黃茸茸，陸松俠，孫玲玲，張 晗，丁世欣，李維祖

(1. 安徽新華學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230088；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，抗炎免疫藥理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230032)

近年來(lái)，受人口老齡化、飲食習(xí)慣改變等多因素影響，卒中類疾病的發(fā)病率、致殘致死率逐年升高。其中缺血性腦卒中主要由腦部血液供應(yīng)不足導(dǎo)致，治療策略常通過(guò)溶栓治療以恢復(fù)血流灌注，再灌注過(guò)程雖可挽救缺血半暗帶內(nèi)的瀕死腦神經(jīng)細(xì)胞，但同時(shí)也可加重腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，甚至致死。導(dǎo)致腦缺血/再灌注損傷的機(jī)制較為復(fù)雜，且互為因果，已有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其可能與自由基生成增多、炎性損傷、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞鈣超載及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制有關(guān)[1]，但尚未完全闡明，仍需進(jìn)一步探究。近年有研究表明，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)與腦缺血/再灌注損傷的關(guān)系較為密切。NADPH氧化酶2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2，NOX2)是腦中活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成的主要來(lái)源，而ROS的大量生成是激活炎癥小體的主要途徑。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域NOD樣受體蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1，NLRP1)炎癥小體的活化能調(diào)控炎癥因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟和分泌，從而導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)炎性損傷[2]。因此，NOX2-NLRP1信號(hào)通路可為篩選治療腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI)藥物的重要靶點(diǎn)。

目前臨床尚無(wú)有效防治CIRI的藥物，這使得從中藥材資源中尋找有效的天然活性成分成為研究熱點(diǎn)。人參(ginseng)為五加科草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，因?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具備較為廣泛的雙向調(diào)節(jié)作用，其保健及藥用價(jià)值較高。人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)為四環(huán)三萜類衍生物，是人參中的主要生物活性成分，有最新研究報(bào)道[3-6]，人參皂苷Rg1對(duì)中樞神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、抑郁癥、癲癇及酒精性肝病等疾病均有一定治療保護(hù)作用，但其對(duì)腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制未明，有待進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外研究NOX2-NLRP1信號(hào)通路在PC12細(xì)胞氧糖剝奪/再?gòu)?fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)損傷中的作用及Rg1的干預(yù)作用，以尋證防治腦缺血/再灌注損傷的新靶點(diǎn)及有效防治藥物，并為人參藥材的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞PC12細(xì)胞株，安徽醫(yī)科大學(xué)藥理教研室細(xì)胞庫(kù)凍存惠贈(zèng)。

1.2 藥品和試劑人參皂苷Rg1(≥98%)，成都德斯特生物技術(shù)有限公司，DR0009；Apocynin，德國(guó)Merck Millipore公司，178385-1GM；Tempol，德國(guó)Merck Millipore公司，581500-500MG；RIPA細(xì)胞裂解液，江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，P0013B；DMEM高糖培養(yǎng)液，美國(guó)Hyclone公司，SH30022.01B；胎牛血清，杭州天杭生物科技有限公司，11011-8611；乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，KGT02448；活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，KGAF018；白介素-1β(IL-1β)檢測(cè)試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，3748；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司，F(xiàn)XP018-050；無(wú)血清細(xì)胞凍存液，蘇州新賽美生物科技有限公司，C40100。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器5% CO2恒溫培養(yǎng)箱(香港Heal Force公司)；無(wú)菌超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；三氣培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；IX-71 熒光倒置顯微鏡(日本Olympus有限公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；PowerPac 200 Western blotting電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)；Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物技術(shù)有限公司)；高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)(美國(guó)MD公司)。

2 方法

2.1 PC12細(xì)胞OGD/R模型的建立PC12細(xì)胞在DMEM高糖培養(yǎng)基中長(zhǎng)至約70%時(shí)，將其接種至培養(yǎng)板。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，除去DMEM高糖培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，更換為無(wú)糖Earle平衡鹽溶液后置于三氣培養(yǎng)箱(含1% O2+5% CO2+94% N2)中，37 ℃培養(yǎng)6 h，即缺氧缺糖6 h，之后再換回DMEM高糖無(wú)血清培養(yǎng)基于常氧培養(yǎng)箱中復(fù)氧24 h建立OGD/R模型。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥實(shí)驗(yàn)分為6組，即空白對(duì)照組、OGD/R模型組、OGD/R+Tempol(50 μmol·L-1)組、OGD/R+Apocynin(50 μmol·L-1)組、OGD/R+Rg1(5 μmol·L-1)組、OGD/R+Rg1(10 μmol·L-1)組。空白對(duì)照組不做處理正常培養(yǎng)，其余各組細(xì)胞均缺氧缺糖處理6 h，再?gòu)?fù)氧復(fù)糖24 h制作OGD/R細(xì)胞模型。各給藥組均需在造模前分別加藥孵育2 h。

2.3 DCFH-DA法檢測(cè)活性氧ROS生成各組PC12細(xì)胞再?gòu)?fù)氧復(fù)糖24 h后，吸取細(xì)胞上清于-20 ℃存放備用。用PBS清洗細(xì)胞3次，然后將DCFH-DA儲(chǔ)存液和PBS緩沖液以1 ∶1 000混合配制成工作液，每個(gè)培養(yǎng)孔加1 mL，搖床上搖晃20 min，再將培養(yǎng)板中的工作液吸出，用PBS清洗培養(yǎng)板3次，5 min/次，將培養(yǎng)板置于細(xì)胞高內(nèi)涵成像系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行拍攝并分析ROS的生成量。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況各組PC12細(xì)胞再?gòu)?fù)氧復(fù)糖24 h后棄去培養(yǎng)基。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入10 μL/孔Annexin V-FITC試劑混勻后，于室溫避光孵育15 min，再加入5 μL碘化丙錠溶液(PI)后混勻避光孵育5 min，再用PBS洗滌細(xì)胞2次，在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的凋亡情況并拍照，綠色熒光顯示早期凋亡細(xì)胞，紅色熒光顯示晚期凋亡細(xì)胞。

2.5 細(xì)胞上清中LDH活力與IL-1β的含量檢測(cè)各組PC12細(xì)胞再?gòu)?fù)氧復(fù)糖24 h后取上清，于4 ℃離心10 min后，用LDH檢測(cè)試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀在440 nm檢測(cè)各組上清吸光度值，計(jì)算LDH活力；采用ELISA法按試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各組上清吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各組細(xì)胞上清中IL-1β的濃度值。

2.6 Western blot法檢測(cè)NOX2、p22phox、p47phox、NLRP1、ASC、Caspase-1、PSD95、Tau、p-Tau的蛋白表達(dá)水平取給藥預(yù)處理后缺氧缺糖6 h，再?gòu)?fù)氧24 h后的各組PC12細(xì)胞，吸出培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗3次后加入1 mL PBS緩沖液，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，然后將各組細(xì)胞懸浮液分別置于離心管中，4 ℃預(yù)冷的冰凍離心機(jī)1 200 r·min-1離心15 min，棄去上清，每管加入細(xì)胞裂解液200 μL，每10 min于渦旋儀上震蕩10 s，共3次。然后放入冰凍離心機(jī)中1 200 r·min-1，離心15 min，取上清作為細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定各組蛋白濃度，再加入loading buffer煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完成后于5%脫脂奶粉封閉液中室溫下孵育1 h，再加一抗：NOX2(Abcam公司，ab80508，1 ∶1 000)、p22phox(Bioworld公司，BS60290，1 ∶1 000)、p47phox(Bioworld公司，BS6181，1 ∶1 000)、NLRP-1(Abcam公司，ab98181，1 ∶1 000)、Caspase-1(Bioworld公司，BS5641，1 ∶500)、ASC(Bioss公司，bs-6741R，1 ∶1 000)、PSD95 (Servicebio公司，GB11277，1 ∶1 000)、Tau(Servicebio公司，GB111609，1 ∶1 000)、p-Tau(Abcam公司，ab92676，1 ∶1 000)和β-actin(Servicebio公司，GB12001，1 ∶1 000)于4 ℃下孵育過(guò)夜后，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，10 min/次，加入HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育1 h，再用TBST緩沖液洗滌3次，10 min/次。最后將PVDF膜浸泡于ECL化學(xué)發(fā)光液中3 min，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。使用ImageJ軟件分析各目的蛋白的灰度值，并以β-actin的表達(dá)作為參照，計(jì)算各目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 人參皂苷Rg1對(duì)OGD/R后PC12細(xì)胞上清中LDH活性的影響細(xì)胞上清中LDH的活性(即釋放量)與細(xì)胞損傷密切相關(guān)。由Fig 1結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組PC12細(xì)胞上清的LDH釋放量顯著增加(P<0.01)；而與模型組相比，Tempol、Apocynin、Rg1(5、10 μmol·L-1)藥物組細(xì)胞上清的LDH釋放均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。提示人參皂苷Rg1可明顯減輕OGD/R處理對(duì)PC12細(xì)胞的損傷。

3.2 人參皂苷Rg1對(duì)OGD/R后PC12細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡是腦缺血/再灌注損傷的重要形式，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染法觀察人參皂苷Rg1對(duì)OGD/R處理PC12細(xì)胞凋亡的影響。Fig 2結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞少見(jiàn)；但與其相比，OGD/R模型組早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)；而與模型組比較，Tempol、Apocynin和Rg1(5、10 μmol·L-1)藥物預(yù)處理均能明顯減少OGD/R后早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞(P<0.05或P<0.01)。表明人參皂苷Rg1可通過(guò)抑制凋亡減輕OGD/R處理對(duì)PC12細(xì)胞的損傷。

Fig 1 Effect of ginsenoside Rg1 on activity of LDH after OGD/R in PC12 cells n=4)

Fig 3 Effect of ginsenoside Rg1 on ROS production after OGD/R in PC12 cells n=3)

3.3 人參皂苷Rg1對(duì)OGD/R后PC12細(xì)胞ROS生成的影響ROS大量生成導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷是腦缺血/再灌注損傷的重要機(jī)制之一。因此本研究使用DCFH-DA熒光染色法檢測(cè)OGD/R后PC12細(xì)胞的ROS水平。如Fig 3結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，有少量ROS生成；但模型組細(xì)胞則出現(xiàn)形態(tài)變圓，大小不一，ROS生成明顯增加(P<0.01)；而與模型組相比，Tempol、Apocynin和Rg1(5、10 μmol·L-1)藥物處理組的細(xì)胞狀態(tài)有明顯改善，ROS的水平明顯降低(P<0.01)。結(jié)果提示人參皂苷Rg1可通過(guò)抑制ROS生成減輕OGD/R對(duì)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

3.4 人參皂苷Rg1對(duì)OGD/R后PC12細(xì)胞中NADPH氧化酶2相關(guān)蛋白NOX2、p22phox和p47phox表達(dá)的影響NADPH氧化酶2是神經(jīng)元中生成ROS的重要酶系統(tǒng)，因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)OGD/R后PC12細(xì)胞中ROS生成是否與此有關(guān)。Fig 4所示，空白對(duì)照組中NOX2、p22phox和p47phox蛋白表達(dá)水平較低，但與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞的NOX2、p22phox和p47phox蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05或P<0.01)；而與模型組比較，Tempol處理對(duì)p22phox與p47phox蛋白的表達(dá)有抑制作用(P<0.05)，而對(duì)NOX2的蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響；但Apocynin和Rg1(5、10 μmol·L-1)處理均可明顯降低OGD/R后PC12細(xì)胞中NOX2、p22phox和p47phox的蛋白表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷Rg1可通過(guò)下調(diào)NADPH氧化酶2表達(dá)抑制OGD/R后PC12細(xì)胞中ROS生成。

Fig 4 Effect of Rg1 on expressions of NOX2, p22phox and p47phox after OGD/R in PC12 cells n=3)

3.5 人參皂苷Rg1對(duì)OGD/R后PC12細(xì)胞及上清中IL-1β含量的影響Fig 5結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞中及上清中IL-1β的水平均較低，但與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中及上清中IL-1β的水平明顯升高(P<0.05)；而與模型組相比，Tempol、Apocynin、Rg1(5, 10 μmol·L-1)組細(xì)胞及上清中IL-1β的含量水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果提示，人參皂苷Rg1可通過(guò)抑制炎癥因子IL-1β生成減輕OGD/R對(duì)PC12細(xì)胞的炎性損傷。

Fig 5 Effect of ginsenoside Rg1 on IL-1β level after OGD/R in PC12 cells and in supernatant n=3)

3.6 人參皂苷Rg1對(duì)OGD/R后PC12細(xì)胞中NLRP1炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP1、ASC及Caspase-1表達(dá)的影響Fig 6結(jié)果顯示，空白對(duì)照組PC12細(xì)胞中NLRP1、ASC及Caspase-1表達(dá)水平較低，但與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞的NLRP1、ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05或P<0.01)；而與模型組相比，Tempol、Apocynin和Rg1(5、10 μmol·L-1)處理均可使NLRP1炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05或P<0.01)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷Rg1可通過(guò)抑制NLRP1炎癥小體激活減輕OGD/R處理后PC12細(xì)胞的炎癥損傷。

3.7 人參皂苷Rg1對(duì)OGD/R后PC12細(xì)胞中PSD95、Tau及p-Tau蛋白表達(dá)的影響PSD95是突觸后致密區(qū)的支架蛋白，p-Tau水平與神經(jīng)纖維纏結(jié)密切相關(guān)，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了OGD/R對(duì)PC12細(xì)胞PSD95和p-Tau水平的影響。如Fig 7結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中的PSD95蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，p-Tau蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，而Tau蛋白的表達(dá)則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但與模型組相比，Tempol、Apocynin和Rg1(5、10 μmol·L-1)處理組均可使PSD95蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05或P<0.01)，使p-Tau蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05或P<0.01)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷Rg1可明顯減輕OGD/R所致的神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)性損傷；而其能明顯抑制磷酸化Tau蛋白水平，表明人參皂苷Rg1還可減輕OGD/R處理PC12細(xì)胞所致的神經(jīng)毒性反應(yīng)。

Fig 6 Effect of Rg1 on expressions of NLRP1, ASC and Caspase-1 after OGD/R in PC12 cells n=3)

Fig 7 Effect of Rg1 on expression of PSD95, Tau and p-Tau after OGD/R in PC12 cells n=3)

4 討論

腦缺血是中老年群體中常見(jiàn)的疾病之一，大量研究發(fā)現(xiàn)[7]，腦缺血/再灌注后可能會(huì)引發(fā)更加嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙及腦組織損傷，被稱為“腦缺血/再灌注損傷”，因其與臨床多種腦血管病密切相關(guān)，已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。CIRI損傷機(jī)制十分復(fù)雜，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子及其調(diào)節(jié)發(fā)生變化，且多種因素參與了缺血/再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞損傷，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞等，最終導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)元死亡。

OGD/R模型是一種體外中風(fēng)模型，與腦缺血/再灌注的體內(nèi)病理模型相似。PC12細(xì)胞來(lái)源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤髓質(zhì)，是研究神經(jīng)元功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和評(píng)價(jià)藥物功效的常用細(xì)胞類型，本實(shí)驗(yàn)研究即是采用PC12細(xì)胞建立體外OGD/R模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OGD/R模型組細(xì)胞變圓，且大小不一，并出現(xiàn)變性壞死及凋亡等損傷；而Tempol、Apocynin和Rg1(5、10 μmol·L-1)藥物組均可不同程度的改善OGD/R導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。

腦缺血會(huì)導(dǎo)致大量活性氧(ROS)生成，且腦組織復(fù)氧復(fù)糖也會(huì)刺激ROS的過(guò)度釋放來(lái)參與腦缺血/再灌注性損傷。ROS生成過(guò)多會(huì)破壞生物膜導(dǎo)致乳酸脫氫酶(LDH)釋放增加，因此，LDH釋放是評(píng)價(jià)神經(jīng)元損傷程度的重要指標(biāo)之一[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，Tempol、Apocynin和Rg1(5、10 μmol·L-1)藥物組能明顯減少ROS生成及上清中LDH活性，說(shuō)明經(jīng)藥物干預(yù)可明顯減輕OGD/R后PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。細(xì)胞凋亡是由基因控制的自主有序的死亡，腦缺血過(guò)程中腫瘤壞死因子和自由基的產(chǎn)生，生長(zhǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的缺乏，DNA損傷等多種誘因可能觸發(fā)細(xì)胞凋亡[9]；且另有研究表明，強(qiáng)效抗氧化劑對(duì)大腦I/R導(dǎo)致的神經(jīng)凋亡具有顯著抑制作用[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OGD/R刺激可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而抗氧劑Tempol、NADPH氧化酶2抑制劑Apocynin及人參皂苷Rg1均可有效逆轉(zhuǎn)OGD/R導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表明，Rg1對(duì)OGD/R導(dǎo)致的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有較好的保護(hù)作用。

有研究顯示，廣泛分布于腦神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞等的NADPH氧化酶是腦缺血/再灌注時(shí)ROS的重要來(lái)源，在CIRI損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NADPH氧化酶催化亞基gp91phox/NOX2及其同源物統(tǒng)稱為NOX家族蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，NOX家族中的NOX2與中風(fēng)后腦內(nèi)ROS的生成密切相關(guān)，且敲除NADPH氧化酶基因或使用NADPH氧化酶抑制劑均可明顯減輕氧化損傷。另有實(shí)驗(yàn)研究顯示[12]，NOX2抑制劑(gp91ds-tat)可明顯抑制I/R誘導(dǎo)的ROS的釋放，并減少腦梗死體積，減輕神經(jīng)凋亡和血腦屏障損傷，因此，NADPH氧化酶成為治療缺血性腦血管病的重要靶點(diǎn)。Apocynin又稱為羅布麻寧、茶葉花寧、夾竹桃麻素等，已有研究報(bào)道，Apocynin能夠降低腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺陷及細(xì)胞凋亡率，從而減輕CIRI損傷，其機(jī)制可能與抑制NADPH酶的活化有關(guān)[13]。Tempol (4-Hydroxy-TEMPO)是一種超氧化物清除劑，具有較好的神經(jīng)保護(hù)、抗炎和鎮(zhèn)痛效果。有研究報(bào)道，其可有效清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生氧化性損傷，對(duì)改善腦內(nèi)細(xì)胞炎癥反應(yīng)有較明顯的作用[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Tempol、Apocynin和Rg1(5、10 μmol·L-1)組可明顯降低OGD/R后PC12細(xì)胞的NOX2、p22phox和p47phox蛋白表達(dá)，同時(shí)降低OGD/R后細(xì)胞ROS的釋放，提示人參皂苷Rg1可能是通過(guò)抑制NOX2的活性來(lái)減少OGD/R誘導(dǎo)的ROS生成，同時(shí)提示抑制NOX2的活性可能是抑制細(xì)胞凋亡和改善CIRI損傷的有效策略之一。

在腦缺血/再灌注損傷的眾多機(jī)制中，炎癥機(jī)制已得到公認(rèn)。已有大量實(shí)驗(yàn)證明，IL-1β是最重要的細(xì)胞因子，其參與腦缺血/再灌注性損傷，且可能與炎癥小體NLRP-1密切相關(guān)[15]。炎癥小體NLRP-1主要在大腦、血液和胸腺等組織中表達(dá)，其主要由NLRP-1、ASC、Caspase-1三種蛋白構(gòu)成。NLRP-1通過(guò)接頭蛋白ASC招募Pro-caspase-1，Caspase-1激活后可對(duì)pro-IL-1β等細(xì)胞因子前體進(jìn)行加工，使其成熟并釋放到胞外，誘發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。另有研究報(bào)道顯示，NLRP-1可能介導(dǎo)了腦缺血后細(xì)胞損傷的相關(guān)炎癥反應(yīng)，而ROS是觸發(fā)缺血性中風(fēng)后NLRP-1炎癥小體通路激活的主要信號(hào)[16]。因此，抑制NLRP-1炎癥小體活化也成為防治腦缺血/再灌注性損傷的重要策略之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OGD/R后可明顯增加PC12細(xì)胞中NLRP-1，ASC，Caspase-1和IL-1β相關(guān)蛋白表達(dá)，提示NLRP-1介導(dǎo)了OGD/R細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)則進(jìn)一步顯示，Tempol，Apocynin和Rg1(5、10 μmol·L-1)均能降低OGD/R后PC12細(xì)胞的NLRP1，ASC，Caspase-1和 IL-1β 蛋白表達(dá)水平，同時(shí)降低細(xì)胞上清中IL-1β的含量。這說(shuō)明Rg1可能是通過(guò)下調(diào)NOX2-NLRP1通路來(lái)減輕OGD/R導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。

腦缺血/再灌注損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙是腦卒中治療中亟待解決的難點(diǎn)問(wèn)題，而突觸可塑性是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶等功能的重要神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)。突觸后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD95)是突觸后致密區(qū)的支架蛋白，有研究表明，PSD95表達(dá)異常與學(xué)習(xí)記憶功能障礙密切相關(guān)，當(dāng)腦缺血/再灌注引發(fā)腦組織神經(jīng)功能障礙時(shí)，PSD95的表達(dá)被明顯抑制[17]。Tau蛋白是一種相對(duì)分子量較小的微管相關(guān)蛋白，在正常生理?xiàng)l件下可促進(jìn)微管蛋白聚集成微管并增強(qiáng)其穩(wěn)定性，在維持神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及軸突信息傳遞中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后Tau蛋白異常磷酸化明顯增加，p-Tau蛋白已成為神經(jīng)元缺血性損傷較為敏感的標(biāo)志之一。而Tau蛋白的過(guò)度磷酸化，是加速神經(jīng)元死亡的主要原因[18]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Tempol、Apocynin和Rg1(5、10 μmol·L-1)組可使PSD95蛋白表達(dá)明顯升高，使p-Tau蛋白的表達(dá)明顯降低，說(shuō)明人參皂苷Rg1能夠減輕腦缺血/再灌注所致的突觸結(jié)構(gòu)性損傷和抑制tau蛋白磷酸化水平。

綜上所述，PC12細(xì)胞在缺氧復(fù)氧處理后細(xì)胞活性降低，氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡明顯，炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，最終造成細(xì)胞病理性損傷。而Tempol、Apocynin和Rg1(5,10 μmol·L-1)各藥物組均能減輕OGD/R導(dǎo)致的細(xì)胞損傷從而抑制細(xì)胞凋亡，說(shuō)明人參皂苷Rg1可能是通過(guò)抑制NOX2-NLRP1信號(hào)通路來(lái)減輕PC12細(xì)胞缺氧復(fù)氧性損傷。