陳升陽 陳艷軍 胡水全 程冰冰 仝昊 周百中 李曉勇

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院（鄭州450052）

胰腺癌作為消化系統(tǒng)惡性程度極高的腫瘤類型，發(fā)病率呈逐年升高的趨勢［1］，臨床上目前治療該腫瘤主要以手術(shù)切除為主，但由于患者發(fā)病隱匿，早期尚無有效的診斷手段，多數(shù)患者確診時已出現(xiàn)浸潤或轉(zhuǎn)移，手術(shù)根除困難，病死率高，預(yù)后差［2］。因此，深入研究胰腺癌發(fā)生機制，尋找與其發(fā)病和轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因，對其早期診療及改善預(yù)后具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）作為一種廣泛存在于機體細胞內(nèi)的長度在200 nt 以上的RNA 分子，雖本身不具備編碼蛋白功能，但可通過調(diào)控表觀遺傳基因、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后翻譯等而參與諸多生物學(xué)功能［3］，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤組織中出現(xiàn)表達異常［4-5］，參與了腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。HOXA 簇反義RNA 2（HOXA cluster antisense RNA 2，HOXA?AS2）作為一種與癌癥相關(guān)的lncRNA，已發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中異常表達［7］，且與腫瘤惡性進展有關(guān)［8］。本研究通過分析胰腺癌組織中HOXA?AS2 表達，探討其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，并利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)沉默該基因在人胰腺癌PANC?1 和AsPC?1 細胞中表達，觀察其對細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為胰腺癌機制研究提供參考資料。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料選取2015年8月至2020年8月在我院行根治性手術(shù)治療的胰腺癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前未接受任何治療；（2）術(shù)后病理示胰腺導(dǎo)管癌；（3）臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）心肝腎等臟器嚴(yán)重功能障礙者；（2）合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；（3）患有免疫系統(tǒng)疾病或在使用免疫抑制劑治療者。共入選97例，其中，男58例，女39例；年齡41～76 歲，平均（60.62±10.13）歲，腫瘤部位：胰頭55 例，胰體尾42 例；根據(jù)第七版TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ-Ⅱ期53 例，Ⅲ-Ⅳ期44 例；分化程度：高分化43 例，中低分化54 例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46 例。留取胰腺癌和癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣在2 cm 以上）組織，迅速置于液氮中，-70 ℃保存。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備PANC?1 和AsPC?1 細胞購自上海通派生物科技有限公司，RPMI?1640 培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司，總RNA 提取試劑（Trizol 法）和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自日本TaKaRa 公司，HOXA?AS2 和內(nèi)參引物由上海生工生物工程公司設(shè)計合成，HOXA?AS2 干擾序列和陰性對照序列由上海捷蘭生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，CCK?8 試劑購自北京鼎盛偉業(yè)生物科技有限公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司，基質(zhì)膠購自美國BD 公司，CFX96 實時熒光定量PCR 儀購自美國Bio?Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 RT?PCR 檢測胰腺癌和癌旁組織中HOXA?AS2 表達將胰腺癌和癌旁組織取出，剪碎，研磨，加入細胞裂解液，使用總RNA 提取試劑（Trizol法）提取總RNA，利用紫外分光光度計檢測其純度和濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明對總RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并按照PCR 試劑盒試劑盒說明使用實時熒光定量PCR 儀對目的基因擴增。序列：HOXA?AS2：上游：5′?CTGTCTGCGAAGGCCTAAAG?3′，下游：5′?CTAGGTAAGCGCTGCTCCAA?3′；GAPDH：上游：5′?GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG?3′下游：5′?ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT?3′。反應(yīng)條件：95 ℃2 min，94 ℃30 s，59 ℃20 s，70 ℃40 s，38次循環(huán)。使用2-△△Ct法計算組織中HOXA?AS2表達量。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和處理將PANC?1 和AsPC?1 細胞用含10%胎牛血清的RPMI?1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，條件：5%CO2、37 ℃，培養(yǎng)液每隔24 h 更換1 次，待細胞融合度在80%以上時，胰酶消化，傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長的細胞分為三組：（1）干擾序列（si?HOXA?AS2）組：按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明轉(zhuǎn)染siRNA 序 列5′?CAAGCUUGACAAGUUCAGCU?CAA?3′：（2）陰性對照（si?Con）組：按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明轉(zhuǎn)染對照序列5′?GAUUCCCC?GGACUUCUCACAG?3′；（3）空白組：不作任何處理。處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 RT?PCR 檢測細胞中HOXA?AS2 表達取各組培養(yǎng)48 h 的細胞，用細胞裂解液裂解后，其他操作步驟同1.2.1。

1.2.4 CCK?8 檢測細胞增殖活性將各組細胞消化后，制備成2.5×104/mL 細胞懸液，分別取200 μL接種在96 孔板，每個樣本設(shè)復(fù)孔5 個，分別在培養(yǎng)12、24、48、72 和96 h 時，將CCK?8 液10 μL 加入各孔，培養(yǎng)120 min，使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處檢測各孔吸光度（OD）值。

1.2.5 Transwell 法檢測細胞侵襲力用培養(yǎng)液對基質(zhì)膠進行稀釋后平鋪在Transwell 小室上室，過夜風(fēng)干。取各組培養(yǎng)48 h 的細胞，消化、用無血清培養(yǎng)液制備成密度為2.5×105/mL的懸液，取200 μL 接種于小室上室，下室則加入含20%胎牛血清培養(yǎng)液600 μL，培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS 沖洗3 次，甲醛固定，去除邊緣散落的細胞，0.1%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡觀察，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。重復(fù)實驗3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 21.0 軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌和癌旁組織中HOXA?AS2表達HOXA?AS2 在胰腺癌組織中表達量為（2.21 ± 0.20），高于癌旁組織的（1.03 ± 0.14），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=48.030，P＜0.001）。

2.2 胰腺癌組織中HOXA?AS2 表達與臨床指標(biāo)的相關(guān)性胰腺癌組織中HOXA?AS2 表達量與年齡、性別和腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），而在不同TNM分期、分化程度和是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 細胞中HOXA?AS2 表達PANC?1 細胞中，與si?Con 組和空白組比較，si?HOXA?AS2 組HOXA?AS2表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），同樣，AsPC?1 細胞中si?HOXA?AS2 組HOXA?AS2表達量比si?Con 組和空白組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.4 細胞增殖活性PANC?1 和AsPC?1 細胞中，si?HOXA?AS2 組24、48、72 和96 h 時吸光度OD值均低于si?Con 組和空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3、4。

2.5 細胞侵襲力PANC?1 和AsPC?1 細胞中，si?HOXA?AS2組侵襲細胞數(shù)均低于si?Con 組和空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5 和圖1、2。

3 討論

胰腺癌作為惡性程度高、病死率高的消化道腫瘤，早期癥狀不典型，且病情進展快，易發(fā)生淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移［9］，盡管現(xiàn)有的治療手段不斷進步，但患者總體預(yù)后改善有限，5年生存率較低［10］。研究表明［11］，高侵襲轉(zhuǎn)移性是影響胰腺癌患者預(yù)后的獨立風(fēng)險因素。因此，進一步明確與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機制，尋找敏感基因?qū)χ笇?dǎo)患者早期診療具有重要意義。lncRNA 作為近年來研究熱點，已發(fā)現(xiàn)其參與了惡性腫瘤發(fā)生進展過程［12］，且與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［13］。有研究指出［14］，lncRNA 對胰腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后影響顯著，有望為胰腺癌的靶向治療及預(yù)后評估提供新的治療靶點和分子標(biāo)志物。HOXA?AS2作為一種lncRNA，定位于人染色體7p15.2，屬于HOXA 簇成員，與急性髓系白血病發(fā)病關(guān)系密切［15］，在細胞增殖過程發(fā)揮重要作用［16］，參與了非小細胞肺癌惡性進展［17］，且參與了骨肉瘤細胞遷移及侵襲過程［18］。本研究結(jié)果顯示，HOXA?AS2 在胰腺癌組織中表達量高于癌旁組織，說明胰腺癌組織中HOXA?AS2 呈高表達，可能與胰腺癌發(fā)生相關(guān)。TNM 分期Ⅲ-Ⅳ期、中低分化和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胰腺癌患者組織中HOXA?AS2 表達量明顯升高，說明HOXA?AS2 表達量與胰腺癌惡性程度有關(guān)，可能是判定患者惡性程度的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

表1 不同臨床指標(biāo)胰腺癌組織中HOXA?AS2 表達量比較Tab.1 Comparison on the expression of HOXA?AS2 in pancreatic cancer tissues with different clinical indexes±s

表1 不同臨床指標(biāo)胰腺癌組織中HOXA?AS2 表達量比較Tab.1 Comparison on the expression of HOXA?AS2 in pancreatic cancer tissues with different clinical indexes±s

指標(biāo)年齡≥61 歲＜61 歲性別男性女性腫瘤部位胰頭胰體尾腫瘤大小≥2 cm＜2 cm TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期分化程度高分化中低分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是 否例數(shù)57 40 58 39 55 42 41 56 53 44 43 54 46 51 HOXA?AS2 表達量2.23±0.20 2.17±0.19 2.19±0.21 2.22±0.19 2.18±0.19 2.24±0.21 2.22±0.19 2.19±0.20 2.15±0.18 2.27±0.20 2.12±0.17 2.27±0.19 2.28±0.21 2.14±0.17 t 值1.487 0.775 1.443 0.684 2.941 3.855 3.628 P 值0.140 0.440 0.152 0.496 0.004＜0.001＜0.001

表2 不同組PANC?1 和AsPC?1 細胞中HOXA?AS2 表達量比較Tab.2 Comparison on the expression levels of HOXA?AS2 in PANC?1 and AsPC?1 cells in different groups x±s

表3 不同組PANC?1 細胞不同時點增殖活性Tab.3 The proliferation activities of PANC?1 cells in different groups at different time points ±s

表3 不同組PANC?1 細胞不同時點增殖活性Tab.3 The proliferation activities of PANC?1 cells in different groups at different time points ±s

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與si?Con 組比較，#P ＜0.05

組別si?HOXA?AS2 組si?Con 組空白組F 值P 值12 h 0.52±0.04 0.48±0.06 0.47±0.06 1.199 0.329 24 h 0.81±0.12*#0.96±0.09 0.94±0.10 3.874 0.044 48 h 1.20±0.03*#1.37±0.12 1.42±0.07 12.620 0.001 72 h 1.33±0.10*#1.68±0.07 1.64±0.06 33.661＜0.001 96 h 1.65±0.11*#1.91±0.07 1.98±0.09 21.403＜0.001

表4 不同組AsPC?1 細胞不同時點增殖活性Tab.4 The proliferation activities of AsPC?1 cells in different groups at different time points ±s

表4 不同組AsPC?1 細胞不同時點增殖活性Tab.4 The proliferation activities of AsPC?1 cells in different groups at different time points ±s

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與si?Con 組比較，#P ＜0.05

組別si?HOXA?AS2 組si?Con 組空白組F 值P 值12 h 0.37±0.07 0.39±0.08 0.43±0.07 0.864 0.441 24 h 0.62±0.09*#0.81±0.03 0.78±0.08 11.880 0.001 48 h 0.81±0.12*#0.95±0.05 0.97±0.06 6.795 0.008 72 h 1.02±0.10*#1.27±0.16 1.32±0.09 10.768 0.001 96 h 1.25±0.04*#1.61±0.09 1.66±0.13 31.626＜0.001

表5 不同組PANC?1 和AsPC?1 細胞侵襲力比較Tab.5 Comparison on the invasion abilities of PANC?1 and AsPC?1 cells in different groups ±s

表5 不同組PANC?1 和AsPC?1 細胞侵襲力比較Tab.5 Comparison on the invasion abilities of PANC?1 and AsPC?1 cells in different groups ±s

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與si?Con 組比較，#P ＜0.05

組別si?HOXA?AS2 組si?Con 組空白組F 值P 值PANC?1 細胞97.83±9.11*#118.50±10.52 123.83±7.03 13.968＜0.001 AsPC?1 細胞88.00±5.22*#111.67±5.68 113.17±7.47 31.130＜0.001

圖1 不同組PANC?1 細胞侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）Fig.1 Invasion of PANC?1 cells in different groups（crystal violet staining，×200）

圖2 不同組AsPC?1 細胞侵襲情況Fig.2 Invasion of AsPC?1 cells in different groups（crystal violet staining，×200）

有研究［19］指出，HOXA?AS2 通過調(diào)控miR?520c?3p/GPC3 軸促進肝癌細胞增殖。WANG 等［20］則指出，HOXA?AS2 通過調(diào)節(jié)miR?125b/Smad2 軸促進膀胱癌的遷移和侵襲。本研究利用siRNA 技術(shù)特異性沉默PANC?1 和AsPC?1 細胞中HOXA?AS2 表達，結(jié)果顯示，兩種細胞中si?HOXA?AS2 組中HOXA?AS2 表達量明顯降低，說明細胞中HOXA?AS2 表達被成功抑制。本研究結(jié)果顯示，PANC?1 和AsPC?1細胞中，si?HOXA?AS2 組24、48、72 和96 h 時吸光度OD 值均低于si?Con 組和空白組，說明沉默細胞中HOXA?AS2 表達細胞增殖活性被明顯抑制，提示HOXA?AS2 可能參與了胰腺癌細胞增殖過程。本研究結(jié)果顯示，PANC?1 和AsPC?1 細胞中，si?HOXA?AS2 組侵襲細胞數(shù)均低于si?Con 組和空白組，說明沉默細胞中HOXA?AS2 表達細胞侵襲能力被抑制，HOXA?AS2 可能參與了胰腺癌細胞侵襲過程。

綜上所述，HOXA?AS2 在胰腺癌組織中表達量升高，且與惡性進展臨床指標(biāo)相關(guān)，沉默其表達可減少細胞增殖、抑制細胞侵襲力，但具體機制有待進一步研究明確。