賀思佳，黃倩，程進

（上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院腫瘤中心，上海200080）

肝癌（liver cancer）是消化系統(tǒng)常見腫瘤，也是全球第六大常見癌癥，被認為是導致癌癥死亡的第二大原因[1]。在我國，肝癌的發(fā)病率位于癌癥的第5位，而其病死率在癌癥病死率中高居第2 位[1-2]。目前，針對肝癌的分子靶向、化療、放療、免疫治療等綜合治療逐漸成為主要的治療手段，在一定程度上能夠改善肝癌患者預后[3-4]，然而，腫瘤復發(fā)仍是肝癌治療失敗的主要原因[5]，因此，從分子水平研究肝癌復發(fā)的發(fā)病機制尤為重要。

腫瘤再增殖（tumor repopulation）是指在放、化療等細胞毒性治療過程中，大量腫瘤細胞發(fā)生死亡，而少量殘存腫瘤細胞加速生長，形成新的腫瘤的過程[6-7]。腫瘤再增殖被認為是導致治療失敗和腫瘤復發(fā)的重要原因。有研究[25]認為腫瘤干細胞參與腫瘤再增殖。也有文獻[10-11]報道認為血管新生、巨噬細胞參與腫瘤再增殖過程。本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)放療后誘導產(chǎn)生的凋亡細胞能夠通過激活caspase-3，進一步活化下游不依賴鈣離子的磷 脂 酶 A2（Ca2+-independent phospholipase A2，iPLA2），在iPLA2的作用下，花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），以一種旁分泌的方式促進周圍殘存腫瘤細胞生長。這項研究首次提出放療誘導的凋亡細胞能夠刺激殘存腫瘤細胞再增殖，闡明了caspase-3-iPLA2-PGE2信號通路在其中的重要作用。此外，本課題[12]還發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C-δ（protein kinase C-δ，PKCδ）作為caspase-3 的底物，通過旁分泌VEGF-A 促進周圍殘存腫瘤細胞生長。由此可見，腫瘤再增殖是多重機制調(diào)控的結(jié)果，不斷更新研究結(jié)果將幫助更好地認識腫瘤再增殖這一過程。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種DNA 結(jié)合蛋白，其表達水平僅次于組蛋白，研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在多種腫瘤細胞及組織中過度表達，并參與DNA復制、轉(zhuǎn)錄、修復、腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等過程[13-16]。因此，本研究通過構(gòu)建肝癌細胞再增殖體外模型以及數(shù)據(jù)庫分析，探討HMGB1 與肝癌再增殖之間的相關性與臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

胎牛血清購自Gibco 公司，0.25%胰蛋白酶、Lipofectamine 2000 購自Thermo Fisher 公司，RPMI-1640 和DMEM 高糖培養(yǎng)基購自GE Healthcare 公司，嘌呤霉素購自上海生工，熒光素酶底物（Dluciferin potassium）購自Promega 公司，質(zhì)粒DNA 抽提試劑盒購自Omega 公司，甘草酸（Glycyrrhizin，Gly）購自于Santa Cruz Biotechnology 公司，本實驗中所采用的質(zhì)粒：plex-GFP-luc2、psPAX2、pMD2.G均由本課題組實驗室構(gòu)建保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)本研究采用的Huh7 和Li7 人源肝癌細胞株均購自上海中科院，Huh7 選用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，Li7 選用RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基均添加10% 胎牛血清、100 μg/mL 和100 U/mL 鏈霉素和青霉素。所有細胞均置于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建熒光素酶標記的報告細胞利用293T 工具細胞和Lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑盒按照說明書進行慢病毒包裝[17]。將5×105個Huh7 和Li7 細胞分別鋪于3.5 cm 培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，以1∶1 將1 mL 包裝好的慢病毒液和1 mL 10%完全培養(yǎng)基充分混合后加入培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)細胞，24 h 后更換新鮮的10%完全培養(yǎng)基。若熒光顯微鏡下GFP 陽性的細胞超過30%則將細胞全部消化接種至10 cm 培養(yǎng)皿中，待生長匯合度達到70%左右，更換含有嘌呤霉素（2 μg/mL）的10%完全培養(yǎng)基進行篩選，篩選2～4 周，獲得穩(wěn)定表達Fluc-GFP 的Huh7 和Li7 作為報告細胞，分別命名為Huh7-Fluc 和Li7-Fluc 細胞。

1.2.3 利用小動物活體成像儀進行腫瘤細胞生物成像往鋪有細胞的24 孔板或者96 孔板中加入熒光素酶底物（終濃度0.15 mg/mL），然后置入小動物成像儀中進行生物成像，檢測熒光素酶活性。

1.2.4 驗證細胞數(shù)量與熒光素酶活性之間的線性關系為了證明報告細胞的數(shù)量與其所表達的熒光素酶活性呈線性關系，將對數(shù)生長期的Huh7-Fluc和Li7-Fluc 細胞消化后計數(shù)，以250、500、750、1 000、1 200、1 500、1 750 和2 000 個鋪于96 孔板中，每組設置3 個復孔，每孔加入100 μL 10%完全培養(yǎng)基。24 h 后待細胞貼壁后將24 孔板置于小動物活體成像儀中成像，并將所測得各組的光信號強度與報告細胞的數(shù)量進行統(tǒng)計學分析，為構(gòu)建體外肝癌細胞再增殖模型提供基礎。

1.2.5 構(gòu)建肝癌細胞再增殖模型取對數(shù)生長期的肝癌細胞Huh7 消化后計數(shù)，按照1×105個/孔鋪于24 孔板中，每組設置3 個復孔。24 h 后待細胞貼壁后，將24孔板置于Onor線性加速器（上海市第一人民醫(yī)院放射治療科，劑量率為3.6 Gy/min）中進行或不進行單次10 Gy 劑量X 射線照射處理，以此作為飼養(yǎng)細胞。次日，將Huh7-Fluc 細胞按照1 000 個/孔分別鋪入飼養(yǎng)細胞所在的24 孔板中，另在空白孔中按照1 000 個/孔單純接種報告細胞作為陰性對照。24 孔板以2%完全培養(yǎng)基每孔1 mL繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)6 d 后，進行細胞化學發(fā)光成像。Li7 肝癌細胞再增殖模型構(gòu)建方法同Huh7。

1.2.6 使用HMGB1 抑制劑處理肝癌細胞再增殖模型肝癌細胞再增殖模型構(gòu)建同前，對飼養(yǎng)細胞和報告細胞共培養(yǎng)組、報告細胞單獨培養(yǎng)組均設立HMGB1 抑制劑Gly 處理組和對照組，均在每隔2 d更換2%完全培養(yǎng)基時加入。加藥處理4 次后進行細胞生物成像。

1.2.7 TIMER2.0、GEPIA2 數(shù)據(jù)庫分析TIMER2.0 是一個免費的交互式Web 服務數(shù)據(jù)庫，其中Exploration 模塊中的Gene_DE 可用于分析TCGA 數(shù)據(jù)庫HMGB1 在肝癌與癌旁組織之間的表達差異[18]。登錄此數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址（http://timer.cistrome.org），選擇Exploration 中的Gene_DE，在Gene Expression 中輸入HMGB1 即可獲得HMGB1 在肝癌及癌旁組織中的表達差異。GEPIA2（gene expression profiling interactive analysis）即基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析，是一個基于TCGA 與GTEx 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫建立的可視化癌癥大數(shù)據(jù)分析平臺。利用此平臺對HMGB1 表達水平與肝癌患者生存預后的關系進行分析[19]。篩選條件設置為：⑴gene：HMGB1；⑵methods：overall survival；⑶ group cutoff:quartile；⑷ hazards ratio（HR）：yes；⑸95% confidence interval：yes；⑹axis units:months；⑺datasets selection（cancer name）：LIHC。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。相關性分析采用Spearman 等級相關分析，兩組間均數(shù)比較采用Student'st檢驗，多組間差異的比較采用單因素方差分析，采用Kaplan-Meier 分析方法繪制生存曲線，Log-rank 檢驗來分析HMGB1 的表達與肝癌預后的相關性，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定表達熒光素酶的肝癌細胞的數(shù)量與光信號強度呈線性相關

通過將所測得的各組化學發(fā)光信號強度與報告細胞數(shù)量進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示穩(wěn)定表達熒光素酶的Huh7-Fluc 和Li7-Fluc 細胞數(shù)量與光信號強度之間呈現(xiàn)出良好的線性關系，R2分別為0.989 9和0.990 1（圖1）。因此，本實驗通過成像檢測化學發(fā)光信號強度來反映報告細胞的增殖情況，為構(gòu)建體外肝癌腫瘤再增殖模型提供基礎。

圖1 報告細胞的數(shù)量與熒光素酶活性的線性關系A：Huh7-Fluc報告細胞的數(shù)量與熒光素酶活性呈線性關系；B：Li7-Fluc報告細胞的數(shù)量與熒光素酶活性呈線性關系Figure1 Linear relation between luciferase activity and reporter cell numbersA:Linear relation between luciferase activity of Huh7-Fluc and reporter cell numbers;B:Linear relation between luciferase activity of Li7-Fluc and reporter cell numbers

2.2 X射線照射處理后的肝癌細胞能夠促進未照射的肝癌細胞發(fā)生腫瘤再增殖

將單次10 Gy 劑量X 射線處理或不處理的腫瘤細胞Huh7 和Li7 作為飼養(yǎng)細胞分別與相應的報告細胞Huh7-Fluc 和Li7-Fluc 進行共培養(yǎng)，6 d 后通過小動物成像儀進行成像，結(jié)果顯示相對于單純報告細胞組和未經(jīng)X 射線處理飼養(yǎng)細胞組，X 射線處理后的飼養(yǎng)細胞對報告細胞的促生長作用更明顯（均P<0.01）。表明X 射線照射后的肝癌細胞能夠促進活肝癌細胞增殖，在一定程度上以體外模型的方式再現(xiàn)了臨床上放療過程中發(fā)生的腫瘤再增殖現(xiàn)象（圖2）。

圖2 各組報告細胞增殖檢測Figure 2 Determination of growth of reporter cells in each group

2.3 抑制HMGB1可減弱X射線誘導的腫瘤再增殖

為了研究HMGB1 在X 射線誘導的肝癌細胞再增殖中的作用，在模型中加入HMGB1 抑制劑Gly，6 d 后通過小動物成像儀進行成像，結(jié)果顯示加入HMGB1 抑制劑后X 射線處理后的飼養(yǎng)細胞對報告細胞的生長刺激作用明顯減弱，但相同HMGB1 抑制劑濃度處理過的報告細胞并沒有表現(xiàn)出明顯的生長抑制，表明此濃度的HMGB1 抑制劑對于細胞本身無明顯毒性作用，而對肝癌細胞再增殖模型卻有明顯的抑制作用，抑制劑濃度越高其對模型的抑制作用更明顯（P<0.01），HMGB1 參與了X 射線誘導的肝癌再增殖的過程（圖3）。

圖3 HMGB1抑制劑Gly對報告細胞增殖的影響Figure 3 Effects of HMGB1 inhibitor Gly on reporter cells

2.4 TIMER2.0與GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析

利用TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集對HMGB1 基因在泛癌中的表達水平進行分析。結(jié)果顯示HMGB1 在不同癌種中的表達水平不同，其中，在肝癌組織（LIHC）中其表達水平明顯高于癌旁組織（P<0.01）（圖4A）。

利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集進行在線生存分析。結(jié)果顯示在肝癌中，HMGB1 基因高表達組（n=91）總生存期（overall survival，OS）較HMGB1 低表達組（n=91）更短（HR=1.8，P=0.022），差異具有統(tǒng)計學意義。表明HMGB1 的表達與肝癌的總生存期呈負相關（圖4B）。而HMGB1 的表達與肝癌的無病生存期（disease free survival，RFS）無明顯相關性（HR=1.5，P=0.059）（圖4C）。

圖4 HMGB1在肝癌組織中的表達水平以及與肝癌預后的相關性A：HMGB1在多種腫瘤中的表達情況；B-C：HMGB1的表達水平與肝癌預后關系Figure 4 The expression level of HMGB1 in liver cancer and the relationship between HMGB1 and prognosis of liver cancer patientsA:The expression level of HMGB1 in variety of cancers and adjacent normal tissue;B-C:The relationship be‐tween HMGB1 and prognosis of liver cancer patients

3 討論

肝癌作為常見的消化道惡性腫瘤，早期缺乏特異性癥狀，確診時往往處于晚期。盡管，隨著目前綜合治療方式的更新和相應的臨床試驗的進展，晚期肝癌患者的生存預后已獲得了一定的改善，但是肝癌復發(fā)仍是導致患者疾病進展的重要原因[20-22]。

腫瘤再增殖作為腫瘤復發(fā)的重要機制之一，目前人們對導致其發(fā)生的相關分子機制尚不完全了解[6]。本課題組長期從事腫瘤再增殖現(xiàn)象的機制研究，為了研究其中的調(diào)控機制，本研究構(gòu)建了腫瘤再增殖模型，并成功在體外模擬了腫瘤再增殖這一過程，為后續(xù)研究提供了良好的模型基礎[17]。在本研究中，首先構(gòu)建了表達Fluc-GFP 的報告細胞，并成功利用肝癌細胞構(gòu)建了腫瘤再增殖模型，明確了X 射線能夠誘導肝癌細胞再增殖的發(fā)生，也進一步證實腫瘤再增殖這一現(xiàn)象的普遍性。

HMGB1 作為一種核蛋白，在細胞中表達豐度極高，僅次于組蛋白，在進化過程中高度保守且功能強大[23]。HMGB1 在分子結(jié)構(gòu)上主要由2 個DNA 結(jié)合區(qū)域（HMG A box 和HMG B box）和1 個C端酸性尾端組成，已被證實在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用[14,24]。已有研究[14]表明，HMGB1 的功能與其在細胞中的定位及翻譯后修飾有關。在細胞核中，HMGB1 參與DNA 復制、修復、轉(zhuǎn)錄及維持基因組穩(wěn)定等[25-26]，在胞漿中，HMGB1 被認為是一種自噬的正向調(diào)控蛋白，能夠與自噬蛋白Beclin-1 集合，誘導自噬發(fā)生[27]。而HMGB1 在細胞中的定位并不是一成不變，研究[23,28-30]表明，在生理或者病理狀態(tài)下，HMGB1 能夠通過主動或者被動的方式釋放至細胞外，參與炎癥、免疫、細胞生長、細胞死亡等生理病理過程。此外，在腫瘤中，HMGB1 對于腫瘤的作用主要由自身的氧化還原狀態(tài)決定。研究[14]表明，還原型的HMGB1 主要對腫瘤生長起促進作用，而氧化型HMGB1 可以誘導腫瘤發(fā)生凋亡。另外，外源性HMGB1 能夠通過細胞內(nèi)吞的方式進入線粒體，誘導線粒體發(fā)生腫脹而引起細胞死亡。本課題前期研究[31-32]發(fā)現(xiàn)，放、化療等細胞毒性治療能夠誘導腫瘤細胞釋放HMGB1。在本研究中，通過在肝癌細胞再增殖模型中加入HMGB1 抑制劑Gly，觀察抑制HMGB1 的表達和釋放對肝癌細胞再增殖的影響。從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，加入Gly 的肝癌細胞再增殖模型被顯著抑制，表明HMGB1 參與了X 射線誘導的肝癌細胞腫瘤再增殖，HMGB1 有可能作為提高肝癌患者治療效果和減少肝癌復發(fā)的潛在治療靶點。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，腫瘤相關生物數(shù)據(jù)庫使得高效分析基因測序數(shù)據(jù)成為可能，利用數(shù)據(jù)庫的模塊進行在線分析，是一種研究基因與腫瘤相關性的有效且便捷的方式。在本研究中，利用TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)HMGB1 在絕大多數(shù)惡性腫瘤中呈高表達，其中在肝癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織。此外，本研究還利用GEPIA2 數(shù)據(jù)庫對HMGB1 表達水平與肝癌患者預后的相關性進行分析，結(jié)果顯示HMGB1 表達水平與肝癌患者的無病生存期無顯著相關性，但是HMGB1 高表達的肝癌患者總生存期短，表明HMGB1 可能作為判斷肝癌患者總生存期預后的潛在標記物。

綜上所述，HMGB1 在肝癌組織中呈高表達，與肝癌患者總生存期預后負相關，同時，HMGB1參與了X 射線誘導的肝癌細胞再增殖過程，通過HMGB1 抑制劑Gly 能夠顯著抑制這一過程。雖然，HMGB1 調(diào)控肝癌細胞再增殖的具體分子機制尚未明確，HMGB1 抑制劑能否用于臨床上預防放療后肝癌復發(fā)，還需要進一步的深入研究，但本研究為理解和預防肝癌復發(fā)提供了新的思路。