姑麗米日·依馬木 王巧云 林成
長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)H19作為最早發(fā)現(xiàn)的印記基因,參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1-2],然而,其在口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)組織中的表達(dá)及其對(duì)OSCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響尚不清楚。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是調(diào)控腫瘤細(xì)胞Warburg作用的核心分子,與OSCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。本研究探討了H19和HIF-1α在人OSCC組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系,并檢測(cè)了H19對(duì)OSCC細(xì)胞增殖、侵襲和細(xì)胞周期進(jìn)程的影響以及HIF-1α表達(dá)的調(diào)控。
納入2017 年1月~2018 年1 月解放軍474醫(yī)院口腔科收治的45 例OSCC患者(6 例女性,39 例男性);34~75 歲,中位年齡54 歲;TNM I-II期:18 例,TNM III-IV期:27 例;病理分化低/中:21 例,病理分化高:24 例。手術(shù)切取腫瘤組織及癌旁組織(距離原發(fā)灶>5 cm),所有患者均初次被診斷為OSCC,術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療, 研究前簽署知情同意書。
RPMI-1640+10%FBS(Gibco,美國(guó))培養(yǎng)人OSCC細(xì)胞系SCC-4、SCC-9、SCC-25、Cal-27、TCA8113及KB(上海中國(guó)科學(xué)院),在293T細(xì)胞系中進(jìn)行慢病毒包裝,過表達(dá)及干擾病毒(上海漢恒生物)分別感染Cal-27及SCC-9細(xì)胞3 d, 1/1000 Polybrene促進(jìn)感染效率,嘌呤霉素篩選細(xì)胞直至穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)。
Trizol(Takara,日本)提取OSCC組織及細(xì)胞系中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA產(chǎn)物,設(shè)計(jì)合成引物:H19、HIF-1α及內(nèi)參基因GAPDH,10 μL Sybrgreen(ThemoFisher, 美國(guó))中加入0.5 μmol/L引物和5 μL cDNA,置RT-qPCR(7500, ThemoFisher,美國(guó))中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:95 ℃, 5 min; 95 ℃, 5 s for 40 cycles; 60 ℃, 30 s. 2-ΔΔCt法計(jì)算H19及HIF-1α的相對(duì)表達(dá)水平。
待檢測(cè)細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔板中,培養(yǎng)過夜,直到細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下貼壁生長(zhǎng)。將MTT與RPMI-1640+10%FBS培養(yǎng)基1∶5混合,加入10%FBS,在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h,同時(shí)避光。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處0、24、48、72 h時(shí)的吸光度。用24、48、72 h的吸光度與0 h的吸光度之比表示細(xì)胞的相對(duì)增殖能力。
50 mg/L基質(zhì)膠覆蓋Transwell小室,RPMI-1640+1%FBS稀釋細(xì)胞至5×104個(gè)/mL,取200 μL加入上小室,600 μL RPMI-1640+10%FBS加入下室,培養(yǎng)24 h,棉簽拭去上室面細(xì)胞,多聚甲醛固定10 min后采用0.1%結(jié)晶紫染色30 min,40×10顯微鏡(DM1000,Leica, 德國(guó))觀察拍照,ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
待檢細(xì)胞消化后重懸, 4 ℃預(yù)冷70%乙醇固定過夜100 μg/mL RNase A孵育30 min,250 μL 0.05 g/L碘化丙啶(PI)室溫避光處理細(xì)胞30 min,流式細(xì)胞儀(BD,美國(guó))進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
RIPA裂解液裂解細(xì)胞蛋白,10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移到PVDF膜(0.45 μm,Thermo-Scientific, 美國(guó)),5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h,HIF-1α(1∶500稀釋,93 kDa,abcam,ab113642),β-Actin(1∶2 000稀釋, 42 kDa,abcam,ab8226)抗體4 ℃孵育過夜,洗膜后鼠二抗(1∶2 000稀釋,abcam,ab6728)室溫孵育2 h,加入ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑,化學(xué)發(fā)光儀(Geldoc XR, Bio-Rad,美國(guó))檢測(cè)條帶信號(hào)強(qiáng)度。
RT-qPCR結(jié)果顯示H19及HIF-1α在OSCC組織中高表達(dá)(圖 1A、1B),Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示H19 及HIF-1α表達(dá)在OSCC組織中顯著正相關(guān)(Pearson's rho=0.558,P<0.001,圖 1C)。
圖 1 H19及HIF-1α在口腔鱗癌及正常組織中的表達(dá)及其相關(guān)性
在檢測(cè)OSCC細(xì)胞系H19差異表達(dá)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了以Cal-27細(xì)胞系為模型的H19過表達(dá)細(xì)胞系及以SCC-9細(xì)胞系為模型的H19干擾細(xì)胞系(圖 2)。
圖 2 H19在OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)及H19的過表達(dá)及干擾細(xì)胞系構(gòu)建
MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與Cal-27 oecontrol相比,Cal-27 oeH19細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)(圖 3A),而與SCC-9 sicontrol 相比,SCC-9 siH19細(xì)胞活力明顯抑制(圖 3B)。
圖 3 H19過表達(dá)及干擾對(duì)OSCC細(xì)胞增殖的影響
Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與Cal-27 oecontrol(50.6±7.7 個(gè)/視野)相比,Cal-27 oeH19侵襲細(xì)胞數(shù)(124.1±13.5 個(gè)/視野)顯著增多(圖 4A);而與SCC-9 sicontrol(57.2±8.4 個(gè)/視野)相比,SCC-9 siH19侵襲細(xì)胞數(shù)(107.5±11.3 個(gè)/視野)顯著減少(圖 4B)。
圖 4 H19對(duì)Cal-27細(xì)胞侵襲的影響
細(xì)胞周期分析結(jié)果表明,H19過表達(dá)使G0/G1期比值顯著降低,而G2/M期增高,干擾H19使G0/G1期比值顯著增高,而S及G2/M期顯著降低(圖 5)。
圖 5 H19對(duì)Cal-27細(xì)胞周期的影響
RT-qPCR結(jié)果顯示,H19過表達(dá)顯著上調(diào)HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá),干擾H19顯著抑制HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)(圖 6)。
圖 6 H19對(duì)Cal-27細(xì)胞中HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)的影響
H19基因位于人類染色體11p15.5, 在胚胎組織中表達(dá)較高[5]。近年來許多研究報(bào)道 H19參與乳腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展:H19可通過調(diào)控17β-雌二醇及泛素連接酶E3,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[6-8],并通過靶向CALN1和miR-141促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[9-10],同時(shí)也在結(jié)直腸癌及非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮促癌作用[11-12],但其在OSCC中的生物學(xué)功能仍是空白。
HIF-1α作為糖酵解的主要調(diào)節(jié)因子,參與腫瘤細(xì)胞Warburg效應(yīng)[13-14],在OSCC中,研究表明HIF-1α表達(dá)與患者不良預(yù)后正相關(guān)[15],在體外,其可促進(jìn)OSCC細(xì)胞的遷移、侵襲和放療抵抗[16-17],且HIF-1α也參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)[18]。近年有研究指出,H19可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外缺血缺氧環(huán)境下的生存能力[19],提示H19可能通過調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)分子如HIF-1α發(fā)揮生物學(xué)作用。
本研究發(fā)現(xiàn)H19及HIF-1α在OSCC組織中高表達(dá),且呈顯著正相關(guān)。在體外,H19可促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖、侵襲和細(xì)胞周期進(jìn)程,同時(shí)可顯著上調(diào)HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)水平,提示H19促進(jìn)HIF-1α轉(zhuǎn)錄或維持其mRNA穩(wěn)定性,這為揭示OSCC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制和治療提供了新的依據(jù)。