譚秦亮 蔡元保 楊祥燕 李穆 李季東 黃思婕 程琴 龐新華 朱鵬錦 周全光

摘 ?要：NAC轉(zhuǎn)錄因子作為植物中數(shù)量最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長發(fā)育及各種逆境脅迫中發(fā)揮非常重要的調(diào)控作用。本研究以菠蘿為試驗材料，采用RT-PCR技術(shù)克隆得到基因AcoNAC1（GenBank登錄號：XM_020225830），對其進行生物信息學(xué)及表達分析。生物信息學(xué)分析表明，該基因cDNA序列全長1723 bp，ORF為1062 bp，編碼353個氨基酸，相對分子量為38.34 kDa，理論等電點為8.88;其編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)由20.40%的α-螺旋（H）和15.30%的β-折疊（E）以及59.21%的無規(guī)則卷曲（C）組成，具有NAC典型結(jié)構(gòu)保守域。基因表達分析表明，AcoNAC1基因的表達受低溫和干旱脅迫誘導(dǎo)，低溫脅迫24 h和干旱脅迫12 h時的表達量最高;在不同成熟期品種中表現(xiàn)出持續(xù)的誘導(dǎo)表達，但誘導(dǎo)強度逐漸下降，其中早熟品種謝花后20～50 d及晚熟品種謝花后20～60 d基因表達量均處于較高水平。因此，推測AcoNAC1基因可能參與菠蘿逆境脅迫響應(yīng)以及果實發(fā)育與成熟的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：菠蘿;NAC轉(zhuǎn)錄因子;生物信息學(xué)分析;逆境脅迫

Abstract： NAC is one of the largest families of transcription factors in plants， which plays an important role in plant growth， development and all kinds of adversity stress response. Mature pineapple pulp was used as the research material. AcoNAC1 （GenBank accession number： XM_020225830） was cloned by RT-PCR from Ananas comosus， then bioinformatics and expression were analyzed. Bioinformatics analysis showed that the full length cDNA of AcoNAC1 was 1723 bp and contained an ORF of 1062 bp， and was predicted to encode a protein of 353 amino acids， with a theoretical molecular weight of 38.34 kDa and an isoelectric point of 8.88. Secondary structure prediction revealed AcoNAC1 had 20.40% alpha helix （H）， 15.30% beta folded （E） and 59.21% random curl （C）， with typical NAC conservative domain. Gene expression analysis showed that the expression of AcoNAC1 was induced by low temperature and drought stress， and the highest expression was observed in low temperature stress 24 h and drought stress for 12 h. Different maturity varieties showed a continuous induction expression， and the expression was at a higher level after the precocious variety blossom 20-50 d and late-maturing variety blossom 20-60?d. Therefore， AcoNAC1 maight participate in response to adversity stress reaction and fruit development or maturity of regulation.

Keywords： Ananas comosus; NAC transcription factor; bioinformatics analysis; adversity stress

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的蛋白家族，最早在矮牽牛（Petunia hybrida）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中被發(fā)現(xiàn)[1]，在其他真核生物中尚未發(fā)現(xiàn)該家族成員的存在[2]。NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，大多數(shù)含有1個保守的N端DNA功能結(jié)合域和C端多變結(jié)構(gòu)，N端保守的NAC功能結(jié)構(gòu)域根據(jù)不同的基序可進一步分為A、B、C、D、E 5個保守的亞結(jié)構(gòu)域，具有結(jié)合DNA、蛋白質(zhì)及功能二聚體的特性，并決定著NAC轉(zhuǎn)錄因子的主要生化功能[3-4]。與N端的高度保守性不同，NAC轉(zhuǎn)錄因子的C端序列存在多變性，且富含酸性氨基酸、蘇氨酸、脯氨酸、絲氨酸等，無論是在編碼氨基酸還是序列長度上均表現(xiàn)出變化多樣性，因此C端具有轉(zhuǎn)錄激活、抑制或結(jié)合蛋白質(zhì)活性的特點[5]。

大量研究表明，首先NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育中起重要的作用[6]，通過此類基因的表達可以調(diào)控植物側(cè)根的發(fā)育[7]、花的形態(tài)建成[8]、果實成熟[9]、葉片衰老[10]以及次生壁的形成[11]等。例如在擬南芥中，AtNAC2主要在花和根中高度表達，超表達AtNAC2能夠促進側(cè)根的發(fā)育[12]。其次是可以響應(yīng)植物生長過程中遇到的逆境脅迫，激活多種生物和非生物脅迫過程中相關(guān)基因的表達，提高植物對逆境脅迫的耐受性[13]。例如在擬南芥中AtANAC019、AtANAC055和AtANAC072 的表達均受到干旱、高鹽或脫落酸（ABA）的誘導(dǎo)，超表達可提高轉(zhuǎn)基因植株對干旱的耐受性[14]。在小麥中TaNAC5基因參與逆境脅迫的應(yīng)答，在滲透和低溫脅迫下TaNAC5基因上調(diào)表達，而高鹽脅迫則抑制TaNAC5基因表達[15]。在水稻中ONAC045過表達可以提高轉(zhuǎn)基因水稻植株對冷和鹽脅迫的抗性，還增強植株對ABA的靈敏度[16];過表達SNAC1基因既可增加水稻對ABA的敏感性，又可提高轉(zhuǎn)基因水稻對干旱和鹽堿化的耐受性，還可以通過調(diào)控保衛(wèi)細胞的閉合來增強水稻的抗旱性[17-18]。

菠蘿（Ananas comosus）是鳳梨科鳳梨屬多年生草本植物，廣泛分布于世界上的熱帶、亞熱帶地區(qū)，目前全球80多個國家與地區(qū)種植菠蘿，但98%產(chǎn)自亞洲、美洲和非洲[19-20]。菠蘿是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)最具特色和優(yōu)勢的熱帶水果之一[21]，與荔枝、香蕉及木瓜合稱為我國嶺南四大熱帶水果。目前，NAC轉(zhuǎn)錄因子在菠蘿中的生物學(xué)功能尚不清楚，其相關(guān)研究未見報道。基于前期的研究基礎(chǔ)[22-24]，本研究從菠蘿中克隆到1個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因AcoNAC1，利用生物信息學(xué)方法對該基因的序列及其編碼蛋白進行分析，預(yù)測其蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能等，并利用RT-qPCR分析該基因在不同脅迫和不同成熟期的表達模式，為今后深入研究該基因的功能提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗材料為廣西亞熱帶作物研究所菠蘿種質(zhì)資源圃提供的菠蘿品種‘金菠蘿（MD-2）以及早熟品種‘巴厘（Comte de Paris）和晚熟品種‘pérola。選取處于幼苗期，苗齡為60 d的‘金菠蘿組培苗作為脅迫處理對象，低溫脅迫選擇4?℃環(huán)境，干旱模擬脅迫選擇20%濃度的PEG 6000澆灌土壤至飽和。在‘金菠蘿幼苗期分別采集經(jīng)4?℃低溫脅迫和20% PEG 6000干旱脅迫0、1、3、6、12、24 h后的葉片，未進行處理的植株作為對照。早熟品種‘巴厘謝花（自然開花，以第一朵小花謝花開始算起，下同）后20、35、50、60、65、70 d分別采集果肉，晚熟品種‘pérola謝花后20、40、60、80、100、120?d分別采集果肉。以上所有材料取樣后液氮速凍，保存于?80?℃冰箱中，用于后期試驗。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菠蘿AcoNAC1基因的克隆 ?采用CTAB改良法提取菠蘿葉片和果肉的總RNA，具體操作參照蔡元保等[24]的方法。利用課題組前期對菠蘿轉(zhuǎn)錄組測序獲得的編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的EST序列，設(shè)計全長擴增引物AcoNAC1-F和AcoNAC1- R，擴增AcoNAC1基因的全長cDNA序列，所用引物（表1）全部由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 ?AcoNAC1蛋白性質(zhì)分析 ?參考蔡元保等[24]和馬海洋等[25]采用的在線工具和軟件分析AcoNAC1蛋白的NAC保守結(jié)構(gòu)域、基本理化特性、信號肽、亞細胞定位、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)跨膜區(qū)段等結(jié)構(gòu)和功能。

1.2.3 ?AcoNAC1蛋白同源性及系統(tǒng)進化樹分析 ?利用DNAMAN6.0軟件將菠蘿AcoNAC1與NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索的菠蘿AcNAC（OAY83360.1）、水稻OsNAC（XP-006660793.1）、海棗PdNACX2（XP- 017699777.1）、油棕EgNAC（XP-010929381.1）、玉米ZmNAC（PWZ38257.1）、高粱SbNAC（XP- 002462604.1）、大豆GsNACX3（XP_028199935.1）序列進行同源蛋白多序列比對。并利用DNAMAN 6.0軟件，對菠蘿和22個不同植物蛋白進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.2.4 ?菠蘿AcoNAC1基因表達分析 ?采用qRT- PCR方法分析AcoNAC1基因的實時表達情況，AcoNAC1基因的特異引物為RT-AcoNAC1-F和RT-AcoNAC1-R，內(nèi)參基因選擇菠蘿18S rRNA基因，引物為Q18S-F和Q18S-R（表1）。RT-qPCR反應(yīng)體系及程序參考蔡元保等[24]的方法。每個試驗設(shè)3次重復(fù)，采用2?ΔΔCT方法分析處理數(shù)據(jù)，確定AcoNAC1基因的相對表達量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?菠蘿AcoNAC1基因的克隆及序列分析

根據(jù)前期研究的菠蘿轉(zhuǎn)錄組測序獲得編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的EST序列，利用RT-PCR技術(shù)擴增獲得該EST的全長cDNA序列。經(jīng)過序列分析表明，該基因的全長cDNA為1723 bp，最大開放閱讀框（ORF）為1062 bp，可編碼353個氨基酸。SMART在線工具預(yù)測表明，該編碼蛋白含有一個典型的NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域（圖1），位于該蛋白的N端，初步推測該蛋白屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子，因此將該基因命名為AcoNAC1（GenBank登錄號：XM_020225830）。

2.2 ?編碼蛋白AcoNAC1的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam在線工具預(yù)測編碼蛋白AcoNAC1的理化性質(zhì)，AcoNAC1蛋白的分子式為C1702H2604N484O503S14，相對分子量為38.34 kDa，理論等電點（pI）為8.88。該蛋白由353個氨基酸殘基組成，富含強堿性氨基酸（Arg、Lys，共36個）和強酸性氨基酸（Asp、Glu，共31個），占比較高的氨基酸有甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、異亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），分別占總氨基酸數(shù)的10.8%、10.2%、7.9%、7.9%。SignaIP4.0軟件分析結(jié)果顯示，AcoNAC1蛋白中不存在信號肽，亞細胞定位在細胞質(zhì)中，平均親水系數(shù)（GRAVY）為?0.543，不穩(wěn)定指數(shù)為43.29，因此預(yù)測該蛋白為不穩(wěn)定親水蛋白。

2.3 ?編碼蛋白AcoNAC1的二級結(jié)構(gòu)及跨膜性預(yù)測

SOPMA軟件分析結(jié)果顯示（圖2），AcoNAC1蛋白結(jié)構(gòu)中主要含有α-螺旋（H）和β-折疊（E）以及無規(guī)則卷曲（C）這3種二級結(jié)構(gòu)，其百分比分別20.40%、15.30%和59.21%。TMpred軟件跨膜區(qū)域預(yù)測表明（圖3），AcoNAC1蛋白有1個比較明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，為246～273位點。

2.4 ?菠蘿AcoNAC1蛋白的同源性分析

通過Blastp搜索和DNAMAN軟件分析顯示，菠蘿AcoNAC1蛋白與其同源的菠蘿AcNAC（OAY83360.1）序列一致性最高，同源性達到95.18%;其次為水稻OsNAC（XP-006660793.1）、海棗PdNACX2（XP-017699777.1）、油棕EgNAC（XP-010929381.1），同源性分別達到65.23%、63.01%、61.43%。而且，AcoNAC1與其他NAC轉(zhuǎn)錄因子一樣，N-端的氨基酸序列高度保守，可以進一步劃分為A、B、C、D、E 5個保守的亞結(jié)構(gòu)域（圖4）。

2.5 ?菠蘿AcoNAC1蛋白的系統(tǒng)進化分析

利用DNAMAN軟件分析AcoNAC1蛋白及其同源蛋白的系統(tǒng)進化表明，菠蘿AcoNAC1蛋白與其同源的菠蘿AcNAC（OAY83360.1）親緣關(guān)系最近，與海棗PdNACX2（XP-017699777.1）和油棕EgNAC（XP-010929381.1）的親緣關(guān)系次之;與擬南芥AtNAC（NP_188169.1）、亞麻蕎CsNAC（XP_0104873776.1）和煙草NtNAC（XP_ 009625026.1）的親緣關(guān)系最遠（圖5）。

2.6 ?菠蘿AcoNAC1基因表達分析

2.6.1 ?AcoNAC1基因在逆境脅迫下的表達與分析 ?為研究AcoNAC1基因的表達是否受逆境脅迫的誘導(dǎo)，本研究采用低溫、干旱2種不同逆境脅迫對菠蘿幼苗進行處理。結(jié)果表明（圖6），在低溫處理1?h后，AcoNAC1基因表達量有明顯上調(diào)，隨后表達逐漸減少，到6?h后表達量再次明顯上調(diào)，并在處理12 h后再次回落，之后隨著處理時間的推遲，該基因的表達在處理24 h后達到最高值，表達量為對照（處理時間0 h）的11.25倍;在干旱處理3?h后，AcoNAC1基因表達量明顯上調(diào)，且在12 h后達到最高值，為對照（處理時間0 h）的10.8倍。

2.6.2 ?AcoNAC1基因在菠蘿不同成熟期的表達與分析 ?為研究AcoNAC1基因的表達是否能調(diào)控菠蘿成熟期，本研究選用早熟品種（‘巴厘，Comte de Paris）、晚熟品種（pérola）的不同成熟期果肉進行檢測。結(jié)果表明（圖7），在不同成熟期2個品種中AcoNAC1基因表現(xiàn)出持續(xù)的誘導(dǎo)表達，且整體表達量呈逐漸減少趨勢。早熟品種‘巴厘（Comte de Paris）謝花20 d 后AcoNAC1基因表達量達到最高峰值，隨后到60 d后表達量下降到最低峰值，之后該基因的表達量一直未出現(xiàn)較大的增加;晚熟品種‘pérola謝花20?d后AcoNAC1基因表達量較高，且在謝花60 d后再次達到最高值，隨后逐漸下降，到謝花100?d后下降到最低峰值，120?d時又有所回升。

3 ?討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是一類基因調(diào)控蛋白，植物一系列生理生化反應(yīng)均離不開NAC的調(diào)控，NAC不僅可以調(diào)節(jié)植物基本的新陳代謝和生長發(fā)育，而且在響應(yīng)逆境脅迫方面也有著重要的作用。目前有關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的研究越來越熱門，已在擬南芥[26]、水稻[27]、大豆[28]、番茄[29]、蘋果[30]、葡萄[31]等多種植物中鑒別出NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的大量基因，其中擬南芥中存在117個、水稻151個、大豆152個、番茄104個、蘋果180個、葡萄74個。本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法從菠蘿中成功獲得AcoNAC1基因（GenBank登錄號：XM_ 020225830）的全長序列，該序列長度為1723 bp，開放閱讀框（ORF）為1062 bp，可編碼353個氨基酸，是一種不穩(wěn)定親水蛋白，有跨膜結(jié)構(gòu)但不存在信號肽，亞細胞定位在細胞質(zhì)中。序列分析表明，AcoNAC1蛋白和其他已知的NAC轉(zhuǎn)錄因子一樣，N-端含有一個典型的NAC類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域，可分為5個亞結(jié)構(gòu)域，與大部分前人研究結(jié)果完全一致。已有研究表明[32-33]，NAC轉(zhuǎn)錄因子的N端具有典型的功能結(jié)構(gòu)域特征，由150～160個氨基酸殘基共同構(gòu)成包含A～E共5個亞結(jié)構(gòu)域，其中A亞結(jié)構(gòu)域與蛋白互作二聚體的形成有關(guān)，B和E亞結(jié)構(gòu)域與NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能分化有關(guān)，C和D亞結(jié)構(gòu)域與DNA的結(jié)合有關(guān)，其中A、C和D亞結(jié)構(gòu)域高度保守，B和E亞結(jié)構(gòu)域保守性不強。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測可知，該蛋白主要以無規(guī)則卷曲為主，這與梁芳等[34]對太行菊NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果基本一致。

植物非生物脅迫作用主要包括干旱、低溫、高鹽等環(huán)境脅迫作用，植物受到一定的環(huán)境脅迫時就會通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑響應(yīng)脅迫信號，進而啟動下游相關(guān)脅迫應(yīng)答因子發(fā)揮作用，從而提高植物抵御逆境脅迫的能力。對香蕉研究發(fā)現(xiàn)，過表達MusaNAC042的香蕉轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)干旱脅迫處理后，干旱指標脯氨酸含量升高，丙二醛含量降低，相對含水量高于對照植株，此外還引起多個下游相關(guān)基因的表達上調(diào)，說明MusaNAC042基因能夠較好的提高香蕉的抗旱性[35]。水稻中OsNAC5和OsNAC095基因受干旱、高鹽等脅迫誘導(dǎo)后上調(diào)表達，但受低溫脅迫后下調(diào)表達，過表達這些基因能夠增強轉(zhuǎn)基因株系的抗干旱和抗高鹽水平[36-37]。過表達OsNAC022的轉(zhuǎn)基因水稻植株在干旱脅迫下較野生型（WT）植株耐旱性強，成活率高，生長性能好，其中蒸騰速率會降低，脯氨酸和可溶性糖含量會增加，且可通過ABA依賴通路調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物中OsNAC022基因的表達[38]。綜上所述，NAC基因成員確實參與了植物的各種逆境應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱和低溫都對AcoNAC1基因的表達具有誘導(dǎo)作用，在低溫處理1、6、24 h與干旱處理3、12、24 h后AcoNAC1基因的表達均有明顯的增強趨勢，這些變化說明AcoNAC1基因參與了菠蘿非生物脅迫的調(diào)控響應(yīng)過程，但其在不同脅迫條件下參與調(diào)控的途徑和方式存在差異。

開花和果實成熟是植物生長發(fā)育中特有的一個發(fā)育階段，是受到多種因素共同調(diào)控的復(fù)雜過程，在不同植物中相關(guān)基因調(diào)控的作用存在差異。近年來研究表明，NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）是一種具有特異性且可調(diào)控多種生物功能的植物轉(zhuǎn)錄因子，在轉(zhuǎn)錄水平上NAC轉(zhuǎn)錄因子可根據(jù)自身的特異性結(jié)合靶基因啟動子上的順式作用元件，激活或抑制下游靶基因的表達，進而調(diào)控果實的成熟期、外觀、風(fēng)味及品質(zhì)的相關(guān)變化。在臍橙晚熟突變體中發(fā)現(xiàn)1個NAC基因CitNAC[39]，其在成熟柑橘的果皮和果肉中表達較高，而在果實發(fā)育的其他階段表達量相對較低，推測其可能與果實的成熟和組織的衰老密切相關(guān)。本研究中菠蘿AcoNAC1基因在早熟和晚熟品種的果實成熟期中，均受到誘導(dǎo)表達，但表達量整體呈下降的趨勢，推測其在菠蘿果實形成過程中有促進作用，但是在菠蘿果實成熟后期具有一定的負調(diào)控作用。

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