賈昌鋒，高海霞，祝 茜，張 雷，2

（1.山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東威海 264209；2.威海長青海洋科技股份有限公司，山東榮成 264200）

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP）是一個高度保守的細(xì)胞蛋白超家族，存在于包括魚類在內(nèi)的所有生物中［1－2］。近年來，在應(yīng)激刺激和正常生理條件下，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生態(tài)、進(jìn)化和先天免疫反應(yīng)等方面受到了廣泛關(guān)注［3－4］。傳統(tǒng)意義上，HSP可按分子量分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP47和sHSP［5］。其中，由于HSP70在呈遞抗原、自身免疫和腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用［6－7］，成為研究最為廣泛的家族［8］。目前學(xué)術(shù)界普遍將HSP70家族分為：組成型的熱休克同源蛋白70（heat shock cognate protein 70，HSC70）和誘導(dǎo)型HSP70［9-12］。前者以組成方式表達(dá)，主要在細(xì)胞分裂、增殖和發(fā)育等生理條件下發(fā)揮作用［13－14］；后者則在環(huán)境和生物脅迫下表達(dá)，如熱休克和微生物感染等［15－16］。但研究表明，兩者在魚類中發(fā)揮的作用幾乎相同。

盡管HSP70家族在硬骨魚類中的研究越來越廣泛，但也局限于少數(shù)魚類HSP70的識別，如虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［17］、斑馬 魚（Danio rerio）［18］和美洲鰣（Alosa sapidissima）［19］等，以及從少部分魚類分離出來HSC70基因，如斑馬魚［20］、鱖（Siniperca chuatsi）［21］、大 菱 鲆（Scophthalmus maximus）［22］、草魚（Ctenopharyngodon idella）［9］和紋鱧（Channa striatus）［23］等。然而，在松江 鱸（Trachidermus fasciatus）中，還未見有關(guān)HSP70家族的研究報道。

松江鱸被發(fā)現(xiàn)于東北亞的東海岸［24］，被收錄到國家重點保護(hù)野生動物名錄和《中國紅皮書》第二類嚴(yán)重瀕危物種［25］，具有極高的生物、生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價值［26］。然而，在過去的幾十年里，松江鱸的野生種群數(shù)量急劇下降［25］，在我國許多水域甚至已絕跡［26］。因此，通過水產(chǎn)養(yǎng)殖等替代方法以恢復(fù)松江鱸的資源量已迫在眉睫。深入了解松江鱸在應(yīng)對病原體時的免疫應(yīng)答，有助于制定有效的疾病控制措施，促進(jìn)種群的長期可持續(xù)性發(fā)展。然而，目前對松江鱸的免疫研究尚較少［27］。本研究從松江鱸體內(nèi)克隆并鑒定一個HSC70基因（即TfHsc70），并檢測了TfHsc70 mRNA在松江鱸組織中的分布，以及脂多糖（LPS）刺激后TfHsc70的時間表達(dá)規(guī)律，以期為魚類免疫應(yīng)答中的HSC70蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料預(yù)處理

實驗材料選用取自山東省威海市文登區(qū)埠口港的9～10月齡、體質(zhì)量（19±4）g的松江鱸。實驗前，將100尾松江鱸放在流通海水系統(tǒng)（1.2 m×0.45 m×0.5 m）中馴化一周左右，期間持續(xù)通氣并保持溫度為（13±1）℃（其他條件與自然海水相同）。在此過程中，有任何皮膚損傷或疾病跡象均不得進(jìn)入馴化環(huán)境。

將松江鱸分為試驗組和對照組，每組各50尾魚。試驗組腹腔注射來源于大腸桿菌的0.04 μg·g－1LPS（Sigma，St.Louis，MO，USA）（約50μL）；對照組注射0.01 mol·L－1磷酸鹽溶液（PBS）50μL。完成注射后將魚放回流通海水系統(tǒng)，并在注射2、6、12、24、48、72、96 h后各時間點隨機(jī)抽取6尾魚。

在保證無菌條件的前提下，分別采集松江鱸的血液、心臟、肝臟、皮膚、胃、腸、脾臟、腎臟、大腦、鰓等組織，并將這些組織立即冷凍在液氮中，－80℃冰箱凍存?zhèn)溆?，用于后續(xù)RNA的提取。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

使用EZNATMMicroElute?Total RNA Kit II（QMEGA，USA）從松江鱸的各種組織中提取總RNA，采用OD260／280法檢測RNA提取質(zhì)量，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。第一鏈cDNA的合成采用SMART cDNA（BD Biosciences Clontech）方法，使用oligo-anchor R和Smart F引物，如表1所示。

1.3 克隆松江鱸TfHsc70基因cDNA全長

根據(jù)松江鱸肝臟cDNA文庫隨機(jī)測序得到的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST），設(shè)計一對基因特異性引物（TfHsc70F，TfHsc70R），其將用于后續(xù)的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。PCR反應(yīng)體積為25μL，包括PCR mix kit（Fermentas）12.5μL，引物各1μL（10μmol·L－1），Taq聚合酶0.25μL（TaKaRa），cDNA 1μL，Milli-Q水9.25μL。PCR反應(yīng)的最佳條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃50 s，50℃45 s，72℃30 s，運行30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物選用PCR純化試劑盒（BioFlux）純化，將純化產(chǎn)物與pMD18-T載體（TaKaRa）連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。陽性克隆由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司選擇并測序。所得序列通過在線BLAST程序（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）比對，從而確認(rèn)為Hsc70序列。利用cDNA末端（RACE）快速擴(kuò)增得到TfHsc70的cDNA全長序列。5′-RACE使用5′引物與基因特異性引物TfHsc70R配對，3′-RACE使用3′anchor R與TfHsc70F引物配對（表1）。PCR程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃50 s，55℃45 s，72℃30 s，運行30個循環(huán)；72℃延伸10 min。對獲得的PCR序列進(jìn)行克隆測序。

1.4 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）和蛋白分析數(shù)據(jù)庫（http：／／www.expasy.org／）對TfHsc70的cDNA和氨基酸序列進(jìn)行分 析。使 用SMART service（http：／／smart.embl-heidelberg.de／）預(yù)測特定保守區(qū)域。用SignalP 3.0預(yù)測信號肽（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）。利用DNAStar 5.0軟件包中的EditSeq預(yù)測分子質(zhì)量和等電點。使用SWISS-MODEL（http：／／swissmodel.expasy.org／）預(yù)測三維結(jié)構(gòu)。利用Clustal W和DNAman軟件進(jìn)行序列比對，然后采用MEGA X實現(xiàn)的鄰接方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［28］。通過1 000次bootstrap抽樣來評估系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠行。

1.5 LPS刺激后TfHsc70的組織分布和時間表達(dá)

采用實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）技術(shù)分析松江鱸TfHsc70 mRNA的組織特異性表達(dá)，同時測定使用LPS刺激后的時間表達(dá)譜系。

設(shè)計引物QTfHsc70F和QTfHsc70R（表1）擴(kuò)增TfHsc70片段。β-肌動蛋白為內(nèi)參，引物為Actin F和Actin R（表1）。qRT-PCR使用SYBR Premix Ex TaqTM（Takara，日本），使用ABI 7300實時檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）進(jìn)行，總?cè)萘繛?0μL，包含10μL的2×SYBR Premix Ex TaqTM，2μL的1∶100稀釋的cDNA，每種引物各4μL（1μmol·L－1）。擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性3 min，94℃15 s，56℃20 s，運行40個循環(huán)，然后進(jìn)行最后的裂解階段。利用解離曲線分析驗證PCR產(chǎn)物的特異性。所得數(shù)據(jù)歸一化至肌動蛋白，且所有樣本重復(fù)3次。通過2－ΔΔCT方法對所得實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行量化處理，采用未配對、雙尾t檢驗來評價對照組和試驗組之間的顯著性差異。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

表1 TfHsc70基因擴(kuò)增和表達(dá)所用引物Tab.1 Primer of TfHsc70 used for cloning and expression

2 結(jié)果與分析

2.1 TfHsc70的分子克隆和序列分析

通過5′-RACE和3′-RACE技術(shù)，得到全長2 138 bp的TfHsc70 cDNA（圖1）。TfHsc70的cDNA包括1個1 947 bp的開放閱讀框（ORF），1個78 bp的5′端未翻譯區(qū)（UTR）和1個95 bp的3′端帶有終止密碼子（TAA）的UTR。在poly A序列上游87 bp處發(fā)現(xiàn)一個典型的聚腺苷酸化信號序列（AATAAA）。該蛋白具有649個氨基酸，理論分子量為71.1 kDa，等電點為5.27。

序列比對顯示，TfHsc70含有3個保守標(biāo)記序列（GIDLGTTY、DLGGGTFD和VLVGGSTRIPKIQK）和1個ATP-GTP結(jié)合位點基序（AEAYLGKT），且在羧基區(qū)，TfHsc70有兩個GGXP基序四肽，且在末端有保守的細(xì)胞質(zhì)特異性基序EEVD。此外，在該序列中還發(fā)現(xiàn)了偶聯(lián)核定位信號和經(jīng)典的多聚腺苷酸化信號（圖1）。

圖1 TfHsc70的mRNA和預(yù)測氨基酸序列Fig.1 The mRNA and predicted amino acid sequence of TfHsc70

通過SWISS-MODEL生成三維結(jié)構(gòu)模型可以發(fā)現(xiàn)，TfHsc70蛋白包括兩個主要結(jié)構(gòu)域，包括在氨基末端區(qū)域發(fā)現(xiàn)的ATP酶結(jié)構(gòu)域和在羧基末端發(fā)現(xiàn)與肽結(jié)合的結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖2 TfHsc70的三級結(jié)構(gòu)Fig.2 Tertiary structure of TfHsc70

氨基酸序列比對結(jié)果顯示，松江鱸HSC70（TfHsc70）與 五條鰤（Seriola quinqueradiata）HSC70的一致性最高，達(dá)到97.09%［29］。而它與包括兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳動物在內(nèi)的其他物種具有85.36%～93.98%的相似性?；隰~類、兩棲類、哺乳動物等25個物種氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，硬骨魚與其他脊椎動物存在差異（圖3）。

圖3 Tf Hsc70系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of TfHsc70

2.2 TfHsc70 mRNA的組織分布

為了檢測TfHsc70在松江鱸組織中的表達(dá)，以β-肌動蛋白為對照，采用qRT-PCR分析。如圖4所示，TfHsc70轉(zhuǎn)錄在10個檢測組織中普遍表達(dá)。TfHsc70在大腦中的表達(dá)量最高，在血液、心臟、肝臟、胃、腸、脾臟、腎臟和鰓中表達(dá)量較低，而在皮膚中只檢測到微量。結(jié)果表明，松江鱸TfHsc70在各器官中均以組成型表達(dá)，組織間存在一定的表達(dá)差異性。

圖4 松江鱸不同組織中TfHsc70 mRNA的表達(dá)Fig.4 TfHsc70 mRNA expression in different tissues of Trachidermus fasciatus

2.3 LPS刺激后各組織的TfHsc70 mRNA表達(dá)變化

與對照組相比，肝臟、皮膚、血液、脾臟、鰓、大腦中的TfHsc70均在LPS刺激后出現(xiàn)不同程度的上調(diào)（P＜0.05）（圖5）。其中肝臟TfHsc70表達(dá)量在LPS刺激2 h后顯著上調(diào)（P＜0.05），但在6 h時急劇下降（P＜0.05），48 h時下降到對照組的0.1倍（P＜0.05），在96 h時又略有上升（圖5-A）；皮膚TfHsc70在LPS刺激2 h后表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），盡管隨后TfHsc70的表達(dá)量有所下降，但96 h時，TfHsc70在皮膚中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于對照組（圖5-B）；血液TfHsc70在刺激2 h后表達(dá)量達(dá)到最大，達(dá)到原有的15倍（P＜0.05），但在6 h時表達(dá)量有所下調(diào)，并在6～24 h基本保持不變，48 h后TfHsc70表達(dá)量恢復(fù)到正常水平，72 h后出現(xiàn)第二個高表達(dá)（P＜0.05）；脾臟（圖5-D）和鰓（圖5-E）中TfHsc70的表達(dá)均呈現(xiàn)隨時間延長而逐漸上調(diào)的趨勢，并在感染后的96 h達(dá)到峰值，分別上調(diào)到對照組的2.0倍和1.8倍（P＜0.05）；大腦TfHsc70最初在2～6 h內(nèi)略有下調(diào)，然后在12 h時迅速恢復(fù)至原有水平，并在刺激72 h后呈上升趨勢（圖5-F）。

圖5 LPS刺激后不同時間主要免疫組織TfHsc70 mRNA表達(dá)Fig.5 TfHsc70 mRNA expression in main immune tissues at different time after LPSstimulation

3 討論

本研究成功克隆松江鱸HSC70基因的cDNA全長，并命名為TfHsc70。TfHsc70全長2 138 bp，其含有3個HSP70家族的保守標(biāo)記序列（GIDLGTTY、DLGGGTFD和VLVGGSTRIPKIQK）和 1個 ATP-GTP結(jié)合位點基序（AEAYLGKT）［30］，前者表明該序列屬于HSP70家族，后者在HSP伴侶蛋白復(fù)合物的形成中起主要作用，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)底物的正確折疊［31］。而TfHsc70羧基區(qū)的兩個GGXP基序四肽，表明它是HSC70蛋白亞家族的成員。其中一些重復(fù)肽已被證明具有抗原性［32］。序列中的偶聯(lián)核定位信號可能參與了TfHsc70的選擇性轉(zhuǎn)位。而羧基末端的EEVD提示TfHsc70存在于細(xì)胞質(zhì)中，可能在肽結(jié)合活性中發(fā)揮重要作用［33－34］。此外，氨基酸序列比對結(jié)果顯示TfHsc70高度保守。

qRT-PCR結(jié)果顯示，TfHsc70廣泛分布在松江鱸的血液、心臟、肝臟等組織中，但表達(dá)量有所不同，特別是在大腦中的表達(dá)量明顯高于其他組織，類似結(jié)果在草魚［9］、斑馬魚［20］、真鯛（Pagrus major）和黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）［35］上也有所體現(xiàn)。在草魚和鱖的主要免疫組織中，HSC70均有所表達(dá)，但表達(dá)量不同［9，21］。前者在鰓、腎臟、頭腎及外周血淋巴細(xì)胞中高水平表達(dá)，后者ScHSC70-1和ScHSC70-2分別在卵巢和心臟中高水平表達(dá)。而當(dāng)斑馬魚胚胎發(fā)育到原腸期后期時，HSC70表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和一些體節(jié)中出現(xiàn)組織特異性［20］。此外，研究表明，在硬骨魚大腦中HSC70的高水平表達(dá)是很常見的［16，36－37］。究其原因是大腦作為機(jī)體最重要的器官，需要大量的分子伴侶（如HSC70蛋白）將蛋白質(zhì)的儲存和釋放維持一種動態(tài)平衡。而且由于血腦屏障的存在，HSC70蛋白可在大腦中的某一區(qū)域局部合成，這解釋了為什么在松江鱸大腦中發(fā)現(xiàn)了HSC70的高水平表達(dá)。然而，要進(jìn)一步了解HSC70組織特異性表達(dá)的機(jī)制，還需進(jìn)行更加詳細(xì)的研究。

LPS作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的重要組成部分，可在哺乳動物和魚類中引起炎癥反應(yīng)［38］。而HSC70蛋白為組成型表達(dá)［12］，其在受到外來刺激時會被誘導(dǎo)表達(dá)，且在LPS刺激后HSC70的增加呈現(xiàn)時間依賴性［9］，本研究也證明了這點。肝臟、皮膚和血液在LPS刺激2 h后，TfHsc70表達(dá)量均會迅速達(dá)到峰值，這是由于肝臟、皮膚和血液是機(jī)體參與免疫反應(yīng)的組織或器官，起到產(chǎn)生或承載相關(guān)免疫基因的作用［39-41］。但在草魚的研究中發(fā)現(xiàn)，LPS刺激外周血淋巴細(xì)胞后HSC70 mRNA未出現(xiàn)上述變化［9］，這表明HSC70 mRNA在LPS刺激后血液中的表達(dá)具有物種特異性。所以還需進(jìn)一步研究來了解硬骨魚的血液為什么會出現(xiàn)不同的調(diào)節(jié)模式。與大菱鲆和鱖相似，脾臟和鰓的TfHsc70表達(dá)量出現(xiàn)了時間上的滯后［21－22］。這說明生物體內(nèi)不同組織根據(jù)不同的調(diào)控模式，參與調(diào)節(jié)宿主先天對微生物的防御。由于血腦屏障可以維持大腦的相對平衡［42］，所以在大腦中TfHsc70的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢。這表明TfHsc70參與了宿主對微生物的防御機(jī)制。綜上所述，LPS刺激后TfHsc70表達(dá)具有時間依賴性和物種特異性，也表明TfHsc70在松江鱸對抗微生物感染的先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

本文利用EST和RACE技術(shù)從松江鱸中克隆并鑒定TfHsc70。通過分析其氨基酸序列、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以及TfHsc70 mRNA的表達(dá)情況，最終得到TfHsc70蛋白屬于熱休克蛋白HSC70亞家族的結(jié)論。此外，在LPS刺激后發(fā)現(xiàn)，TfHsc70 mRNA在松江鱸的主要免疫組織中顯著上調(diào)，這表明松江鱸HSC70（即TfHsc70）作為一種功能蛋白，是參與先天免疫應(yīng)答的重要免疫相關(guān)分子。但其在松江鱸中的潛在生物學(xué)功能和防御機(jī)制需要進(jìn)一步研究，從而為HSC70在魚類免疫應(yīng)答中的功能作用奠定基礎(chǔ)。