陳雪鳳 吳圣進(jìn) 王燦琴 韋仕巖 王曉國 郞寧 張雯龍

摘 ?要：為了快速、準(zhǔn)確地鑒別低溫刺激型秀珍菇菌株，在對18個供試菌株進(jìn)行拮抗試驗、現(xiàn)蕾出菇試驗、ISSR圖譜分析的基礎(chǔ)上獲得了秀珍菇菌株的ISSR特異性標(biāo)記，將其克隆、測序。根據(jù)測序結(jié)果，應(yīng)用Primer 6.0軟件設(shè)計SCAR引物進(jìn)行引物篩選，獲得1對引物并成功轉(zhuǎn)化為低溫刺激型秀珍菇的穩(wěn)定SCAR標(biāo)記。采用該引物對供試秀珍菇菌株的基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，低溫刺激型秀珍菇菌株均能擴(kuò)增出大小為205 bp的特異性DNA片段。該ISSR-SCAR標(biāo)記能快速、有效地鑒別出低溫刺激型秀珍菇菌株，準(zhǔn)確率達(dá)100%，為秀珍菇種質(zhì)資源的鑒別和分類提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：秀珍菇;低溫刺激;ISSR特異性標(biāo)記;SCAR分子標(biāo)記

Abstract： A specific ISSR marker was obtained based on the antagonism test， fruiting test and ISSR spectrum analysis of 18 strains to identify the low-temperature stimulating type of Pleurotus geesteranus rapidly and accurately. The specific ISSR marker was cloned and sequenced. SCAR primers （designed by Primer 6.0） for the specific ISSR marker were screened， than a pair specific primers were obtained， which could convert the specific ISSR marker to stable SCAR mark. Verification was conducted by PCR using the screened specific primers to amplify the genomic DNA. Results showed that 205 bp specific fragment was amplified only in the low-temperature stimulating type of P. geesteranus strains. This ISSR-SCAR marker could distinguish the low-temperature stimulating type of P. geesteranus strains rapidly with accurasy of 100%. This study would provide a technological support for the identification and classification of P. geesteranus germplasm resources.

Keywords： Pleurotus geesteranus; low-temperature stimulating; specific ISSR marker; SCAR marker

秀珍菇（Pleurotus geesteranus）隸屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，商品名或俗稱鳳尾菇，其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，是一種深受廣大消費(fèi)者喜愛的食用菌。近年來隨市場的需求，秀珍菇的栽培規(guī)模日益增大，且國內(nèi)栽培的秀菇菌株品種繁多。秀珍菇根據(jù)出菇溫度可分為高溫型品種和低溫型品種，根據(jù)出菇是否需要低溫刺激可分為自然出菇型（俗稱假秀珍）和低溫刺激型（也稱反季節(jié)秀珍菇或真秀珍）。自然出菇型秀珍菇特性是菌絲長滿袋且生理成熟后不需要低溫刺激即可出菇。低溫刺激型秀珍菇特性是菌絲長滿袋且生理成熟后，需要低溫刺激方能整齊出菇。真秀珍菇和假秀珍由于出菇時對低溫溫差要求程度不一樣，因而栽培管理方法差異較大。生產(chǎn)中如不了解秀珍菇出菇時所需要的溫度特性，采取不恰當(dāng)?shù)脑耘喙芾矸椒?，會造成出菇差或不出菇、產(chǎn)量低等問題。鑒別秀珍菇出菇是否需要低溫刺激，在菌絲生長階段無法判斷，只有在栽培出菇后才能判別。但栽培出菇周期長，耗時耗力，出菇時還會受到各種氣候因素的影響，判定結(jié)果會存在較大誤差。因此，迫切需要一種簡便快速的方法來鑒別不同溫型的秀珍菇品種。

DNA分子標(biāo)記由于檢測手段簡單、高效，被應(yīng)用到許多領(lǐng)域。近年來，利用分子標(biāo)記進(jìn)行食用菌品種種間的遺傳多樣性分析、遺傳育種、檢測和基因克隆等方面研究在很多品種上都有廣泛應(yīng)用。分子標(biāo)記種類很多，如RAPD、SSR、SRAP、ISSR等，其中SCAR標(biāo)記（Sequence characterized amplified region）重復(fù)性好、可靠性高、對反應(yīng)條件不敏感、不同材料的DNA差異可通過單一條帶的出現(xiàn)與否加以判斷，是一種非常方便、快捷的可用于快速檢測大量個體的方法。目前，在香菇、黑木耳、蘑菇、草菇、側(cè)耳、羊肚菌等種質(zhì)資源上已建立了穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記[1-8]。在秀珍菇研究上，已有ISSR[9-12]、SRAP[13]、RAPD[14-15]、EST-SSR[14]等分子標(biāo)記應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析方面的報道，但能成功轉(zhuǎn)化成SCAR穩(wěn)定標(biāo)記的研究較少。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)秀珍菇出菇溫型與ISSR分子標(biāo)記分類相關(guān)性較高[11]，但沒有與溫度相關(guān)的SCAR分子標(biāo)記的報道。

目前，我國秀珍菇品種繁多且各地相互引種，異種同名、同物異名現(xiàn)象較多，菌種混亂，為了更便捷、準(zhǔn)確、科學(xué)地進(jìn)行低溫刺激型與非低溫刺激型秀珍菇菌株的鑒定分類，本研究采用拮抗、出菇試驗、ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對18個秀珍菇菌株進(jìn)行了測定，旨在構(gòu)建可以鑒別低溫刺激型秀珍菇菌株的SCAR分子標(biāo)記，為加快秀珍菇菌株的鑒別和定向選育提供分子技術(shù)支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌株 ?供試菌株為18個秀珍菇菌株，具體名稱和來源見表1。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?出菇試驗培養(yǎng)料配方：棉籽殼20%、桑枝30%、木屑30%、麥麩18%、輕鈣1%、石灰1%。PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂2 g、磷酸二鉀2 g、瓊脂20 g、水1000 mL。

1.1.3 ?試劑 ?基因組DNA提取試劑盒、2×Es TaqMasterMix （Dye）、Marker DL2000購自北京康為世紀(jì)生物有限公司;通用型DNA純化回收試劑盒購自北京天根生化科技公司;GeLRed核酸凝膠染料購自上海玉博生物科技有限公司;DNA連接試劑盒購自TaKaRa公司;ISSR、SCAR引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物的名稱及核苷酸序列見表2～表3。

1.2 ?方法

1.2.1 ?供試菌株出菇溫差類型的初步判定 ?18個秀珍菇菌棒菌絲長滿后，進(jìn)行出菇試驗。出菇分2種方式進(jìn)行：①菌棒菌絲生理成熟后在25～28?℃下自然放置進(jìn)行出菇，4～6 d觀察現(xiàn)蕾出菇情況;②菌棒菌絲生理成熟后放入8～10?℃的冷庫中放置12?h后，拿出放置室溫下2～3?d，觀察菌棒現(xiàn)蕾出菇情況。

1.2.2 ?18個菌株的拮抗試驗 ?利用PDA綜合培養(yǎng)基對18個菌株進(jìn)行拮抗試驗。接種后的培養(yǎng)皿放置于28?℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10?d左右觀察菌株之間的拮抗反應(yīng)[16]。

1.2.3 ?基因組DNA的提取與檢測 ?將菌絲塊接種到PDA綜合培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，于27?℃培養(yǎng)6～8?d，用解剖刀刮取菌絲。使用DNA提取試劑盒提取菌絲DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，質(zhì)量合格的DNA儲藏于?20?℃冰箱備用。

1.2.4 ?具有多態(tài)性、特異性ISSR引物的篩選 ?利用前期研究[9]篩選獲得18個對秀珍菇具有多態(tài)性的ISSR引物（引物序列見表2）對供試的18個秀珍菇菌株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測，觀察ISSR圖譜，選出具有特異性片段的ISSR引物。ISSR-PCR反應(yīng)體系及條件：2×Es TaqMasterMix（Dye） 12 μL，ddH2O 11?μL，引物（10?μmol/L）1?μL，DNA模板1?μL，總體積25?μL;94?℃預(yù)變性5?min;94?℃變性30?s，45～55?℃退火30?s，72?℃延伸1?min，共35個循環(huán);最后72?℃終延伸10?min，16?℃保存30?min。

1.2.5 ?秀珍菇特異性DNA片段的獲取及序列測定 ?從18個菌株中選出4個代表菌株（低溫刺激型菌株臺秀57（農(nóng)）、金秀和非低溫刺激型菌株秀珍P54、農(nóng)秀18），利用1.2.4篩選出的特異性引物分別對4個代表菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。紫外光下查看在瓊脂糖凝膠的特異條帶，利用通用型DNA純化回收試劑盒對特異片段進(jìn)行DNA純化回收。將回收純化的DNA片段連接到載體pMD18-T Vector上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，培養(yǎng)后對克隆菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后用1.2%的瓊脂糖凝膠對ISSR-PCR產(chǎn)物、回收產(chǎn)物、克隆-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，對正確的克隆子進(jìn)行測序?？寺∽覲CR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件：2×Es Taq Master Mix（Dye） 10?μL，M13（47）0.5?μL，M13（48）0.5?μL，克隆子稀釋液模板0.5??L，ddH2O 8.5?μL，總體積20?μL;94?℃預(yù)變性5?min;94?℃變性30?s，56?℃退火30?s，72?℃延伸90?s，25個循環(huán);最后72?℃延伸5?min。

1.2.6 ?SCAR引物合成及SCAR標(biāo)記的驗證 ?根據(jù)克隆子測序結(jié)果，用Primers 6.0設(shè)計SCAR引物，由北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成。利用合成引物對4個代表菌株基因組DNA擴(kuò)增，進(jìn)行引物篩選。利用篩選出來的合成引物對18個秀珍菇菌株基因組DNA擴(kuò)增驗證，并對特異片段進(jìn)行測序。SCAR擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA模板l?μL，2×Es Taq MasterMix（Dye）12?μL，前引物（10 μmol/L）1?μL，后引物（10 μmol/L）1?μL，ddH2O 10?μL，總體積為25?μL;94?℃預(yù)變性5?min;94?℃變性30?s，55～65?℃退火30?s，72?℃延伸l?min，35個循環(huán);72?℃終延伸10?min。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?菌株出菇類型的初步判定

通過18個菌株出菇試驗，臺秀57（農(nóng)）、臺秀2號等8個菌株的菌絲長滿生理成熟后，在25～28?℃條件下，菌棒不會直接出菇，而在較大的低溫刺激（8～10?℃）條件下能很快現(xiàn)蕾出菇，且出菇整齊;秀珍12、秀珍990等10個菌株菌絲滿袋后在25～28?℃溫度條件下直接現(xiàn)蕾出菇，同時在低溫條件下刺激也能現(xiàn)蕾出菇，但出菇不整齊，具體情況見表4。

2.2 ?供試菌株的拮抗情況

拮抗試驗顯示，低溫刺激型秀珍菇菌株與非低溫刺激型菌株拮抗程度較大，同類菌株之間無拮抗或拮抗程度較低（表5、圖1～圖2）。

2.3 ?具有多態(tài)性、特異性ISSR引物的篩選

通過18個ISSR通用引物對18個供試菌株基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜發(fā)現(xiàn)（圖3），ISSR通用引物8對供試菌株具有多態(tài)性和特異性，即不同類型的菌株能擴(kuò)增出較一致且有別于其他菌株的特異性譜帶。

2.4 ?秀珍菇特異性DNA片段的獲取及序列測定

利用ISSR通用引物8分別對4個菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得特異性譜帶（圖4）?；厥绽门_秀57的特異譜帶，通過ISSR-PCR產(chǎn)物、膠回收產(chǎn)物、克隆子-PCR產(chǎn)物電泳檢測，觀察檢測圖譜，3個產(chǎn)物擴(kuò)增條帶位點一致（圖5），說明陽性克隆子克隆正確。選出正確的克隆子進(jìn)行測序，所得臺秀57（農(nóng)）膠回收DNA片段序列長1312 bp（圖6A）。

2.5 ?SCAR引物的篩選及驗證

根據(jù)臺秀57獲得的1312bp DNA序列共設(shè)計合成5對SCAR引物（表3）。利用這5對引物分別對4個代表菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖7可見，低溫刺激型菌株臺秀57、金秀利用引物A能擴(kuò)增出特異性片段，而利用其他SCAR引物擴(kuò)增，沒有獲得特異性片段。利用引物A對18個供試菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，由圖8可見，8個低溫刺激型菌株均能擴(kuò)增出特異性片段，而10個非低溫刺激型菌株未能擴(kuò)增出特異片段。通過驗證，可以說明引物A是低溫刺激型秀珍菇的特異性標(biāo)記，鑒定準(zhǔn)確率達(dá)100%。特異性片段經(jīng)膠回收測序，片段大小為205 bp（圖6B）。

3 ?討論

用于真菌菌種鑒定的拮抗反應(yīng)是指同種真菌不同個體之間的一種相互識別、相互排斥的現(xiàn)象，準(zhǔn)確的應(yīng)該叫做體細(xì)胞不親和性或營養(yǎng)不親和性。長期以來，拮抗反應(yīng)被廣泛用于真菌菌株鑒別、群體遺傳學(xué)研究中，但是，由于非拮抗基因

的差異也造成了親和菌株間的遺傳差異，拮抗反應(yīng)程度如弱，拮抗與無拮抗之間的界定受實驗者主觀影響比較大，培養(yǎng)基成分也影響拮抗的有無和程度強(qiáng)弱。拮抗反應(yīng)鑒別親和菌株的遺傳關(guān)系存在著不確定性，對于遺傳關(guān)系比較近的菌株來說，拮抗反應(yīng)只能作為菌種鑒定的一個輔助方法[17-18]。出菇試驗是種質(zhì)資源鑒定評價所必須的，但在區(qū)別溫差型品種時，受外界自然條件影響較大，如在秋冬或冬春栽培時，有時外界環(huán)境早晚溫差大，全部菌株均會正常出菇，導(dǎo)致錯誤判斷某些菌株是低溫刺激型或是非低溫型菌株。DNA是物種中較穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，其反映遺傳關(guān)系較形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)更客觀準(zhǔn)確，SCAR分子標(biāo)記技術(shù)操作簡單、快速、準(zhǔn)確可靠，不受外界環(huán)境條件的影響，是較為可靠的秀珍菇種源鑒定分析的方法，但有時因DNA酶降解等一些因素，偶爾會產(chǎn)生一些不穩(wěn)定性。因此，在種質(zhì)資源鑒定中，三種方法結(jié)合使用則更為科學(xué)、準(zhǔn)確。

ISSR檢測手段簡單、高效，常用于揭示食用菌遺傳多態(tài)性和區(qū)分種內(nèi)菌株間親緣關(guān)系，是一種快速、可靠的工具。馮偉林等[11]、陸娜等[10]、林原等[12]、熊芳[7]利用ISSR技術(shù)對秀珍菇菌株進(jìn)行了種群分類，即種內(nèi)菌株間的親緣性鑒定。在幾位學(xué)者的研究中，大部分只是將他們所研究的菌株分為幾個類群，只有馮偉林等[11]發(fā)現(xiàn)農(nóng)藝性狀中出菇溫度與ISSR分子標(biāo)記有相關(guān)性，但沒有找到與溫度相關(guān)的準(zhǔn)確分子標(biāo)記報道。熊芳[7]利用RAPD、SRAP、ISSR分子技術(shù)進(jìn)行了秀珍菇種質(zhì)資源種群分析，并建立6個SCAR標(biāo)記，但這幾個分子標(biāo)記未說明與溫型相關(guān)。筆者在前期研究中，利用ISSR技術(shù)對8個秀珍菇菌株多樣性研究分析[9]，發(fā)現(xiàn)在遺傳相似系數(shù)0.59時8個菌株明顯分為2個群，即不需要大溫差刺激出菇的菌株類群與需要大溫差刺激出菇的菌株類群，2個類群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這也進(jìn)一步說明了出菇溫型與ISSR分子標(biāo)記分類相關(guān)性較高。但I(xiàn)SSR擴(kuò)增易受反應(yīng)條件影響，結(jié)果存在重復(fù)性差的問題，而且由于圖譜條帶數(shù)多、背景模糊，給判斷會帶來一定的誤差。與ISSR標(biāo)記相比，SCAR分子標(biāo)記對反應(yīng)條件不敏感，容易獲得穩(wěn)定的、可靠的、可重復(fù)的條帶，因此，筆者在ISSR分析的基礎(chǔ)上，將ISSR標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，提高了鑒定的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。

本次研究的供試菌株選擇了近幾年在廣西范圍內(nèi)推廣應(yīng)用的菌株，驗證效果明顯，但國內(nèi)當(dāng)前栽培的秀珍菇菌株眾多，且各地交叉引種頻繁，異種同名、同物異名現(xiàn)象較多，本研究構(gòu)建的SCAR標(biāo)記是否能廣泛應(yīng)用于所有的秀珍菇菌株鑒定，尚有待于在更多樣品中進(jìn)行檢驗。

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責(zé)任編輯：黃東杰