胡寬，姚磊，李娟妮

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院1.肝臟外科2.病理科，湖南長沙410008）

肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的最主要原因之一，其發(fā)病率和病死率均位居所有癌癥類型的前列[1]。盡管近年來不斷有針對肝癌的各類藥物研發(fā)出來，但由于其極高的惡性程度與發(fā)病的隱匿性，大多數(shù)肝癌患者的臨床結(jié)局依舊很差，只有不到30%的肝癌患者能接受手術(shù)治療[2]。因此，探索新的診斷、預(yù)后標(biāo)志物和分子靶點(diǎn)對于改善肝癌患者的生存具有重要價(jià)值。

RNA 甲基化的失調(diào)與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[3]。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾作為最常見的RNA 甲基化調(diào)控手段近來受到了廣泛的關(guān)注，有望成為新的抗癌治療靶點(diǎn)[4]。YTH（YT521-B homology family）基因家族成員共有5 個(gè)，都能編碼具有m6A 識(shí)別功能的閱讀蛋白，因在結(jié)構(gòu)上都擁有一段高度保守的YTH 結(jié)構(gòu)域而得名。這5 名家族成員又進(jìn)一步分為3 類：YTHDC1（YTH domain-containing 1）、YTHDC2（YTH domaincontaining 2）和YTHDF（YTH m6A-binding protein），其中YTHDF 包含YTHDF1-3。研究表明，YTH 基因家族成員與多種類型癌癥的發(fā)生發(fā)展都存在相關(guān)性。例如，乳腺癌細(xì)胞中ALKBH5 的下調(diào)可導(dǎo)致乳腺癌干細(xì)胞數(shù)量減少，進(jìn)而顯著降低乳腺癌的成瘤能力[5]。此外，敲低YTHDF2 的表達(dá)導(dǎo)致了胰腺癌細(xì)胞的侵襲性增加。又有報(bào)道表明在鼻咽癌中，YTHDC2 可以通過激活A(yù)kt 信號(hào)通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的放療抵抗[6]。然而，目前尚未有關(guān)于YTH 基因家族在肝癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)和功能的系統(tǒng)研究。

本研究旨在通過多種公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步拓寬對YTH 基因家族在肝癌中作用的理解，從而為肝癌的診斷和治療提供新的視角。本研究評(píng)估了肝癌中各個(gè)YTH 基因家族成員的表達(dá)情況、預(yù)后價(jià)值、功能及通路富集分析，并討論了腫瘤免疫細(xì)胞浸潤與YTH 家族的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 ULCAN和GEPIA2

ULCAN 是TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)來源的綜合表達(dá)分析數(shù)據(jù)庫[7]。通過ULCAN 分析肝癌和正常肝組織中各YTH 家族成員的表達(dá)差異，并分析其表達(dá)與臨床TNM 分期和腫瘤分級(jí)的關(guān)系。GEPIA2 數(shù)據(jù)庫[8]用于分析YTH 家族分子之間的相關(guān)性。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 Kaplan-Meier plotter

Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫用于評(píng)估特定基因表達(dá)水平在癌癥中的預(yù)后作用[9]。本研究通過該數(shù)據(jù)庫分別評(píng)估了各YTH 家族成員的表達(dá)與肝癌患者總生存期（overall survival，OS）、無復(fù)發(fā)生存期（recurrence free survival，RFS）的相關(guān)性。P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 cBioPorta和Cytoscape

cBioPortal 是一個(gè)癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫，提供不同類型癌癥的基因組改變數(shù)據(jù)的下載和分析[10]。使用cBioPortal 分析包含了360 例肝癌患者的數(shù)據(jù)集（TCGA，F(xiàn)irehose Legacy）來探究YTH 家族的基因改變情況，并篩選肝癌中YTH 相關(guān)基因，共篩選出155 個(gè)YTH 相關(guān)基因，然后通過Cytoscape 軟件生成蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 WebGestalt

WebGestalt 是一個(gè)綜合性的在線工具，支持基因集富集分析和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鯷11]。本研究通過該工具對YTH 的相關(guān)基因進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。

1.5 TIMER 2.0

Timer 2.0 是一個(gè)公共資源平臺(tái)，提供各種癌癥中免疫細(xì)胞浸潤的綜合分析[12]。本研究中，通過該平臺(tái)的“免疫關(guān)聯(lián)”模塊以獲得散點(diǎn)圖，該散點(diǎn)圖顯示了YTH 家族蛋白的表達(dá)與不同類型浸潤免疫細(xì)胞（CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 YTH基因家族在肝癌中的表達(dá)

通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中所有的YTH 基因家族成員的mRNA 表達(dá)與鄰近正常組織相比均明顯升高（圖1A）。此外，肝癌中每個(gè)YTH 成員的表達(dá)豐度各不相同，結(jié)果顯示：YTHDC2 的相對表達(dá)量在YTH 家族成員中最低，而YTHDF2 的表達(dá)量最高（圖1B）。根據(jù)不同的TNM分期劃分肝癌亞組，發(fā)現(xiàn)YTH 家族分子的表達(dá)在亞組間呈現(xiàn)一定的差異，結(jié)果表明YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3 趨勢相同，在1、2、3 期中其表達(dá)水平逐漸升高，但在4 期中表達(dá)下降，并與正常組織相比無差異（圖2A）。進(jìn)一步探究YTH 表達(dá)與腫瘤分級(jí)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢，即YTH 家族分子在腫瘤的1、2、3 級(jí)中其表達(dá)水平依次升高，但在4 級(jí)中表達(dá)下降（圖2B）。上述結(jié)果提示：YTH 家族可能參與肝癌的腫瘤進(jìn)程，終末期肝癌患者較差的全身狀況可能參與YTH 家族分子表達(dá)水平的下降。

圖1 YTH基因家族表達(dá)分析A：YTH家族各成員在肝癌及正常肝組織中的mRNA表達(dá)差異（ULCAN）；B：肝癌中YTH家族各成員的相對表達(dá)水平（GEPIA2）Figure 1 Analysis of the mRNA expression profiles of YTH familyA:Differences in mRNA expression profiles between HCC and normal liver tissue(ULCAN);B:The relative expression levels of individual YTH members in HCC(GEPIA2)

圖2 YTH基因家族的表達(dá)與肝癌患者臨床TNM分期及腫瘤分級(jí)的相關(guān)性（ULCAN）A：YTH家族各成員的表達(dá)與TNM分期的相關(guān)性分析；B：YTH家族各成員的表達(dá)與腫瘤分級(jí)的相關(guān)性分析Figure 2 The relationship between the mRNA expression of YTH family and clinical stage and tumor grade in HCC(ULCAN)A:Association of the mRNA expression of YTH family with clinical stage;B:Association of the mRNA expression of YTH family with tumor grade

2.2 YTH基因家族在肝癌患者預(yù)后中的作用

為了進(jìn)一步評(píng)估YTH 家族在肝癌患者中的預(yù)后價(jià)值，通過Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫分析了YTH 家族成員的表達(dá)與OS、RFS 之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：YTHDF1（P<0.01）、YTHDF2（P<0.05）的高表達(dá)與肝癌患者較差的OS 顯著相關(guān)；關(guān)于RFS 的結(jié)果顯示：YTHDF1（P<0.001）、YTHDF2（P<0.05）的高表達(dá)與肝癌患者較差的RFS 顯著相關(guān)，然后YTHDF3（P<0.01）的高表達(dá)與肝癌患者較好的RFS 相關(guān)（圖3）。上述結(jié)果提示：YTHDF1和YTHDF2 的高表達(dá)均與患者更短的OS 和RFS 密切相關(guān)，是肝癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

圖3 YTH基因家族與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系（Kaplan-Meier plotter）A：YTH基因家族在肝癌患者中的OS曲線；B：YTH基因家族在肝癌患者中的RFS曲線Figure 3 The relationship between mRNA expression of YTH family and prognosis of HCC patients(Kaplan-Meier Plotter)A:The OS curves of YTH family in HCC patients;B:The RFS curves of YTH family in HCC patients

2.3 YTH基因家族在肝癌中的遺傳學(xué)改變

通過TCGA 數(shù)據(jù)庫和cBioPortal 工具，進(jìn)一步分析肝癌中YTH 基因家族基因改變的頻率和類型。如圖4所示，YTHDF3 基因變異率為25%，是YTH家族中最高的。YTHDC1 基因變異率為7%，為YTH 家族中最低。其他家族成員的基因改變頻率分別為18%（YTHDF1），11%（YTHDF2）和8%（YTHDC2）。在360 例肝癌患者/樣本中，有187 例檢測到Y(jié)TH 成員的遺傳變異，其總變異率為52%。另外，在遺傳變異類型方面，YTH 家族成員的主要遺傳變異類型包括：基因擴(kuò)增、基因缺失、錯(cuò)義突變和截短突變等（圖4A）。通過GEPIA2 數(shù)據(jù)庫分析YTH 基因家族分子之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示：YTHDC1 和YTHDC2 之間，以及YTHDC1 和YTHDC3 之間關(guān)系較為密切（圖4B）。

圖4 YTH 基因家族在肝癌中的遺傳學(xué)改變及家族成員之間相關(guān)性分析A：肝癌中各YTH 家族成員的基因改變頻率（cBioPortal）；B：YTH家族各成員互相之間的相關(guān)性（GEPIA2）Figure 4 Genetic alterations and correlation analysis of YTH family in HCCA:Summary of alteration rates for YTH family in HCC(cBioPortal);B:Correlation between each YTH member in HCC(GEPIA2)

2.4 YTH基因家族相關(guān)分子的功能及通路富集分析

首先，通過cBioPortal 數(shù)據(jù)庫鑒定出肝癌中與YTH 基因家族最密切相關(guān)的155 個(gè)基因，并利用Cytoscape 軟件構(gòu)建了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），結(jié)果顯示：IGF1、PCK1、CYP2B6 和ESR1 與肝癌中YTH 家族的功能密切相關(guān)（圖5A）。隨后利用WebGestalt 數(shù)據(jù)庫對155 個(gè)YTH 相關(guān)基因進(jìn)行了GO功能富集分析，結(jié)果顯示：YTH 相關(guān)基因功能主要涉及生物調(diào)節(jié)、能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)、多細(xì)胞生物過程、生物定位及發(fā)育過程等環(huán)節(jié)。YTH 相關(guān)基因主要在以下細(xì)胞及細(xì)胞外成分中高度富集：細(xì)胞膜、細(xì)胞外間隙、囊泡、細(xì)胞核、內(nèi)膜系統(tǒng)、膜封閉腔、細(xì)胞漿、含蛋白質(zhì)復(fù)合物等等。在分子功能方面，蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、水解酶活性、核酸結(jié)合、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)移酶活性是富集度最高的（圖5B）。此外，KEEG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示：YTH 相關(guān)蛋白與以下通路密切相關(guān)：藥物分解代謝、外源性刺激反應(yīng)、激素代謝、固醇類代謝、脂代謝、小分子的分解過程以及有機(jī)酸的生物合成功能（圖5C）。

圖5 YTH 基因家族相關(guān)分子的功能及通路富集分析A：肝癌中155 個(gè)YTH 基因家族相關(guān)分子的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（cBioPortal，Cytoscape）；B：GO 功能富集分析預(yù)測與YTH 家族相關(guān)的生物過程、細(xì)胞成分、分子功能（WebGestalt）；C：KEGG通路富集分析預(yù)測與YTH家族相關(guān)的信號(hào)通路（WebGestalt）Figure 5 Predicted functions and pathways of the relevant molecules of YTH familyA:Protein-protein interaction(PPI)of the 55 co-expressed genes of YTH family in HCC(cBioPortal and Cytoscape);B:GO functional enrichment analysis of the relevant biological process,cellular components and molecular functions of YTH family(WebGestalt);C:KEGG pathway analysis of the relevant signal pathways of YTH family(WebGestalt)

2.5 YTH基因家族與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

腫瘤中的免疫細(xì)胞浸潤是腫瘤微環(huán)境不可或缺的組成部分，也是反映預(yù)后和淋巴轉(zhuǎn)移狀態(tài)的獨(dú)立指標(biāo)。通過TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫分析腫瘤免疫細(xì)胞浸潤與YTH 基因家族各成員之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：YTH 基因家族成員與各類免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性是高度一致的，即所有家族成員的表達(dá)均與CD4+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞的浸潤呈顯著性正相關(guān)，與巨噬細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)。除YTHDF3 外，其余4 個(gè)YTH 家族成員與CD8+T 細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)（圖6）。以上數(shù)據(jù)表明YTH 基因家族可能因其YTH 結(jié)構(gòu)域的高度保守性，在肝癌腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。

圖6 TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫分析YTH基因家族與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性Figure 6 The correlation analysis between YTH family expression and immune cell infiltrations using TIMER2.0

3 討論

YTH 基因家族成員作為重要的m6A 閱讀蛋白，通過與含m6A 的mRNA 特異性結(jié)合來調(diào)控靶RNA甲基化[13-14]。RNA 甲基化是廣泛參與人類各種生物過程的一種重要的轉(zhuǎn)錄后修飾過程[15-16]。近年來m6A RNA 甲基化研究不斷揭示了其在各類癌癥的發(fā)生和發(fā)展中的促進(jìn)作用，繼而逐漸成為腫瘤學(xué)研究和靶向藥物開發(fā)的新方向[17]。因此YTH 基因家族在各類腫瘤的機(jī)制研究中具有巨大的潛在價(jià)值。已有研究[18]表明，YTHDF1 是肝細(xì)胞癌的致癌基因，其在肝癌患者中過度表達(dá)并且與不良預(yù)后相關(guān)，其作用機(jī)制可能是通過Snail 介導(dǎo)m6A 依賴性WNT/β-catenin 通路的激活而實(shí)現(xiàn)的。而YTH 家族的另一個(gè)分子YTHDF2 在肝癌中的作用則表現(xiàn)出矛盾的兩面性，一方面它通過m6A 依賴性的方式作為致癌基因參與肝癌的進(jìn)展，另一方面又被證明其通過EGFR 和ERK/MAPK 通路發(fā)揮抑癌作用[19]。在卵巢癌中，YTHDF1 明顯高表達(dá)，并與較差的臨床結(jié)果相關(guān)，YTHDF1 通過促進(jìn)EIF3C 的m6A 修飾翻譯在體內(nèi)和體外加速卵巢癌的生長和轉(zhuǎn)移[20]。在肺癌中，YTHDF2 的表達(dá)異常升高，可能通過磷酸戊糖途徑誘導(dǎo)的5-磷酸核糖和NADPH 機(jī)制通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長[21]。而YTHDF1 則被證明可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌中癌細(xì)胞的增殖，但是其高表達(dá)與更好的預(yù)后和化療敏感性相關(guān)，表明了YTHDF1 在肺癌機(jī)制研究中的復(fù)雜性[22]。以上研究從不同的角度證實(shí)了單個(gè)YTH 家族成員在不同腫瘤中的重要性。

從YTH 基因家族的整體角度出發(fā)，本研究首次系統(tǒng)分析了肝癌中各YTH 家族成員的表達(dá)、預(yù)后價(jià)值、免疫浸潤和相關(guān)功能。首先初步探索了YTH 基因家族在肝癌中的表達(dá)譜系差異，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)YTH 家族成員（YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2 和YTHDF3）的表達(dá)在肝癌中均顯著升高，表明YTH 家族分子均有作為肝癌致癌基因的潛力。隨后分析了YTH 家族分子的預(yù)后價(jià)值，并分析其預(yù)后價(jià)值是否與表達(dá)趨勢相一致，結(jié)果顯示：只有YTHDF1 和YTHDF2 的高表達(dá)都與較差的OS 和RFS 顯著相關(guān)。YTHDC1、YTHDC2、YTHDF3 雖有在肝癌中表達(dá)較正常肝組織為高，但這種高表達(dá)在OS 或RFS 生存分析中并無意義。以上結(jié)果表明YTHDF1 和YTHDF2 是潛在的肝癌促癌基因，可作為潛在的預(yù)后分子和新的治療靶點(diǎn)，從而改善肝癌患者的生存。后續(xù)還需更多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究來進(jìn)一步探究YTHDF1 和YTHDF2 發(fā)揮促癌作用的具體機(jī)制，為其作為潛在的肝癌治療的新靶點(diǎn)提供更確鑿的依據(jù)。

YTH 家族成員在各類腫瘤（特別是肝癌）中的相關(guān)研究結(jié)果顯示：YTHDC2 的表達(dá)在肝癌組織中明顯增加，并與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)[23]。另一報(bào)道則提出YTHDF1 在肝癌中高表達(dá)，并與較差的臨床結(jié)局相關(guān)[24]。此外，有研究[25]發(fā)現(xiàn)YTHDF2參與METTL3 介導(dǎo)的SOCS2 轉(zhuǎn)錄后沉默，從而在肝癌中發(fā)揮促癌作用。上述其他各團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)論與本課題的結(jié)論相一致。但也有文獻(xiàn)[26]提出了YTHDC2 作為肝癌抑癌基因的相反結(jié)論，意味著YTHDC2 參與調(diào)控肝癌機(jī)制的復(fù)雜性和異質(zhì)性。YTH 家族分子也參與了很多其他類型癌癥的進(jìn)展，例如YTHDC2 可以通過m6A 修飾促進(jìn)肺癌細(xì)胞中6PGD mRNA 的翻譯。YTHDC2 通過缺氧/HIF-1α/Twist1 信號(hào)通路在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促癌[27]。因此，YTH 基因家族（特別是YTHDF1、YTHDF2）在肝癌中的作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入的探索。

本研究通過對篩選的肝癌中與YTH 家族相關(guān)的基因進(jìn)行功能和通路富集分析，進(jìn)一步拓寬了我們對YTH 家族在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中作用的認(rèn)識(shí)。YTH 家族的主要功能指向代謝及生物合成及分解功能的調(diào)節(jié)，尤其是激素代謝、固醇類代謝、脂代謝、藥物分解代謝等，而肝臟是人體最重要的代謝器官，上述分析結(jié)果提示：YTH 家族的表達(dá)異常可能通過代謝相關(guān)通路的改變參與肝癌進(jìn)程。另外，近年來很多報(bào)道發(fā)現(xiàn)m6A 甲基化在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤譜可以作為新的生物標(biāo)志物，從而有效改善多種癌癥的診斷和預(yù)后[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)：在肝癌中多數(shù)YTH 家族成員的表達(dá)與CD4+T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及樹突細(xì)胞的浸潤呈顯著正相關(guān)，與巨噬細(xì)胞浸潤呈顯著負(fù)相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)[30]報(bào)道：CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、樹突細(xì)胞通常被認(rèn)為通過免疫反應(yīng)抑制癌癥進(jìn)展，但各種免疫逃避機(jī)制可能導(dǎo)致上述免疫細(xì)胞雖然能夠大量浸潤入腫瘤，卻無法發(fā)揮免疫抗癌功能，反而通過正反饋機(jī)制進(jìn)一步加劇了免疫細(xì)胞的浸潤。上述研究結(jié)論部分解釋了本研究的發(fā)現(xiàn)，提示YTH 家族成員（尤其是YTHDF1、YTHDF2）的異常表達(dá)可能通過某種特定機(jī)制改變肝癌中免疫細(xì)胞浸潤的構(gòu)成比，從而影響臨床結(jié)果和免疫治療的療效。本研究后續(xù)擬通過體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究YTHDF1 和YTHDF2 在肝癌免疫調(diào)節(jié)中所發(fā)揮的具體作用，為臨床肝癌患者新治療方案的發(fā)現(xiàn)提供更多的理論依據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)YTH 基因家族在肝癌中異常高表達(dá)，YTH 家族成員（尤其是YTHDF1、YTHDF2）是潛在的預(yù)后標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)，進(jìn)一步的深入研究將促使更多肝癌患者的生存受益。