姑麗米日·依馬木 王巧云 林成

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)H19作為最早發(fā)現(xiàn)的印記基因，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1-2]，然而，其在口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)組織中的表達(dá)及其對(duì)OSCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響尚不清楚。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是調(diào)控腫瘤細(xì)胞Warburg作用的核心分子，與OSCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。本研究探討了H19和HIF-1α在人OSCC組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系，并檢測(cè)了H19對(duì)OSCC細(xì)胞增殖、侵襲和細(xì)胞周期進(jìn)程的影響以及HIF-1α表達(dá)的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來源

納入2017 年1月～2018 年1 月解放軍474醫(yī)院口腔科收治的45 例OSCC患者(6 例女性，39 例男性)；34～75 歲，中位年齡54 歲；TNM I-II期：18 例，TNM III-IV期：27 例；病理分化低/中：21 例，病理分化高：24 例。手術(shù)切取腫瘤組織及癌旁組織(距離原發(fā)灶>5 cm)，所有患者均初次被診斷為OSCC，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療， 研究前簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染

RPMI-1640+10%FBS(Gibco，美國(guó))培養(yǎng)人OSCC細(xì)胞系SCC-4、SCC-9、SCC-25、Cal-27、TCA8113及KB(上海中國(guó)科學(xué)院)，在293T細(xì)胞系中進(jìn)行慢病毒包裝，過表達(dá)及干擾病毒(上海漢恒生物)分別感染Cal-27及SCC-9細(xì)胞3 d， 1/1000 Polybrene促進(jìn)感染效率，嘌呤霉素篩選細(xì)胞直至穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)

Trizol(Takara，日本)提取OSCC組織及細(xì)胞系中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA產(chǎn)物，設(shè)計(jì)合成引物：H19、HIF-1α及內(nèi)參基因GAPDH，10 μL Sybrgreen(ThemoFisher, 美國(guó))中加入0.5 μmol/L引物和5 μL cDNA,置RT-qPCR(7500, ThemoFisher,美國(guó))中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃, 5 min; 95 ℃, 5 s for 40 cycles; 60 ℃, 30 s. 2-ΔΔCt法計(jì)算H19及HIF-1α的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

待檢測(cè)細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)過夜，直到細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下貼壁生長(zhǎng)。將MTT與RPMI-1640+10%FBS培養(yǎng)基1∶5混合，加入10%FBS，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，同時(shí)避光。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處0、24、48、72 h時(shí)的吸光度。用24、48、72 h的吸光度與0 h的吸光度之比表示細(xì)胞的相對(duì)增殖能力。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

50 mg/L基質(zhì)膠覆蓋Transwell小室，RPMI-1640+1%FBS稀釋細(xì)胞至5×104個(gè)/mL，取200 μL加入上小室，600 μL RPMI-1640+10%FBS加入下室，培養(yǎng)24 h，棉簽拭去上室面細(xì)胞，多聚甲醛固定10 min后采用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，40×10顯微鏡(DM1000，Leica, 德國(guó))觀察拍照，ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞周期分析

待檢細(xì)胞消化后重懸， 4 ℃預(yù)冷70%乙醇固定過夜100 μg/mL RNase A孵育30 min，250 μL 0.05 g/L碘化丙啶(PI)室溫避光處理細(xì)胞30 min，流式細(xì)胞儀(BD,美國(guó))進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.7 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

RIPA裂解液裂解細(xì)胞蛋白，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜(0.45 μm，Thermo-Scientific, 美國(guó))，5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，HIF-1α(1∶500稀釋，93 kDa，abcam，ab113642)，β-Actin(1∶2 000稀釋， 42 kDa，abcam，ab8226)抗體4 ℃孵育過夜，洗膜后鼠二抗(1∶2 000稀釋，abcam，ab6728)室溫孵育2 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，化學(xué)發(fā)光儀(Geldoc XR， Bio-Rad，美國(guó))檢測(cè)條帶信號(hào)強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 H19及HIF-1α在組織中的表達(dá)及其相關(guān)性

RT-qPCR結(jié)果顯示H19及HIF-1α在OSCC組織中高表達(dá)(圖 1A、1B)，Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示H19 及HIF-1α表達(dá)在OSCC組織中顯著正相關(guān)(Pearson's rho=0.558,P<0.001，圖 1C)。

圖 1 H19及HIF-1α在口腔鱗癌及正常組織中的表達(dá)及其相關(guān)性

2.2 H19在Cal-27細(xì)胞中的表達(dá)及H19的過表達(dá)及干擾細(xì)胞系構(gòu)建

在檢測(cè)OSCC細(xì)胞系H19差異表達(dá)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了以Cal-27細(xì)胞系為模型的H19過表達(dá)細(xì)胞系及以SCC-9細(xì)胞系為模型的H19干擾細(xì)胞系(圖 2)。

圖 2 H19在OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)及H19的過表達(dá)及干擾細(xì)胞系構(gòu)建

2.3 H19過表達(dá)及干擾對(duì)OSCC細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Cal-27 oecontrol相比，Cal-27 oeH19細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)(圖 3A)，而與SCC-9 sicontrol 相比，SCC-9 siH19細(xì)胞活力明顯抑制(圖 3B)。

圖 3 H19過表達(dá)及干擾對(duì)OSCC細(xì)胞增殖的影響

2.4 H19過表達(dá)及干擾對(duì)OSCC細(xì)胞侵襲的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Cal-27 oecontrol(50.6±7.7 個(gè)/視野)相比，Cal-27 oeH19侵襲細(xì)胞數(shù)(124.1±13.5 個(gè)/視野)顯著增多(圖 4A)；而與SCC-9 sicontrol(57.2±8.4 個(gè)/視野)相比，SCC-9 siH19侵襲細(xì)胞數(shù)(107.5±11.3 個(gè)/視野)顯著減少(圖 4B)。

圖 4 H19對(duì)Cal-27細(xì)胞侵襲的影響

2.5 H19過表達(dá)及干擾對(duì)OSCC細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，H19過表達(dá)使G0/G1期比值顯著降低，而G2/M期增高，干擾H19使G0/G1期比值顯著增高，而S及G2/M期顯著降低(圖 5)。

圖 5 H19對(duì)Cal-27細(xì)胞周期的影響

2.6 H19過表達(dá)及干擾對(duì)HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，H19過表達(dá)顯著上調(diào)HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)，干擾H19顯著抑制HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)(圖 6)。

圖 6 H19對(duì)Cal-27細(xì)胞中HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

H19基因位于人類染色體11p15.5， 在胚胎組織中表達(dá)較高[5]。近年來許多研究報(bào)道 H19參與乳腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展：H19可通過調(diào)控17β-雌二醇及泛素連接酶E3，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[6-8]，并通過靶向CALN1和miR-141促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[9-10]，同時(shí)也在結(jié)直腸癌及非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮促癌作用[11-12]，但其在OSCC中的生物學(xué)功能仍是空白。

HIF-1α作為糖酵解的主要調(diào)節(jié)因子，參與腫瘤細(xì)胞Warburg效應(yīng)[13-14]，在OSCC中，研究表明HIF-1α表達(dá)與患者不良預(yù)后正相關(guān)[15]，在體外，其可促進(jìn)OSCC細(xì)胞的遷移、侵襲和放療抵抗[16-17]，且HIF-1α也參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)[18]。近年有研究指出，H19可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外缺血缺氧環(huán)境下的生存能力[19]，提示H19可能通過調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)分子如HIF-1α發(fā)揮生物學(xué)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)H19及HIF-1α在OSCC組織中高表達(dá)，且呈顯著正相關(guān)。在體外，H19可促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖、侵襲和細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)可顯著上調(diào)HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)水平，提示H19促進(jìn)HIF-1α轉(zhuǎn)錄或維持其mRNA穩(wěn)定性，這為揭示OSCC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制和治療提供了新的依據(jù)。