姜 磊，路延超，張家愷，張 睿，許順江，張國軍

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心，2．北京市免疫試劑臨床工程技術(shù)研究中心，北京 100070；河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 3.中心實(shí)驗(yàn)室，4. 核醫(yī)學(xué)科, 5. 放射科，河北 石家莊 050031;6.國家藥監(jiān)局體外診斷試劑質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100070)

糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE)是糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙，與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)具有相似病理改變，如神經(jīng)元變性、海馬萎縮、Aβ沉積和突觸減少等[1]。研究發(fā)現(xiàn)，DE的發(fā)病途徑主要集中在氧化應(yīng)激、炎癥和自噬等[2]。氧化應(yīng)激損傷作為ROS連鎖反應(yīng)的始動因素，可引起細(xì)胞毒性作用和生命大分子(膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA)的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致DE的發(fā)生與發(fā)展。

晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)作為體內(nèi)過量葡萄糖等碳水化合物合成的有毒物質(zhì)，可以通過抑制體內(nèi)抗氧化物的產(chǎn)生、促進(jìn)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和促炎等多種途徑發(fā)揮毒性作用[3-4]。AGEs 及其受體RAGE在小膠質(zhì)細(xì)胞高度表達(dá)可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致大量經(jīng)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，引發(fā)繼發(fā)性腦損傷[5]。

白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一種從虎杖、桑椹、葡萄、漿果和花生等植物性食物中提取的類黃酮多酚類化合物[6-7]。RSV可在一定程度上改善AD大鼠動物模型的空間學(xué)習(xí)記憶能力[8]。RSV可有效防止炎癥反應(yīng)和脂肪酸氧化，其機(jī)制可能與AMPK的激活和衰老標(biāo)志物p21的表達(dá)增加有關(guān)[6-7]。此外，JNK作為MAPK通路4種主要的分支路線之一，可通過被 ROS 激活來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存或死亡[9]。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測 ROS 在RSV干預(yù)下AGEs誘導(dǎo)DE細(xì)胞模型中的表達(dá)，探討RSV治療 DE 的潛在分子機(jī)制，為臨床使用RSV對DE的防治提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與試劑大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購入；AGEs(批號A0764)和RSV(批號R5010)購于美國SIGMA公司；DMEM培養(yǎng)基(批號12800017)和胎牛血清(批號 10099141C)購于美國Invitrogen公司；MTS(批號 G3580) 購于美國Promega公司；JNK(批號9252)和p-JNK(批號4668)一抗購于美國 CST 公司； Bcl-2(批號 ab59348)和PUMA(批號ab9643)一抗購于美國 Abcam公司； BAX(批號 50599-2-lg)、Caspase-3(批號 19677-1-AP)和β-actin(批號66009-1-Ig)一抗購于美國Proteintech公司；驢抗鼠(批號A23710)和驢抗兔(批號 A23920)熒光二抗購于 Abbkine公司；RO 檢測試劑盒(批號 D6470)和AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒(批號 CA1020)購自中國 Solarbio 公司；TUNEL BrightRed 凋亡檢測試劑盒(批號 A113)購自Vazyme 公司。

1.2 儀器BB150-2TCS CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國 Thermo Fisher 公司)；5810R低溫高速離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)；Promega-GloMax酶標(biāo)儀(美國 Promege 公司)；Odyssey紅外成像系統(tǒng)(美國LI-COR Biosciences公司)；CYTOMICS FC 500流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)；CK40-F200熒光顯微鏡(日本 Olympus 公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代將PC12細(xì)胞加入含10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃溫度和 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。每2 d換1次培養(yǎng)基，在細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，經(jīng)0.25% 胰酶消化后傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTS法檢測細(xì)胞的相對存活率將PC12細(xì)胞用培養(yǎng)基制成細(xì)胞密度為1×109個·L-1的細(xì)胞懸液并種入96孔板，用不同濃度AGEs(0、50、100、200、400 g·L-1)、不同濃度 RSV(0、5、10、20、40 μmol·L-1)和AGEs+RSV聯(lián)合處理細(xì)胞24 h后，每孔加入10 μL MTS試劑，在37 ℃，5% CO2的環(huán)境下孵育24 h。在酶標(biāo)儀490 nm波長下讀取吸光度值。細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。計(jì)算不同組別細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取其均值。

2.3 TUNEL法檢測細(xì)胞的凋亡將處理好的PC12細(xì)胞去除培養(yǎng)基后加入適量4%多聚甲醛固定20 min。PBS清洗兩次后加入2 g·L-1的Proteinase K溶液100 μL，孵育5 min。加入100 μL 1×Equilibration Buffer覆蓋樣本，室溫平衡30 min。再加入TdT孵育緩沖液，37 ℃孵育60 min。DAPI復(fù)染，使用熒光顯微鏡在620 nm熒光下觀察BrightRed紅色熒光，在460 nm熒光下觀察DAPI藍(lán)色熒光。

2.4 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞分析法檢測細(xì)胞凋亡嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒說明書操作，向處理好的各組PC12細(xì)胞中加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，充分混勻。避光、室溫反應(yīng)10 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻。1 h之內(nèi)使用CYTOMICS FC 500流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。左下象限為活細(xì)胞[Annexin V(-) PI(-)]；左上象限為非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞[Annexin V(-) PI(+)]；右上象限為晚凋細(xì)胞[(Annexin V(+) PI(+)]；右下象限為早凋細(xì)胞[(Annexin V(+) PI(-)]。本實(shí)驗(yàn)中凋亡細(xì)胞記右上和右下兩象限細(xì)胞。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞活性氧嚴(yán)格按照活性氧檢測試劑盒說明書操作,1 ∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使用終濃度為10 μmol·L-1。避光條件下加入1 mL/孔DCFH-DA,4 ℃染色20 min,流式細(xì)胞儀488 nm的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，用無血清細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液充分洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。1 h之內(nèi)在CYTOMICS FC 500流式細(xì)胞儀上檢測熒光強(qiáng)度。

2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)提取各組PC12細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白檢測方法對總蛋白進(jìn)行定量。使用SDS-PAGE電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5% BSA室溫封閉30 min，一抗4 ℃孵育24 h。二抗室溫避光孵育40 min。使用Odyssey超靈敏多功能紅外熒光掃描成像儀系統(tǒng)曝光目的條，計(jì)算目的蛋白/β-actin的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 MTS檢測AGEs和RSV對 PC12 細(xì)胞存活率的影響MTS結(jié)果如Fig 1所示，不同濃度(0、50、100、200、400 g·L-1)的AGEs刺激PC12細(xì)胞24 h后，MTS結(jié)果顯示，AGEs體外處理對PC12細(xì)胞有明顯的生長抑制作用。400 g·L-1AGEs處理24 h后，細(xì)胞的存活率降至70%(P<0.01)。因此，在接下來的實(shí)驗(yàn)中，以400 g·L-1AGEs誘導(dǎo)PC12細(xì)胞制備DE細(xì)胞模型。5-10 μmol·L-1RSV溶液作用PC12細(xì)胞24 h對細(xì)胞活性未見明顯抑制作用，因此選擇10 μmol·L-1RSV進(jìn)行干預(yù)。將5 μmol·L-1和10 μmol·L-1的RSV分別與400 g·L-1AGEs聯(lián)合應(yīng)用于 PC12 細(xì)胞，與AGEs組比較，10 μmol·L-1的RSV可有效提高細(xì)胞存活率(P<0.05)。提示一定濃度的RSV可抑制AGEs對PC12細(xì)胞存活率的影響。

Fig 1 Effects of AGEs and RSV on PC12 cell viability n=3)

3.2 RSV對AGEs誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色如Fig 2所示，細(xì)胞中被TUNEL BrightRed 染成紅色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為胞體變小、染色質(zhì)凝集和核固縮。AGEs組被TUNEL BrightRed染成紅色的細(xì)胞明顯增多，而加入RSV后可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。流式細(xì)胞結(jié)果如Fig 3所示，與正常對照組比較，AGEs組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)；與AGEs組比較，AGEs+RSV組凋亡率明顯減少(P<0.01)。上述結(jié)果表明，RSV可明顯降低AGEs誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡。

Fig 2 PC12 cell apoptosis in different groups detected by TUNEL staining (×200)

Fig 3 Effects of RSV on apoptosis of PC12 cells induced by AGEs n=3)

3.3 RSV對AGEs誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS的影響如Fig 4所示，與正常對照組比較，AGEs組ROS水平明顯增加(P<0.01)；與AGEs組比較，AGEs+RSV組ROS水平明顯減少(P<0.01)。提示RSV可明顯降低AGEs誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。

Fig 4 Effects of RSV on ROS of PC12 cells induced by AGEs n=3)

3.4 RSV對AGEs誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響如Fig 5所示，與正常對照組比較，AGEs組p-JNK、PUMA、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，JNK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與AGEs組比較，AGEs+RSV組p-JNK、PUMA、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，JNK蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明，RSV可能通過JNK通路調(diào)控AGEs對PC12細(xì)胞的凋亡作用。

Fig 5 Effects of RSV on apoptosis related proteins of PC12 cells induced by AGEs n=3)

3.5 JNK特異性抑制劑對AGEs誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響如Fig 6所示，JNK特異性磷酸化抑制劑(SP600125)可明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡(P<0.01)。提示抑制JNK的磷酸化可抑制AGEs對PC12細(xì)胞的凋亡作用。

Fig 6 Effects of SP600125 on apoptosis of PC12 cells induced by AGEs n=3)

4 討論

糖尿病通常被認(rèn)為是一種雙激素疾病，其特征是高血糖水平的低胰島素血癥和高胰高血糖素血癥[10]。目前，全球糖尿病患者的數(shù)量不斷上升，預(yù)計(jì)到2040年將達(dá)到6.42億人[11]。大量的流行病學(xué)調(diào)查表明，2型糖尿病病人患AD的風(fēng)險是非糖尿病病人的2倍[12]。糖尿病與記憶障礙具有相關(guān)性，但其機(jī)制尚不清楚[13]。最近文獻(xiàn)報道DE大鼠呈現(xiàn)腦老化和AD樣病理改變，如神經(jīng)元變性、海馬萎縮、神經(jīng)細(xì)胞外Aβ沉積、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)細(xì)胞缺失和突觸減少等[1]。因此，糖尿病被認(rèn)為是AD的獨(dú)立風(fēng)險因子之一。我們推測DE和AD可能存在某些相似的發(fā)病機(jī)制和病理改變。關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制至今不明，存在多種學(xué)說，包括氧化應(yīng)激學(xué)說、Aβ廣泛聚集學(xué)說、tau蛋白的過度磷酸化假說、基因突變學(xué)說、淀粉樣肽學(xué)說、免疫學(xué)說、線粒體功能障礙、炎癥和自噬等，其中氧化應(yīng)激學(xué)說備受關(guān)注。大量研究證實(shí)氧化應(yīng)激是糖尿病和AD發(fā)病的重要機(jī)制，且參與了AD的病理進(jìn)程。

有研究表明，在學(xué)習(xí)記憶障礙動物模型體內(nèi)AGEs表達(dá)明顯升高，而過多的AGEs導(dǎo)致神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，加速學(xué)習(xí)記憶功能減退[14]。由于AGEs對神經(jīng)元和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他細(xì)胞具有強(qiáng)毒性，AGEs水平增多會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物含量增加，腦內(nèi)的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及抗氧化酶活性明顯下降，蛋白激酶C(PKC)激活，從而造成氧化應(yīng)激損傷，氧化應(yīng)激可通過激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，進(jìn)一步增強(qiáng)PKC活性，由此形成氧化應(yīng)激惡性循環(huán)，造成糖尿病患者腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷[15]。雖然已明確AGEs可引起神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，但如何通過AGEs培養(yǎng)PC12細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DE細(xì)胞模型尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度AGEs對PC12細(xì)胞存活率的影響分析，發(fā)現(xiàn)400 g·L-1AGEs培養(yǎng) PC12細(xì)胞24 h會使細(xì)胞存活率降至70%左右，ROS表達(dá)明顯升高，因此使用400 g·L-1AGEs培養(yǎng) PC12細(xì)胞24 h能夠較準(zhǔn)確地模擬 DE時腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，建立DE細(xì)胞模型。

c-Jun 氨基末端激酶(JNK)是哺乳類細(xì)胞中MAPK信號通路的重要分支,在細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、生殖和炎癥反應(yīng)等多種生理和病理過程中起重要作用。大量研究表明，在氧化應(yīng)激細(xì)胞中JNK是一種重要的促凋亡機(jī)制，JNK不僅容易通過不同的信號途徑被活性氧激活，而且藥物抑制JNK后還能有效防止由于活性氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[9]。PUMA作為重要的凋亡調(diào)節(jié)因子可結(jié)合Bcl-2和Bax,促使下游Caspase-3執(zhí)行細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,AGEs可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ROS升高，JNK蛋白活化，PUMA、Bax和Caspase-3蛋白增加，Bcl-2蛋白降低，增加細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞存活率。SP600125作為JNK特異性抑制劑可顯著抑制AGEs引起的細(xì)胞凋亡。提示AGEs 對PC12細(xì)胞的損傷作用可能與ROS-JNK通路活化有關(guān)。

大量研究表明，白藜蘆醇具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、治療自身免疫性疾病、防止肥胖、增加線粒體呼吸、增加糖異生、防止2型糖尿病和延緩衰老等生理活性[6-7]。任等[16]研究發(fā)現(xiàn)，20 μmol·L-1白藜蘆醇可顯著抑制三甲基氯化錫誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)10 μmol·L-1RSV 同樣可有效降低AGEs對PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的損傷，同時降低JNK的活化，降低 PUMA、Bax和Caspase-3 蛋白的表達(dá)，提高Bcl-2蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了DE細(xì)胞模型，并明確了RSV的干預(yù)濃度；過量的AGEs可降低PC12細(xì)胞存活率，且 RSV可抵抗這一過程；RSV可能通過ROS-JNK信號通路抑制 AGEs對PC12細(xì)胞凋亡的影響，為后續(xù)的研究提供幫助。下一步我們將構(gòu)建 DE大鼠模型，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RSV對DE的影響。