馮 辰，胡清源，田 銣，蘇慧玲，安 輸，徐天瑞

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南省高校靶點(diǎn)藥物篩選與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

惡性腫瘤是對(duì)人類危害最大、最為重要的致死性疾病，其發(fā)病率和死亡率均位于各類疾病前列[1]。針對(duì)惡性腫瘤的藥物治療策略也較多，如有各種特異性靶向關(guān)鍵受體和關(guān)鍵激酶等的抑制劑，它們可抑制誘發(fā)腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵信號(hào)通路的活化。其中Ras-MAPK (mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信號(hào)通路和PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-Akt信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用被研究的最為透徹，針對(duì)這兩條信號(hào)通路的抗腫瘤靶向藥物在臨床上也被應(yīng)用的最多[2]。

自上個(gè)世紀(jì)60年代Ras原癌基因被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，眾多的研究表明，Ras蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大約有1/3的人類腫瘤是因Ras基因突變而導(dǎo)致的[3]。但因Ras蛋白結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，致使其缺乏藥物分子結(jié)合口袋，并使之難以成為小分子化合物作用的靶點(diǎn)，所以學(xué)界普遍認(rèn)為Ras蛋白是“無(wú)藥可靶向的” (undruggable)[4]。所以，對(duì)Ras蛋白功能具有重要調(diào)控作用的FTase逐漸成為抗腫瘤藥物研發(fā)的焦點(diǎn)[5]。

FTase是一種膜結(jié)合蛋白，研究表明，其在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。FTase最主要的功能是其可通過(guò)催化作用，將一個(gè)含有15個(gè)碳原子的法尼基脂共價(jià)連接到靶蛋白羧基端四肽基序中的半胱氨酸巰基上，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的法尼基化和功能調(diào)控[6]。其中Ras是FTase最為重要的底物蛋白之一，只有當(dāng)Ras蛋白被法尼基化后，其才能通過(guò)法尼基脂結(jié)合于細(xì)胞膜而被激活[7-8]。

1 Ras蛋白概述

Ras蛋白是一種細(xì)胞膜結(jié)合蛋白，它屬于GTPase家族成員，是一種小G蛋白。Ras蛋白家族含有H-Ras、N-Ras、K-Ras 4A和K-Ras 4B等4個(gè)成員，它們分別由H-Ras、N-Ras和K-Ras基因編碼生成，其中K-Ras 4A和K-Ras 4B是K-Ras基因的不同剪接體[9]。如前文所述，Ras基因突變是誘發(fā)大約1/3人類腫瘤的主要因素，而排在前三位致死率最高的腫瘤(肺腺癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌)中，K-Ras的突變最為常見(jiàn)，分別在86%的胰腺癌組織、41%的結(jié)直腸癌組織和32%的肺腺癌組織中均檢測(cè)到K-Ras基因突變。K-Ras基因突變主要發(fā)生在第12位密碼子，該密碼子編碼甘氨酸 (G)。在肺癌組織中，第12位甘氨酸常常突變成半胱氨酸 (G12C)，而在結(jié)直腸癌和胰腺癌組織中，甘氨酸常常突變成天冬氨酸 (G12D)[3,10]。

在正常細(xì)胞中，位于細(xì)胞膜的Ras蛋白可被表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等受體及鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)所激活。GEF可實(shí)現(xiàn)Ras蛋白由非活化狀態(tài)GDP-Ras向活化狀態(tài)GTP-Ras轉(zhuǎn)變，從而激活Ras蛋白及其下游MAPK和PI3K-Akt這兩條細(xì)胞主干信號(hào)通路，以維持細(xì)胞的正常增殖和分化等生理功能。GTP酶活化蛋白 (GTPase-activating protein，GAP)可催化GTP-Ras中GTP的水解，使Ras蛋白轉(zhuǎn)變成GDP-Ras狀態(tài)，反饋性地抑制Ras活性，防止Ras下游信號(hào)通路的持續(xù)激活[11]。而當(dāng)Ras基因發(fā)生致癌突變時(shí)，GAP將無(wú)法水解GTP-Ras中的GTP，致使Ras一直處于激活狀態(tài)，從而導(dǎo)致Ras下游信號(hào)通路的持續(xù)異?；罨凹?xì)胞的癌性轉(zhuǎn)變[11]。

2 FTase對(duì)Ras蛋白功能的調(diào)控及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

作為一種在胞質(zhì)中剛被表達(dá)的Ras前體蛋白是沒(méi)有活性的，它需要經(jīng)歷諸多翻譯后修飾包括聚異戊二烯化 (3個(gè)異戊二烯即可形成法尼基)、蛋白水解和羧基甲基化等才能轉(zhuǎn)變成有活性的Ras蛋白[12]。Ras蛋白的法尼基化是其翻譯后修飾的第一步。在FTase催化作用下，其可將一個(gè)含有15個(gè)碳原子的法尼基異戊二烯脂連接到Ras蛋白羧基端CAAX四肽基序的半胱氨酸巰基上，其中C是半胱氨酸，A是一種脂肪族氨基酸，X是絲氨酸或甲硫氨酸。Ras蛋白被法尼基化后，法尼基異戊二烯可以將Ras固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ras蛋白羧基端CAAX四肽基序中的AAX進(jìn)而被RCE1(Ras-converting CAAX endopeptidase 1， RCE1)所酶切水解。之后在ICMT (isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase)酶的作用下，一個(gè)羧甲基被連接到羧基末端的半胱氨酸上。最后，在棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 (palmitoyltransferase) 的作用下，兩個(gè)棕櫚酰長(zhǎng)鏈脂肪酸基團(tuán)被分別連接到羧甲基化半胱氨酸上游的兩個(gè)半胱氨酸上。此時(shí)，棕櫚酰化的Ras蛋白擁有一個(gè)較強(qiáng)的疏水性尾巴，該尾巴使Ras蛋白對(duì)細(xì)胞膜具有較高的親和力，并可將Ras蛋白固定于細(xì)胞膜，從而有利于Ras蛋白的激活[7]。

研究表明，F(xiàn)Tase在肝癌、肺癌、卵巢癌和食管癌等癌組織中呈高表達(dá)態(tài)勢(shì)，其可通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6,13-14]。FTase可以使Ras、CENP-E (centromere-associated protein E，CENP-E)、CENP-F和spindly等蛋白法尼基化，上述蛋白又是細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程的重要調(diào)控分子。FTase促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制主要與Ras蛋白有關(guān)，因Ras-MAPK和Ras-PI3K-Akt信號(hào)通路異常活化在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[14-15]。

3 FTase抑制劑

自從發(fā)現(xiàn)Ras蛋白的法尼基化對(duì)其功能至關(guān)重要以來(lái)，F(xiàn)Tase抑制劑(FTIs) 逐漸成了抗腫瘤藥物研究熱點(diǎn)。根據(jù)FTIs結(jié)構(gòu)及其抑制FTase的作用機(jī)制，可將FTIs分為4類：(1)CAAX四肽基序及其模擬物，(2)法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP，它是法尼基的活化形式)模擬物，(3)過(guò)渡態(tài)模擬物，(4)其它化合物[16]。

最初的FTIs即為野生型K-Ras羧基端CVIM四肽，后續(xù)研究工作對(duì)該四肽化合物進(jìn)行了改造，主要目的是為了減少該類FTIs骨架中的酰胺鍵，降低FTIs在體內(nèi)被蛋白酶水解的風(fēng)險(xiǎn)，提高FTIs的半衰期。此外，還可通過(guò)替換CAAX四肽中的氨基酸A，以提高其活性。如將CVIM四肽化合物中異亮氨酸(I)替換成疏水性更強(qiáng)的苯丙氨酸(F)，則CVFM四肽化合物的FTIs活性明顯增強(qiáng)[17](Fig 3)。

Fig 1 Schematic diagram of activation of Ras protein and its downstream MAPK and PI3K-Akt signaling pathways

Fig 2 The farnesylation and palmitoylation modification of Ras protein

Fig 3 The chemical structures of CVFM, CVIM, isoprenyl phosphinylformates, ER28488 and ER27856

Fig 4 The chemical structures of ammonium analogues, RPR 101821 and N-arylalky-farnesylamine derivative

Fig 5 The chemical structures of tipifarnib, L778123, lonafarnib, BMS-214662 and antroquinonol

Fig 6 The chemical structures of FTI-2153, FTI-276, FTI-277, TAK-475, LB-42708, ABT-100, L744832, Manumycin-A and Moverastin

目前已有100多種各類FTIs被發(fā)現(xiàn)[8,18]，其中5種化合物替吡法尼、洛那法尼、安卓奎諾爾、BMS-214662和L778123已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)研究階段或已完成臨床實(shí)驗(yàn)。近期，替吡法尼和洛那法尼已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)分別用于T細(xì)胞淋巴瘤和早衰癥的治療。

3.1 FTase的底物模擬物底物蛋白羧基端的CAAX四肽基序及法尼基焦磷酸(FPP，法尼基的活化形式)是FTase最直接的底物。在FTase的催化作用下，其可將法尼基共價(jià)連接到CAAX四肽基序中半胱氨酸巰基上。基于這一機(jī)制，當(dāng)前已合成或發(fā)現(xiàn)諸多底物模擬物，這些模擬物可以與CAAX四肽基序或法尼基焦磷酸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FTase的活性中心，從而抑制FTase對(duì)底物的催化作用。

除了上文所述的CVIM和CVFM外，其它FTIs活性較好的底物模擬物還包括isoprenyl phosphinylformates、ER-28488和ER-27856等，其中后3種化合物屬于FPP的類似物。ER-28488及其前體ER-27856對(duì)FTase的半抑制濃度(IC50)分別為3.6 nmol·L-1和39 μmol·L-1[6]。

3.2 過(guò)渡態(tài)模擬物在FTase催化法尼基連接至半胱氨酸巰基上時(shí)，半胱氨酸會(huì)形成一個(gè)碳正離子中間體，一些能夠很好模擬碳正離子中間體的化合物如銨類似物 (ammonium analogues)、N-芳烷基-法尼胺衍生物(N-arylalky-farnesylamine derivative)和RPR 101821(一個(gè)質(zhì)子化的環(huán)已胺衍生物)，它們能夠與碳正離子中間體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FTase的酶活性中心，進(jìn)而抑制FTase活性[6,19]。

3.3 其它化合物除了底物模擬物和過(guò)渡態(tài)模擬物，還有許多不能歸屬于上述兩類模擬物的化合物也表現(xiàn)出較強(qiáng)的FTIs活性，這些化合物包括替吡法尼、洛那法尼、安卓奎諾爾、BMS-214662、L778123、L744832、TAK-475、Manumycin-A、FTI-276、FTI-277、FTI-2153、LB-42708、Moverastin和ABT-100等，其中前5個(gè)化合物已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)研究階段或已完成臨床實(shí)驗(yàn)。值得注意的是，替吡法尼和洛那法尼已于2020年被FDA批準(zhǔn)分別用于T細(xì)胞淋巴瘤和早衰癥的臨床治療。

3.3.1替吡法尼 替吡法尼是一種強(qiáng)效的FTase特異性抑制劑，其對(duì)FTase的IC50值可低達(dá)7.9 nmol·L-1。有研究檢測(cè)替吡法尼對(duì)53種常見(jiàn)人類腫瘤細(xì)胞系增殖的抑制效果，發(fā)現(xiàn)75%的腫瘤細(xì)胞系均對(duì)替吡法尼敏感，而且絕大多數(shù)對(duì)替吡法尼敏感的腫瘤細(xì)胞系均發(fā)生了H-Ras或N-Ras突變[20]。臨床研究結(jié)果顯示，在已接受替吡法尼單藥療法的重度預(yù)防治療的T細(xì)胞淋巴瘤患者中，客觀緩解率(objective response rate，ORR)約為50%。而在攜帶殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)突變體的患者中，替吡法尼的抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)，這些患者的ORR可達(dá)70%，完全緩解率(complete remission，CR) 達(dá)40%[21]。于2020年，替吡法尼已被FDA批準(zhǔn)用于T細(xì)胞淋巴瘤的臨床治療。

此外，應(yīng)用替吡法尼治療膀胱癌[22]、唾液腺癌[23]、慢性粒細(xì)胞白血病、甲狀腺癌[24]、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肺癌等腫瘤正處于各期臨床實(shí)驗(yàn)階段。

3.3.2洛那法尼 洛那法尼也是一種特異性FTase抑制劑，有研究表明，其對(duì)7種常見(jiàn)腫瘤細(xì)胞的72 h平均IC50值約為8 μmol·L-1[25]。于2020年洛那法尼被FDA批準(zhǔn)用于早衰癥的治療。因洛那法尼可以有效抑制FTase對(duì)早衰素 (presenilin) 的法尼基化，從而降低早衰素在細(xì)胞核中的積累[26]。此外,2018年FDA還授予洛那法尼用于治療丁型肝炎病毒 (HDV) 感染的突破性藥物資格(breakthrough therapy designation，BTD)[27]。

3.3.3安卓奎諾爾 安卓奎諾爾是一種萃取自臺(tái)灣特有珍稀物種牛樟芝(Antrodiacamphorata)的天然小分子化合物，它也是一種強(qiáng)效的FTase抑制劑[28]。有許多研究從不同角度探討了安卓奎諾爾抑制肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌生長(zhǎng)的分子機(jī)制[28]。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，安卓奎諾爾的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以直接結(jié)合于FTase活性中心的Ras-CAAX四肽基序結(jié)合位點(diǎn)，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ras蛋白的法尼基化及其功能[28]。安卓奎諾爾對(duì)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的Ⅱ期臨床研究結(jié)果顯示，單獨(dú)使用安卓奎諾爾可提高肺癌的控制率，延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展生存期(progress free survival，PFS) 和總生存期(overall survival，OS)。雖然安卓奎諾爾對(duì)K-Ras突變陰性肺癌患者的治療效果明顯優(yōu)于對(duì)K-Ras突變陽(yáng)性肺癌患者的治療效果，但目前安卓奎諾爾仍然是治療K-Ras突變陽(yáng)性肺癌患者唯一有效藥物[29]。此外，評(píng)價(jià)安卓奎諾爾的抗乙肝病毒(HBV)活性，探討安卓奎諾爾在慢性乙肝中的治療作用機(jī)制的Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)也正在進(jìn)行中(Clinical Trials編號(hào): NCT04112147和NCT036 25102)。其它曾經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床抗腫瘤研究的FTIs還包括BMS-214662和L778123，但由于存在較大的毒副作用，它們未能進(jìn)一步進(jìn)入更大規(guī)模的臨床研究。

3.3.4TAK-475等 TAK-475又名拉帕司他 (lapaquistat)，一度進(jìn)入Ⅱ期和Ⅲ期臨床研究，但由于其較強(qiáng)的肝臟毒性，在臨床實(shí)驗(yàn)過(guò)程中被FDA叫停。此外，化合物L(fēng)744834、Manumycin-A、FTI-276、FTI-277、FTI-2153、LB-42708、Moverastin和ABT-100等也具有較強(qiáng)的FTIs活性，目前它們正處于臨床前抗腫瘤活性評(píng)估和抗腫瘤作用機(jī)制研究階段[30]。

4 總結(jié)與展望

諸多研究表明，Ras蛋白在眾多腫瘤的病理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，而FTase通過(guò)法尼基化將Ras蛋白固定于細(xì)胞膜是Ras蛋白活化所必需的。因此，F(xiàn)Tase可在Ras介導(dǎo)下促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因Ras蛋白結(jié)構(gòu)的特殊性，致使其缺乏合適的小分子作用位點(diǎn)，所以很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)Ras蛋白一直被認(rèn)為是“無(wú)藥可靶向的”。為了能夠找到用于治療Ras突變所誘發(fā)腫瘤的藥物，F(xiàn)Tase及其抑制劑逐漸成了研究的焦點(diǎn)。在過(guò)去20多年，共有100多種各型FTIs被發(fā)現(xiàn)，其中5種FTIs包括替吡法尼、洛那法尼、安卓奎諾爾、BMS-214662和L778123已進(jìn)入或已完成臨床實(shí)驗(yàn)，替吡法尼和洛那法尼已于2020年被FDA批準(zhǔn)分別用于T細(xì)胞淋巴瘤和早衰癥的臨床治療。

然而，還有很多FTIs止步于Ⅱ期臨床研究或未進(jìn)入臨床研究，主要是因?yàn)檫@些FTIs表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒副作用，包括嚴(yán)重的對(duì)正常細(xì)胞的毒性、肝臟毒性、胃腸不適和神經(jīng)毒性等?；趯?duì)這些FTIs結(jié)構(gòu)及其抑制FTase作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，當(dāng)前許多工作正在開(kāi)展對(duì)這些FTIs進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或聯(lián)合用藥等方面的研究，以期提高這些FTIs的藥效及降低其毒副作用。同時(shí)，隨著新的化合物被合成、新的天然化合物被不斷發(fā)現(xiàn)及高通量篩選技術(shù)的日趨完善，許多新的FTIs先導(dǎo)或候選化合物將會(huì)被識(shí)別鑒定，這將會(huì)為Ras突變所誘發(fā)腫瘤等疾病的治療提供更多選擇。