楊 偉，代應(yīng)貴，2，安丹丹，韓虎峰

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)特種水產(chǎn)研究所，貴陽 550025）

光唇裂腹魚（Schizothorax lissolabiatus），隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）裂腹魚亞科（Schizothoracinae）裂腹魚屬，分布于元江、瀾滄江、怒江和珠江水系南北盤江等地［1－2］，為產(chǎn)地名優(yōu)野生經(jīng)濟(jì)魚類。近年來，光唇裂腹魚棲息地遭到破壞，人類活動(dòng)對(duì)其造成了不利影響［3］。

遺傳多樣性通常是指種內(nèi)的遺傳多樣性，即種內(nèi)個(gè)體之間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體遺傳變異的總和［4］。遺傳多樣性是評(píng)價(jià)物種資源狀況的一個(gè)重要指標(biāo)，是物種適應(yīng)周圍環(huán)境變化、維持生存和進(jìn)化的物質(zhì)基礎(chǔ)［5］。以DNA為模板的分子標(biāo)記技術(shù)，通過對(duì)物種基因的掃描，能夠直接反映DNA序列的差異（多態(tài)性），具有穩(wěn)定、高效和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于物種資源評(píng)價(jià)、遺傳變異規(guī)律分析、輔助育種等［6－8］。AFLP分子標(biāo)記結(jié)合了RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，多態(tài)性強(qiáng)，分辨率高，獲得信息量大，用較少的引物組合即可獲得準(zhǔn)確的遺傳信息，尤其適用于研究背景模糊、材料來源廣泛等物種遺傳資源的標(biāo)記分析［8］。該技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析等研究［8－10］。

北盤江是珠江水系西江上源紅水河的主要支流。目前，光唇裂腹魚在北盤江僅見于上游可渡河［3］。本研究通過對(duì)北盤江光唇裂腹魚種群全基因組DNA進(jìn)行AFLP分析，以期揭示該種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性的現(xiàn)狀，為開展其野生資源保護(hù)和種質(zhì)資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

本研究所用試驗(yàn)魚于2010年7月采自珠江水系北盤江可渡河自楊柳至都格河段，用刺網(wǎng)每隔7 km捕撈7～8尾光唇裂腹魚，共計(jì)30尾魚。試驗(yàn)魚體長(zhǎng)108～258 mm，體質(zhì)量23.6～273.0 g。取魚體背部肌肉用無水乙醇保存并帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 模板DNA的提取

1.3 AFLP分析

1.3.1 引物接頭與引物組合信息

本次實(shí)驗(yàn)所用的引物組合由作者自行設(shè)計(jì)并委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，經(jīng)過初篩，選用8個(gè)引物組合對(duì)北盤江光唇裂腹魚種群全基因組DNA進(jìn)行AFLP分析（表1）。

表1 北盤江光唇裂腹魚種群AFLP分析所用引物組合Tab.1 Primer pairs used in AFLP analysis for Schizothorax lissolabiatus population from the Beipan River

1.3.2 AFLP分析

反應(yīng)體系中所用的內(nèi)切酶為EcoRI和MseI。酶切與連接反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系共計(jì)25μL，包括模板DNA 2μL，Pre-ampmix 1μL，dNTPs 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18μL，PCR反應(yīng)程序：94℃2 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃80 s（30個(gè)循環(huán)）；72℃5 min。將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1∶20稀釋后作為選擇性擴(kuò)增模板，選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系共計(jì)25μL，包括2μL稀釋后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，雙蒸水17.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，EcoRI引物1μL，MseI引物1μL，dNTPs 0.5μL和Taq DNA聚合酶0.5μL，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，50～60℃退火45 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min，12℃冷卻10 min。PCR產(chǎn)物4℃保存。

采用貝克曼庫爾特公司CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)，運(yùn)用熒光標(biāo)記技術(shù)和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)，將PCR產(chǎn)物在毛細(xì)管中電泳分離，以激光激發(fā)熒光采集數(shù)據(jù)，電泳結(jié)果通過軟件自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析并轉(zhuǎn)換成“0、1”矩陣，保存于EXCEL表格供數(shù)據(jù)處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用POPGENE3.2軟件統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)總數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)比例（P），并計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon信息指數(shù)（I）。用NTSYS2.10軟件計(jì)算30尾個(gè)體間遺傳相似性系數(shù)（S），根據(jù)NEI和LI［11］的方法計(jì)算遺傳距離：D＝1－S?；趥€(gè)體間遺傳距離矩陣，采用Mega6軟件構(gòu)建種群個(gè)體的UPGMA、NJ系統(tǒng)樹。用Excel表統(tǒng)計(jì)顯性位點(diǎn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行顯現(xiàn)基因型頻率構(gòu)圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果

北盤江30尾光唇裂腹魚中，每個(gè)引物組合擴(kuò)增片段數(shù)在8～73之間，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為69～500 bp（圖1），個(gè)體基因型數(shù)為28～30個(gè)、平均29.5個(gè)（表2）。

圖1 引物組合8擴(kuò)增的北盤江光唇裂腹魚種群DNA指紋圖譜Fig.1 Electrophoretogram of PCR products by AFLP primer pair 8 in Schizothorax lissolabiatus population from the Beipan River

2.2 種群遺傳多樣性

北盤江30尾光唇裂腹魚總計(jì)擴(kuò)增出975個(gè)有效位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)數(shù)897個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)占總位點(diǎn)數(shù)的比例為92.00%（表3）。每個(gè)引物組合總擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為98～151個(gè)，平均121.88個(gè)；擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)為93～140個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比例為79.67%～95.76%，每個(gè)引物組合平均多態(tài)位點(diǎn)比例為91.23%。8個(gè)引物組合擴(kuò)增共有位點(diǎn)數(shù)為5～25個(gè)，平均10.88個(gè)。

3.流程設(shè)計(jì)缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性。內(nèi)部控制體系的核心設(shè)計(jì)師流程設(shè)計(jì)，企業(yè)根據(jù)在運(yùn)營過程中所遇到的風(fēng)險(xiǎn)，制定科學(xué)合理有效的控制活動(dòng)，這有利于企業(yè)設(shè)計(jì)合理的可以預(yù)防風(fēng)險(xiǎn)的業(yè)務(wù)流程。但是，目前我國公立醫(yī)院的運(yùn)營現(xiàn)狀來看，醫(yī)院內(nèi)部各部門之間權(quán)責(zé)不明、權(quán)責(zé)一體化。公立醫(yī)院為了方便業(yè)務(wù)的執(zhí)行，使得各部門之間未能相互制約，導(dǎo)致醫(yī)院在業(yè)務(wù)執(zhí)行過程中工作人員有徇私舞弊的現(xiàn)象出現(xiàn)。所以，醫(yī)院在經(jīng)營發(fā)展過程中要完善流程設(shè)計(jì)，根據(jù)實(shí)際所遇到的風(fēng)險(xiǎn)制定科學(xué)有效的控制活動(dòng)。

基于8個(gè)引物組合的擴(kuò)增結(jié)果，北盤江光唇裂腹魚種群觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei遺傳多樣性指數(shù)（H）和Shannon信息指數(shù)（I）平均值分別為1.912 3、1.369 0、0.227 1和0.357 5（表3）。

表3 光唇裂腹魚遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity of Schizothorax lissolabiatus population from the Beipan River

根據(jù)8對(duì)擴(kuò)增引物組合擴(kuò)增出的975個(gè)位點(diǎn)，將30尾光唇裂腹魚擴(kuò)增位點(diǎn)的顯性基因型頻率以10%為單位劃分為10個(gè)區(qū)間：1%～9%、10%～19%、20%～29%、30%～39%、40%～49%、50%～59%、60%～69%、70%～79%、80%～89%、90%～99%和0、1兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)（圖2）。在關(guān)鍵點(diǎn)0擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)出現(xiàn)峰值，在60%～69%區(qū)間擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)呈現(xiàn)最低值。

圖2 擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)在不同顯性基因頻率區(qū)間內(nèi)的分布Fig.2 Number of AFLP amplified locus in different intervals of occurency frequency of locus in Schizothorax lissolabiatus population from the Beipan River

2.3 遺傳距離和系統(tǒng)樹

北盤江光唇裂腹魚種群30尾個(gè)體間遺傳距離為0.214 7～0.410 9，平均為0.304 0。

基于個(gè)體間遺傳距離對(duì)北盤江30尾光唇裂腹魚進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示采用UPGMA法和NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)樹具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，即30尾光唇裂腹魚均聚為兩支（圖3，圖4）。在UPGMA系統(tǒng)樹中，一支由25個(gè)個(gè)體組成，另一支由5個(gè)個(gè)體組成；在NJ系統(tǒng)樹中，一支代表24個(gè)個(gè)體，另一支代表6個(gè)個(gè)體。

圖3 30尾光唇裂腹魚UPGMA系統(tǒng)樹Fig.3 UPGMA phylogenetic tree of 30 individuals of Schizothorax lissolabiatus from the Beipan River

圖4 30尾光唇裂腹魚NJ系統(tǒng)樹Fig.4 NJ phylogenetic tree of 30 individuals of Schizothorax lissolabiatus from the Beipan River

表2 8個(gè)AFLP引物組合的擴(kuò)增結(jié)果Tab.2 AFLP amplification results by 8 primer pairs in Schizothorax lissolabiatus population from the Beipan River

3 討論

3.1 北盤江光唇裂腹魚種群的遺傳多樣性與保護(hù)

一個(gè)群體（或物種）遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，表明其對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng)，越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新的環(huán)境［5］。群體遺傳多樣性每損失10%，就會(huì)對(duì)其繁殖能力、存活率、生長(zhǎng)等重要生理性狀產(chǎn)生極大的負(fù)面影響［12］。因此，對(duì)遺傳多樣性的研究，不僅可以了解物種的進(jìn)化歷史，也可以為分析物種的進(jìn)化潛力和預(yù)測(cè)物種發(fā)展方向提供重要依據(jù)。

多態(tài)位點(diǎn)比例（P）和Nei遺傳多樣性指數(shù)（H）是評(píng)價(jià)物種遺傳多樣性的重要指標(biāo)［13］。本研究中，北盤江光唇裂腹魚種群的多態(tài)位點(diǎn)比例（P）、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、Nei遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon信息指數(shù)（I）分別為91.23%、1.912 3、0.227 1和0.357 5（表3），高于同屬的齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）大渡河種群、雅礱江種群、青衣江雅安多營種群和寶興種群（P＝67.95%～77.94%）［14］、昆 明 裂 腹 魚（Schizothorax grahami）六沖河群體（P＝60.63%）［15］，略低于瀾滄江中上游光唇裂腹魚4個(gè)地理群體（Na＝2，H＝0.286 8～0.324 8，I＝0.426 9～0.481 1）［16］，而與已被證實(shí)遺傳多樣性較高的烏江四川裂腹魚（Schizothorax kolzovi）群體（P＝92.99%，H＝0.212 2）［17］處于同一水平?？梢?，北盤江光唇裂腹魚種群具有較為豐富的遺傳多樣性，種質(zhì)資源較佳。

然而，韓虎峰和代應(yīng)貴［3］基于線粒體DNA控制區(qū)序列分析表明，珠江水系光唇裂腹魚種群遺傳多樣性較貧乏，本文研究的結(jié)果與之相反。類似地，基于RAPD［18］、線粒體控制區(qū)［19］、Cyt b基因［20］及AFLP［21］等不同分子標(biāo)記，對(duì)大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）群體遺傳多樣性的研究也得出了相反的結(jié)論，推測(cè)這可能是因?yàn)椴煌瑯?biāo)記的DNA分子大小、進(jìn)化速率及多態(tài)位點(diǎn)信息等存在差異的結(jié)果。本研究中，珠江水系北盤江光唇裂腹魚種群采用AFLP檢測(cè)顯示了較高的遺傳多樣性，而韓虎峰和代應(yīng)貴［3］采用線粒體DNA控制區(qū)測(cè)序方法檢測(cè)卻表明該群體遺傳多樣性貧乏。其原因可能是由于本研究檢測(cè)的是種群全基因組DNA的變異水平，而韓虎峰和代應(yīng)貴［3］則僅僅檢測(cè)了該種群線粒體DNA控制區(qū)部分序列（481 bp）的變異結(jié)果，顯然本文的研究結(jié)果更為可信。

有效等位基因數(shù)（Ne）是衡量群體遺傳變異程度的指標(biāo)。有效等位基因數(shù)（Ne）與觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）之間的差異，能說明某等位基因在群體內(nèi)分布的均勻程度。Ne與Na之間的差異越小，表明該等位基因在群體內(nèi)分布的均勻度越高［7］。本研究中，8個(gè)引物組合Ne的范圍為1.269 5～1.425 1、平均為1.369 0，Na的范圍1.796 7～1.957 6、平均為1.912 3（表3），顯示兩者之間差異較大，表明該群體中等位基因分布的均勻度較低，可能存在著等位基因丟失的現(xiàn)象，也表明北盤江光唇裂腹魚群體個(gè)體間基因交流較弱。Shannon信息指數(shù)（I）是反映群體離散程度的一個(gè)重要指標(biāo)，Shannon信息指數(shù)的變化范圍通常在1.5～3.5［7］。本研究中，北盤江光唇裂腹魚群體Shannon信息指數(shù)（I）的平均值為0.357 5（表3），顯著低于正常值范圍，說明光唇裂腹魚北盤江種群遺傳變異離散程度較低。

光唇裂腹魚為偏r-型物種［22］，這類魚類種群結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，世代交替快，更新能力強(qiáng)；但易受環(huán)境影響，資源穩(wěn)定性較差［23］。多年來，北盤江干流梯級(jí)水電開發(fā)建壩［24］，使河流變成了靜水或緩流，阻斷了魚類的洄游通道，從而對(duì)適應(yīng)于流水洄游生活的光唇裂腹魚產(chǎn)生了不利影響。韓虎峰和代應(yīng)貴［3］研究表明，光唇裂腹魚在北盤江干流因支流革香河洗煤污水匯入而僅見于上游可渡河，種群數(shù)量減少?？梢姡|(zhì)污染是破壞北盤江光唇裂腹魚資源的重要因素。同時(shí)，北盤江沿岸漁民的酷漁濫捕也嚴(yán)重影響了該河流的野生魚類資源，導(dǎo)致其魚類種群個(gè)體明顯小型化［25］，進(jìn)而對(duì)河流中光唇裂腹魚種群造成了威脅。

綜上所述，盡管北盤江光唇裂腹魚種群目前仍具有較豐富的遺傳多樣性，但因其自身的生態(tài)類型以及梯級(jí)電站建壩、水域污染和過度捕撈等因素的影響，該種魚類在北盤江分布區(qū)已縮小，資源受到了威脅，遺傳變異離散程度較低，存在著等位基因丟失的現(xiàn)象。因此，需要開展北盤江水域污染治理、加強(qiáng)漁政執(zhí)法實(shí)行禁漁、減少北盤江流域水電站的修建及設(shè)置水電站過魚通道、加大對(duì)北盤江光唇裂腹魚資源監(jiān)測(cè)的力度、實(shí)施北盤江光唇裂腹魚人工增殖放流、設(shè)立北盤江光唇裂腹魚自然保護(hù)區(qū)等措施，以保護(hù)和恢復(fù)北盤江光唇裂腹魚野生資源和種群遺傳多樣性。

3.2 北盤江光唇裂腹魚種群系統(tǒng)樹分析

韓虎峰和代應(yīng)貴［3］構(gòu)建了珠江水系光唇裂腹魚可渡河種群mtDNA單倍型NJ分子系統(tǒng)樹，其所屬的40尾光唇裂腹魚被分為兩支，推測(cè)該群體可能源于2個(gè)母系或兩個(gè)繁殖群體。王緒禎等［26］研究表明，青藏高原特有的多倍體化裂腹魚類包含了兩個(gè)獨(dú)立起源的類群。本研究中，光唇裂腹魚為六倍體［26］，基于個(gè)體間遺傳距離構(gòu)建的北盤江光唇裂腹魚種群UPGMA和NJ系統(tǒng)樹具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其所屬的30尾光唇裂腹魚聚為兩支，顯示北盤江光唇裂腹魚種群可能源于具有不同親緣關(guān)系的兩個(gè)亞群體。

3.3 本研究中AFLP標(biāo)記結(jié)果的的可靠性

AFLP標(biāo)記多態(tài)性條帶比例高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，不受基因組來源和復(fù)雜程度的影響，適用于檢測(cè)親緣關(guān)系較近的生物材料之間的遺傳差異［27］。楊彥平等［28］采用AFLP技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江靖江段鰻鱺（Anguilla japonica）種群遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明其多態(tài)位點(diǎn)比例高達(dá)95.06%。葉寧等［29］對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）7個(gè)群體遺傳多樣性的AFLP分析中，7個(gè)引物組合擴(kuò)增出的多態(tài)位點(diǎn)比例為85.71%?；贏FLP方法，劉良國等［10］對(duì)洞庭湖水系五強(qiáng)溪水庫光澤黃顙魚（Pelteobagrus nitidus）遺傳多樣性的分析顯示，其多態(tài)位點(diǎn)比例為87.7%。本研究中，用8個(gè)擴(kuò)增引物組合共計(jì)檢測(cè)出北盤江光唇裂腹魚種群多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為897，多態(tài)位點(diǎn)比例為92.00%（表3）。可見，AFLP技術(shù)多態(tài)性位點(diǎn)檢出率高，可獲得較豐富的遺傳變異信息，是一種高效的分子標(biāo)記方法，可以用于北盤江光唇裂腹魚種群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的研究。

據(jù)TAIJIMA［30］的DNA序列抽樣分析理論，在DNA水平上估計(jì)種群變異時(shí)，當(dāng)樣本量≥10，抽樣樣本的方差便不會(huì)太大。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，為了避免因人為取樣對(duì)遺傳多樣性研究結(jié)果造成影響，實(shí)驗(yàn)的樣本量應(yīng)在30以上，由此獲得的遺傳多樣性結(jié)果才具有較高的可信度［31］。秦艷杰等［32］通過逐步增加AFLP引物組合數(shù)量進(jìn)行了中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）群體遺傳多樣性的檢測(cè)，認(rèn)為至少要用3個(gè)引物組合才能對(duì)其群體進(jìn)行可信的遺傳學(xué)評(píng)價(jià)。沈德周等［6］研究了AFLP引物組合數(shù)量對(duì)馬纓杜鵑（Rhododendron delavayi）遺傳多樣性的影響，表明基于5個(gè)以上引物組合即可獲得較為準(zhǔn)確的遺傳多樣性研究結(jié)果。本研究中，供檢測(cè)的北盤江光唇裂腹魚種群樣本量為30，引物組合數(shù)為8，可實(shí)現(xiàn)對(duì)該種群體遺傳多樣性較準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。因此，本研究中獲得的北盤江光唇裂腹魚種群遺傳多樣性研究結(jié)果可信度較高。