ICA on HMI of

2.3 小鼠左心室膠原纖維沉積情況與Control組相比，ISO組小鼠左心室細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維沉積明顯增加，CVF增大(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠左心室細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維沉積明顯減少，CVF減小(P<0.05)。其中，以ICA-H和LOS組最為明顯，見(jiàn)Fig 3。

Fig 3 Effects of ICA on collagen deposition of left ventricle in

2.4 ICA對(duì)小鼠左心室α-SMA蛋白表達(dá)的影響與Control組相比，ISO組小鼠左心室α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)49.8%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠左心室α-SMA蛋白表達(dá)分別下調(diào)18.9%、22.6%、29.1%(P<0.05)，見(jiàn)Fig 4。

Fig 4 Effects of ICA on α-SMA protein expression in left ventricle of

2.5 ICA對(duì)小鼠左心室MMP-2蛋白表達(dá)的影響與Control組相比，ISO組小鼠左心室MMP-2蛋白表達(dá)下調(diào)45.8%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠左心室MMP-2蛋白表達(dá)分別上調(diào)52.3%、63.9%、86.5%(P<0.05)，見(jiàn)Fig 5。

Fig 5 Effects of ICA on MMP-2 protein expression in left ventricle of

2.6 ICA對(duì)小鼠左心室MMP-9蛋白表達(dá)的影響與Control組相比，ISO組小鼠左心室MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)66.8%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠左心室MMP-9蛋白表達(dá)分別下調(diào)26.6%、43.2%、59.7%(P<0.05)，見(jiàn)Fig 6。

Fig 6 Effects of ICA on MMP-9 protein expression in left ventricle of

2.7 ICA對(duì)小鼠左心室TIMP-1蛋白表達(dá)的影響與Control組相比，ISO組小鼠左心室TIMP-1蛋白表達(dá)下調(diào)61.9%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠左心室TIMP-1蛋白表達(dá)分別上調(diào)99.6%、137.4%、192.9%(P<0.05)，見(jiàn)Fig 7。

Fig 7 Effects of ICA on TIMP-1 protein expression in left ventricle of

3 討論

心肌纖維化是導(dǎo)致心功能障礙、心源性猝死的潛在危險(xiǎn)因素，是高血壓心臟病、缺血性心肌病等的重要病理特征[1]。減輕心肌纖維化可以有效改善心臟功能障礙。研究表明，ISO以5 mg·kg-1每日頸背部皮下注射持續(xù)14 d，可以誘導(dǎo)小鼠心肌纖維化，導(dǎo)致心室收縮和舒張功能發(fā)生障礙[9]。氯沙坦是臨床常用的AT1受體拮抗劑，具有減緩心肌纖維化的作用，在本研究中作為陽(yáng)性對(duì)照藥[10]。本研究中，ISO干預(yù)14 d后，小鼠的LVEF和LVFS明顯降低，HMI明顯升高，左心室細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維沉積明顯增多，CVF增大，提示心肌纖維化模型構(gòu)建成功；給予ICA(30、60 mg·kg-1)14 d后，小鼠LVEF和LVFS明顯升高，HMI明顯降低，小鼠左心室細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維沉積明顯減少，CVF減?。慌c氯沙坦組相比較，ICA 60 mg·kg-1組對(duì)上述指標(biāo)的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上，提示ICA能夠改善ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化。

心肌ECM對(duì)心臟維持正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，心肌纖維化的發(fā)展過(guò)程也是心肌ECM的病理性重構(gòu)過(guò)程[11]。心肌受損后，心肌成纖維細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的作用下轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[12]。與成纖維細(xì)胞相比，肌成纖維細(xì)胞分泌ECM的功能顯著增強(qiáng)[13]。ECM過(guò)度沉積會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化，使心臟功能減退。α-SMA是成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，ISO使小鼠左心室α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)；ICA(30、60 mg·kg-1)能抑制ISO所致的小鼠左心室α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)；與氯沙坦組相比較，ICA 60 mg·kg-1組對(duì)α-SMA蛋白表達(dá)的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合ICA抑制ISO所致小鼠心肌纖維化的效應(yīng)，提示ICA可能通過(guò)下調(diào)α-SMA的蛋白水平，抑制小鼠心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

MMPs是一類需要依賴Zn2+、Ca2+等金屬離子發(fā)揮催化活性的內(nèi)源性肽鏈內(nèi)切酶，能夠通過(guò)調(diào)控ECM代謝，對(duì)損傷的心肌組織進(jìn)行修復(fù)和重建[4]。MMPs包括膠原酶、明膠酶、間質(zhì)溶解素、基質(zhì)溶解素、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶和其他酶類。明膠酶包括MMP-2和MMP-9。TIMPs可以通過(guò)抑制MMPs的活性，調(diào)控ECM的合成與降解[5]。正常情況下，心肌ECM的合成與降解處于平衡狀態(tài)。當(dāng)MMPs與TIMPs表達(dá)失衡會(huì)導(dǎo)致ECM合成與降解異常，引起心肌纖維化。值得注意的是：一方面MMPs促使ECM中的膠原蛋白降解，繼而降解的膠原蛋白被缺乏連接結(jié)構(gòu)的纖維性間質(zhì)所取代，纖維膠原網(wǎng)絡(luò)被破壞，導(dǎo)致心肌纖維化[14]；另一方面，當(dāng)MMPs的表達(dá)過(guò)低，ECM的合成大于降解，繼而導(dǎo)致ECM過(guò)量沉積，也促使心肌纖維化的發(fā)生[14]。

TIMP-1對(duì)MMP-9具有特殊的親和力，能夠抑制MMP-9的活性。Fu等[15]證實(shí)自發(fā)性高血壓大鼠左心室組織的MMP-9表達(dá)上調(diào)、TIMP-1表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致心肌纖維化。Ma等[16]發(fā)現(xiàn)ISO通過(guò)下調(diào)MMP-2的表達(dá)促使小鼠心肌纖維化的發(fā)生。在本研究中，ICA(30、60 mg·kg-1)可以抑制小鼠ISO所誘導(dǎo)的左心室MMP-2蛋白表達(dá)的下調(diào)、MMP-9蛋白表達(dá)的上調(diào)及TIMP-1蛋白表達(dá)的下調(diào)；與氯沙坦組相比較，ICA 60 mg·kg-1組對(duì)以上蛋白表達(dá)的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合以上資料，提示ICA一方面可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9和TIMP-1的表達(dá)失衡，抑制心肌纖維膠原網(wǎng)絡(luò)被破壞，另一方面可能通過(guò)促進(jìn)MMP-2的表達(dá)，抑制ECM過(guò)量沉積，改善ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化。

綜上所述，ICA能夠改善ISO所誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化，其機(jī)制可能與調(diào)控α-SMA、MMPs/MMP-1的蛋白表達(dá)有關(guān)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)給予幫助的李意奇和皮婷婷表示感謝！)