徐志軍 孔冉 蘇俊波 周峰 張垂明 吳小麗 劉洋

摘 ?要：分離群體是進行作物遺傳圖譜構建、性狀遺傳研究、性狀調控關鍵基因挖掘和種質資源創(chuàng)新利用的重要基礎。本研究利用‘崖城94-46和‘新臺糖22號雜交獲得了209個雜交單株，通過SSR標記鑒定真假雜種和剔除病死單株，獲得了1個包含145個雜交后代的F1群體。F1群體主要農藝性狀遺傳變異分析表明，8個性狀都存在雙向超親現(xiàn)象，變異系數(shù)范圍為9.23%～56.78%，8個性狀的頻數(shù)分布均呈連續(xù)正態(tài)分布，均為由多基因控制的數(shù)量性狀。相關分析和逐步回歸分析表明，甘蔗叢重與株高、莖徑和叢有效莖顯著正相關，決定系數(shù)為0.92;叢糖含量主要由株高、莖徑、錘度和叢有效莖4個因素決定，決定系數(shù)為0.94。研究結果為利用甘蔗F1群體開展遺傳研究奠定基礎，同時為甘蔗育種中重點選擇性狀確定提供參考。

關鍵詞：甘蔗栽培種;F1群體;農藝性狀;遺傳變異

Abstract： Segregation population is an important basis for genetic linkage map construction， trait inheritance studying， key gene mining and germplasm resource innovated utilization. In this study， 209 seedlings derived from ‘Yacheng 94-46 and ‘ROC 22 were identified by SSR markers， and a F1 population were constructed containing 145 clones combined with filed evaluation. Traits genetic variation analysis of F1 population revealed that eight traits were quantitative traits controlled by multiple genes. The traits were transgressive segregation on both sides. The variation coefficients of the traits ranged from 9.23% to 56.78%， and the frequency distribution showed continuous normal distribution. Correlation analysis and stepwise regression analysis showed that sugarcane clump weight was positively correlated with plant height， stalk diameter and clump effective stalk number， with a determination coefficient of 0.92. And the content of sucrose was mainly determined by four factors including plant height， stalk diameter， brix and clump effective stalk number with a determination coefficient of 0.94. The results would lay a foundation for the genetic research on sugarcane F1 population and provide a reference for the determination of key selected traits in sugarcane breeding.

Keywords： cultivated sugarcane; F1 population; agronomic traits; genetic variation

甘蔗（Saccharum spp.）是我國重要的糖料作物，在我國熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛種植，由甘蔗制取的蔗糖是我國人民食用蔗糖的主要來源（占90%以上）。甘蔗基因組約為10?Gb，基因組極其復雜，其基因組因具有異源多倍體、非整倍體的特性，而制約著甘蔗的基因組學、遺傳學和重要功能基因的挖掘。隨著分子生物學、數(shù)量遺傳學和基因組學的發(fā)展，利用作物分離群體和分子標記技術進行遺傳圖譜構建和QTL定位，已廣泛地應用于花生[1]、梨[2]、割手密[3]等多種基因組復雜或群體構建難度大的植物基因組研究、遺傳進化和重要性狀解析，為甘蔗的遺傳研究提供了借鑒和參考。在甘蔗的研究上，20世紀90年代以來，國內外科研工作者針對甘蔗分離群體創(chuàng)制進行了積極探索，多個F1和BC1群體先后被創(chuàng)制出來，如Hoarau等[4]利用R570構建的自交F1群體，劉新龍等[5]利用（Co419×Y75/1/2）×ROC25構建的BC1群體，其中F1群體被認為是遺傳圖譜構建質量較好、最為經(jīng)濟的構圖群體[5-6]。利用分離群體，DHont等[7]、Grivet等[8]、Hoarau等[4]、劉新龍等[5]、Balsalobre等[9]分別使用RFLP、AFLP、SSR、RAF、SNP標記篩選出的單劑量標記及（或）雙劑量標記構建了甘蔗栽培種SP701006、R570、Q165、Co419、SP80-3280×RB835486的分子遺傳連鎖圖譜，其中的一些遺傳圖譜還用于蔗糖含量、錘度等多個性狀的QTL定位，為這些性狀的遺傳研究奠定了基礎。如Balsalobre等[9]利用SP80-3280×RB835486雜交創(chuàng)制的F1群體，構建了一張包含993個SNP標記，由223個連鎖群組成的總長3682.04 cM的甘蔗栽培種遺傳圖譜，并對蔗糖含量、錘度、莖徑和纖維含量4個性狀進行QTL定位，共檢測到7個QTL，單個QTL解釋了2%～9%的表型變異。然而，用于我國甘蔗栽培種性狀遺傳研究的分離群體仍然較為缺乏，還有大量的農藝、產(chǎn)量、品質性狀需要進行解析。鑒于分離群體在甘蔗遺傳研究、重要性狀解析和功能基因挖掘中的作用，本研究擬利用性狀

差異顯著的甘蔗栽培種資源雜交創(chuàng)制F1群體，利用分子標記對群體進行真假雜種鑒定，并對甘蔗群體的主要農藝性狀進行評價，為今后利用該群體進行遺傳圖譜構建和重要性狀QTL定位奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以含糖量、產(chǎn)量和抗病性具有顯著差異的甘蔗品系‘崖城94-46為母本，以品種‘新臺糖22號（ROC 22）為父本。2018年將父母本種植于海南省三亞市海南甘蔗育種場實驗基地，冬季誘導開花進行雜交，收獲雜交種。其中母本‘崖城94-46具有植株直立、大莖、病蟲害少等優(yōu)良性狀，父本‘新臺糖22號具有生長快、植株高、生勢好、糖分高、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等優(yōu)良特性。

1.2 ?方法

1.2.1 ?田間設計 ?2019年春季在廣東省湛江市中國熱帶農業(yè)科學院湛江實驗站基地中對雜交種進行催芽、育苗，其中親本使用蔗莖育苗，于4葉期（2019年5月）一并移栽到大田種植。親本各種植3個株行，每行10株，雜交種隨機排列，每10株1個株行，行長4.0?m，株距0.4?m，行距1.5?m，于2019年12月底收獲。

1.2.2 ?真假雜種分子標記鑒定 ?取親本和雜交種各單株幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA[10]，從前期利用甘蔗嵌合單倍體基因組信息設計的SSR引物中隨機挑選20對[11]，PCR體系和擴增條件參照徐志軍等[10]的方法，以親本DNA為模板，篩選差異引物。選取其中的3對差異引物（表1）按照如下原則對群體進行擴增：（1）群體DNA使用1對引物擴增結果中，含有父本帶型的為真雜種;（2）不含父本帶型的，使用下1對引物進行檢測，按照（1）對擴增結果進行分析;（3）3對引物檢測結果均為母本帶型或無帶的，在本研究中判定為假雜種。

1.2.3 ?主要農藝性狀鑒定 ?于收獲前一周在田間調查真雜種的存活情況，剔除病死和不能進行擴繁的雜交后代，對可以擴繁的后代按照《甘蔗種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[12]在田間調查親本和群體的叢有效莖數(shù)（N）、株高（H）、莖徑（D）、錘度（B），并按照如下公式估算群體的單莖重（SW）、叢重（CW）、蔗糖分（SC）和叢糖含量（CSC）：

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

使用Excel和Origin 8.0軟件對親本和群體主要農藝性狀數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和繪圖。

2 ?結果分析

2.1 ?F1群體鑒定

對‘崖城94-46和‘新臺糖22號雜交獲得的雜交種進行催芽、育苗獲得209個雜交單株。以親本為模板，對20對SSR引物進行擴增，共篩選到3對差異引物。使用引物sh020061、sh060101、sh090229對群體進行擴增，如圖1所示，使用引物sh020061進行擴增，雜交單株檢測到父本帶型的為真雜種，只含母本帶型或無帶的結合其他2對引物進行判定，共鑒定出171個真雜種單株。田間調查發(fā)現(xiàn)，真雜種中有26個雜交單株在田間發(fā)生病害死亡，獲得了1個包含145個雜交后代的栽培種甘蔗F1群體。

2.2 ?親本和F1群體表型變異

親本和F1群體表型數(shù)據(jù)分析表明（表2）：親本‘崖城94-46和‘新臺糖22號在親本在莖徑和單莖重2個性狀上差異不顯著，在株高、錘度、叢有效莖、蔗糖分、叢重和叢含糖量6個性狀上存在顯著差異，其中親本在錘度和蔗糖分2個性狀上差異最大。F1群體在株高、莖徑和叢有效莖均值均小于低值親本，錘度均值介于雙親之間。F1群體在株高、莖徑、錘度、叢有效莖、蔗糖分、單莖重、叢重、叢含糖量8個性狀上分布都存在雙向超親現(xiàn)象，其中分別有13、6、59、12、61、7、2、8個雜交后代超過高值親本。8個性狀的變異系數(shù)分別為10.51%、12.53%、9.23%、54.06%、13.89%、28.79%、54.34%和56.78%，其中叢有效莖、叢重和叢含糖量的離散程度最大。

2.3 ?F1群體數(shù)據(jù)分布分析

對F1群體8個性狀的數(shù)據(jù)進行箱線圖分析表明：群體在8個性狀的數(shù)值集中分布于上四分位數(shù)和下四分位數(shù)之間（圖2）。偏度分析表明：株高、錘度和蔗糖分3個性狀數(shù)據(jù)分布左偏，其余性狀數(shù)據(jù)分布右偏（表2）。峰度分析表明，8個性狀數(shù)據(jù)分布均為尖峰分布（表2）。8個性狀的頻數(shù)分布均呈連續(xù)分布（圖2），符合正態(tài)分布曲線，表明這8個性狀都是由多基因控制的數(shù)量性狀，可用于性狀的QTL定位。對于親本差異不顯著的莖徑和單莖重，F(xiàn)1群體中分別有92.41%和94.48%的家系在性狀上的表現(xiàn)都弱于低值親本。

2.4 ?8個性狀的相關性分析

對F1群體的8個性狀進行相關分析表明（表3）：呈顯著正相關的性狀有株高與莖徑、株高與叢重、莖徑與叢含糖量、叢有效莖與蔗糖分、蔗糖分與叢重、單莖重與叢重;呈極顯著正相關的性狀有株高與單莖重、莖徑與單莖重、莖徑與叢重、錘度

與叢有效莖、錘度與蔗糖分、錘度與叢含糖量、叢有效莖與叢重和從含糖量、蔗糖分與從含糖量、叢重與叢含糖量;呈顯著負相關的性狀有株高與叢有效莖、叢有效莖與單莖重;呈極顯著負相關的性狀有株高與蔗糖分、株高與錘度。在這8個性狀中，錘度和蔗糖分、叢重和叢含糖量、莖徑和單莖重、叢有效莖和叢含糖量、叢有效莖和叢重相關系數(shù)值較高，分別為1.00、0.97、0.94、0.87、0.86。

2.5 ?叢產(chǎn)量和從含糖量逐步回歸分析

分別以叢重（y1）和叢糖含量（y2）為因變量，以株高（x1）、莖徑（x2）、錘度（x3）、叢有效莖（x4）、蔗糖分（x5）、單莖重（x6）為自變量進行多元逐步線性回歸分析，得到回歸方程y1= 1.36x1+2.19x2+1.02x4-8.35和y2=0.21x1+0.35x2+ 0.03x3+0.16x4?2.00，方程的決定系數(shù)分別為R12= 0.92和R22=0.94。分析表明，甘蔗叢重主要由株高、莖徑和叢有效莖3個因素決定，叢糖含量主要由株高、莖徑、錘度和叢有效莖4個因素決定。

3 ?討論

利用性狀差異親本構建分離群體是進行作物性狀遺傳研究、性狀調控關鍵基因挖掘和種質資源創(chuàng)新利用的重要基礎，與水稻、小麥、玉米等禾本科作物相比，甘蔗分離群體構建難度較大[5]，利用群體開展遺傳研究也相對落后。前人已經(jīng)利用不同類型的甘蔗資源在甘蔗群體構建方面進行了積極探索，如陸鑫等[13]利用熱帶種Saccharum officinarum與滇蔗茅（Erianthus rockii）云南95-19屬間遠緣雜交構建了包含62個無性系F1群體;劉新龍等[14]用甘蔗品種Co419與野生種割手密（Saccharum spontaneum）Y75/1/2遠緣雜交構建了包含269個家系的F1群體，這些群體的創(chuàng)制明確了不同類型資源雜交后的性狀分離特征。本研究利用甘蔗育種上2個重要的親本資源‘崖城94-46和‘新臺糖22號雜交構建了1個包含了145個雜交后代的甘蔗栽培種F1群體，對利用同一類型資源雜交后的性狀分離進行了分析，表明株高、莖徑、錘度、叢有效莖、蔗糖分等性狀都是由多基因控制的數(shù)量性狀，與前人利用不同類型資源研究的結果相一致[9， 13-17]。

本研究使用的雜交親本在莖徑和單莖重2個性狀差異不明顯，而F1群體中莖徑和單莖重分離范圍分別為1.57～3.51?cm、0.37～2.23?kg，在單個性狀上出現(xiàn)顯著超越親本的雜交后代（分別為6個和7個），表明在育種過程中，使用綜合性狀的相近材料雜交也有可能創(chuàng)制出優(yōu)異的育種中間材料。而在其余6個親本間差異較大的性狀上，除叢重僅有2個家系超過大值親本，其余5個性狀超親后代數(shù)目要顯著大于莖徑和單莖重，這表明利用性狀差異較大的親本進行雜交組合配置獲得優(yōu)異雜交后代的可能性更高。對F1群體8個性狀的回歸分析表明，在高產(chǎn)高糖甘蔗品種選育方面，株高、莖徑、錘度和叢有效莖是需要進行重點選擇的關鍵性狀，已有研究表明，在甘蔗新品種選育過程中還應加強出苗發(fā)株勢強、生勢強甘蔗材料的選育[18]。王勤南等[15]對6個甘蔗自交F1群體研究表明，株高與錘度呈正相關;趙俊[18]利用113個國外甘蔗種質研究發(fā)現(xiàn)，株高與蔗糖分和錘度呈不顯著負相關，但蔗糖分和錘度與蔗產(chǎn)量呈極顯著負相關;而本研究利用‘崖城94-46和‘新臺糖22號雜交發(fā)現(xiàn)，株高與蔗糖分和錘度呈極顯著負相關，表明甘蔗性狀的遺傳還較為復雜，但在育種中需要協(xié)調蔗產(chǎn)量和糖分、錘度，從而獲得理想的糖產(chǎn)量。

獲得足夠多的分子標記對F1群體進行基因分型，是利用F1群體進行遺傳研究的基礎。甘蔗栽培種基因組極其復雜，異源多倍體、非整倍體、種間雜交結構制約著基因組的解析和分子標記的開發(fā)[3，19]。運用最新測序和組裝技術，割手密最小單倍體AP85-441（1n=4x=32，3.5 Gb）[3]，甘蔗栽培種R570嵌合單倍體高質量序列（330 Mb）[19]先后發(fā)布，為利用F1群體進行遺傳圖譜構建和QTL定位提供了大量分子標記資源。此外，Zhang等[20]對LA Purple（Saccharum officinarum）與Molokai 5829（Saccharum robustum）及其雜交構建的F1群體進行RNA-seq測序，對親本開發(fā)了20 842個SNP和11?158個SNP，構建了總長分別為7096.5?cM和6742.0 cM LA Purple和Molokai 5829的高密度遺傳圖譜，表明利用轉錄技術進行高通量分子標記的開發(fā)在甘蔗F1群體的利用方面具有巨大的潛力。因此，在今后的研究中，充分利用現(xiàn)有的基因組信息，結合多種標記開發(fā)技術，有助于加速甘蔗栽培種基于分離群體的遺傳研究。

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責任編輯：白 ?凈

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