楊閃閃 唐冉冉 江華 湯秋勤

1南京醫(yī)科大學（南京210029）；2南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院（南京市婦幼保健院）（南京210004）

胎兒生長受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）指胎兒應(yīng)有的生長潛力受損，估測的胎兒體質(zhì)量小于同孕齡第10 百分位數(shù)的小于孕齡兒［1］。我國FGR 平均發(fā)病率為6.39%［2］。 FGR 會增加胎兒窘迫、早產(chǎn)、死產(chǎn)等多種不良妊娠結(jié)局，對子代遠期健康也會造成不良影響［3］。FGR 發(fā)病機制尚不明確，母親對胎兒的營養(yǎng)供應(yīng)主要通過胎盤轉(zhuǎn)運，胎盤發(fā)育缺陷或功能障礙往往導致FGR［4］。滋養(yǎng)層細胞是胎盤最主要和最重要的成分，了解滋養(yǎng)層細胞功能的影響因素，從胎盤層面尋找FGR 防治的新分子并深入研究相關(guān)機制十分必要。

細胞周期蛋白L1（cyclin L1，CCNL1）定位于3q25.31，是細胞周期蛋白家族成員之一，參與前體mRNA 的剪切及RNA 的加工，并與細胞周期蛋白依賴性激酶的作用相關(guān)［5］。多個GWASs 研究在《Nature Genetics》等雜志上報道了CCNL1 為新生兒出生體重相關(guān)基因［6-9］，位于CCNL1 附近的rs900400 與出生體重降低顯著相關(guān)，每個風險等位基因可使出生體重降低35 g［8］。本研究通過體外實驗將滋養(yǎng)細胞過表達和干擾CCNL1 基因后，觀察滋養(yǎng)細胞遷移、侵襲、增殖能力及細胞周期、凋亡的變化，為FGR 發(fā)病機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細胞人絨毛膜滋養(yǎng)細胞（HTR8?/SVneo）為本實驗室儲存細胞株。CCNL1 過表達慢病毒及其對照慢病毒購自漢恒生物科技有限公司、CCNL1 小干擾RNA 及其小干擾對照RNA 購自銳博生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 和Trizol 購自美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒和蛋白Marker 購自美國Thermo 公司；電泳、轉(zhuǎn)膜相關(guān)試劑購自賽維爾生物科技有限公司；實驗所用抗體購自美國SANTA CRUZ 公司；CCK?8 試劑盒購自日本Dojindo 公司；Transwell 試劑盒購自美國Corning 公司；細胞凋亡試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)HTR?8/SVneo 培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 d 將HTR?8/SVneo 細胞分別消化并接種于六孔板，待細胞融合度達60%～ 70%，按照Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書和慢病毒轉(zhuǎn)染方法操作。將轉(zhuǎn)染的細胞分為CCNL1過表達對照組（CCNL1?NC）、CCNL1 過表達組（CCNL1?OE）；干擾對照組（CCNL1?SiNC）、干擾組1（CCNL1?Si1）、干擾組2（CCNL1?Si2）、干擾組3（CCNL1?Si3）。

1.2.3 總RNA 提取及實時定量PCR 檢測轉(zhuǎn)染24 h 后，按照Trizol 法提取細胞中的RNA 并測定濃度，參照Thermo 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBGreen 說明書操作，于Thermo 實時熒光定量PCR 進行分析，以2?△△Ct平均值作為其mRNA 表達水平。

1.2.4 蛋白質(zhì)提取及WB 法檢測轉(zhuǎn)染48 h 后，使用RIPA 和PMSF 提取蛋白，參照BCA 蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度，然后按照WB 法操作，最后用Image J 軟件分析，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為CCNL1 蛋白相對表達量。

1.2.5 細胞增殖實驗轉(zhuǎn)染24 h后，將HTR?8/SVneo細胞接種于96孔板中，密度為3 000個/孔。分別于0（即細胞貼壁后）、24、48、72 h向每孔加入10 μL 的CCK?8 溶液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h 后，檢測450 nm 的吸光度值。

1.2.6 細胞侵襲實驗提前將基質(zhì)膠4 ℃融化后加入Transwell 小室上層，37 ℃溫育凝固成膠狀。分別收集各組細胞，用不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基稀釋后，按照3 × 104個/孔加入小室上層，下層加入600 μL完全培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)72 h 后，加入4%多聚甲醛內(nèi)固定，結(jié)晶紫染色，用棉棒將小室內(nèi)層未遷移過膜的細胞擦除，顯微鏡下拍照后統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.7 細胞遷移實驗Transwell 小室上層無需鋪基質(zhì)膠，其余步驟均同侵襲實驗。

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測細胞周期用不含EDTA的胰酶消化后分別收集各組細胞，70%乙醇4 ℃固定過夜。離心后棄上清液，加入預冷PBS 輕輕振蕩重懸細胞。離心收集細胞后加入配置好的碘化丙啶染色液染色、濾網(wǎng)過濾，采用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.9 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化后分別收集各組細胞，離心后棄上清液，加入預冷PBS 輕輕振蕩重懸細胞，離心收集細胞后加入Annexin V?PE 和7?AAD 避光、室溫孵后濾網(wǎng)過濾，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CCNL1 轉(zhuǎn)染效果檢測qPCR 檢測和WB 檢測結(jié)果顯示，與CCNL1?NC 組相比，CCNL1?OE 組CCNL1mRNA 和蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1、2；與CCNL1?SiNC 組相比，CCNL1?Si1 組、CCNL1?Si2 組、CCNL1?Si3 組CCNL1 mRNA 和蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1、2。

圖1 各組HTR?8/SVneo 細胞中CCNL1 mRNA 相對表達水平Fig.1 Relative mRNA levels of CCNL1 in HTR?8/SVneo cells in each group

圖2 各組HTR?8/SVneo 細胞中CCNL1 蛋白相對表達水平Fig.2 Relative protein levels of CCNL1 in HTR?8/SVneo cells in each group

2.2 CCNL1 表達變化對HTR?8/SVneo 細胞增殖的影響CCK?8 實驗顯示，轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后，與CCNL1?NC 組相比，CCNL1?OE 組的細胞活性減弱，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3A；轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后，與CCNL1?SiNC 組相比，CCNL1?Si1 組、CCNL1? Si2 組、CCNL1?Si3 組的細胞活性增強，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3B。

圖3 各組HTR?8/SVneo 細胞增殖實驗結(jié)果Fig.3 Results of HTR?8/SVneo cell proliferation in each group

2.3 CCNL1 表達變化對HTR?8/SVneo 細胞侵襲的影響Transwell實驗顯示，與CCNL1?NC組相比，CCNL1?OE 組穿膜侵襲細胞數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖4 和表1；與CCNL1?SiNC組相比，CCNL1?Si1 組、CCNL1? Si2 組、CCNL1?Si3組穿膜侵襲細胞數(shù)增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖4 和表1。

圖4 各組HTR?8/SVneo 細胞侵襲室驗結(jié)果Fig.4 Results of HTR?8/SVneo cell invasion in each group

2.4 CCNL1 表達變化對HTR?8/SVneo 細胞遷移的影響Transwell實驗顯示，與CCNL1?NC組相比，CCNL1?OE 組穿膜遷移細胞數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖5和表1；與CCNL1?SiNC組相比，CCNL1?Si1 組、CCNL1?Si2 組、CCNL1?Si3 組穿膜遷移細胞數(shù)增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖5 和表1。

圖5 各組HTR?8/SVneo 細胞遷移實驗結(jié)果Fig.5 Results of HTR?8/SVneo cell migration in each group

表1 各組HTR?8/SVneo 穿膜細胞數(shù)比較Tab.1 Comparison of the number of HTR?8/SVneo penetrating cells in each group ±s

表1 各組HTR?8/SVneo 穿膜細胞數(shù)比較Tab.1 Comparison of the number of HTR?8/SVneo penetrating cells in each group ±s

注：CCNL1?Si1 組與CCNL1?SiNC 組比較，aP ＜0.001；CCNL1?Si2組與CCNL1?SiNC 組比較，bP ＜0.001；CCNL1?Si3 組與CCNL1?SiNC組比較，cP ＜0.001

組別CCNL1?OE 組CCNL1?NC 組t 值P 值CCNL1?Si1 組CCNL1?Si2 組CCNL1?Si3 組CCNL1?SiNC 組F 值P 值穿膜侵襲細胞數(shù)（個）104.67±9.02 403.33±7.09 45.08＜0.001 104.00±9.17a 153.67±9.45b 254.33±9.71c 53.33±7.51 272.33＜0.001穿膜遷移細胞數(shù)（個）74.33±9.07 205.00±12.53 14.63＜0.001 112.67±8.50a 104.33±11.68b 123.67±7.02c 45.00±10.82 39.61＜0.001

2.5 CCNL1 表達變化對HTR?8/SVneo 細胞周期的影響流式分析結(jié)果顯示，分別與CCNL1?NC 組細胞的G1 期、S 期、G2 期相比，CCNL1?OE 組細胞的G1 期和G2 期細胞比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），S 期細胞比例降低（P＜0.05），見圖6 和表2；分別與CCNL1?SiNC 組細胞的G1 期、S 期、G2 期相比，干擾組（CCNL1?Si1、CCNL1?Si2、CCNL1?Si3）的G1 期、S 期、G2 期細胞比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6 和表2。

表2 各組HTR?8/SVneo 細胞周期比例比較Tab.2 Comparison of cell cycle ratio of HTR?8/SVneo in each group ±s

表2 各組HTR?8/SVneo 細胞周期比例比較Tab.2 Comparison of cell cycle ratio of HTR?8/SVneo in each group ±s

注：CCNL1?OE 組與CCNL1?NC 組比較，dP ＜0.05

組別CCNL1?OE 組CCNL1?NC 組t 值P 值CCNL1?Si1 組CCNL1?Si2 組CCNL1?Si3 組CCNL1?SiNC 組F 值P 值G1 期60.14±1.96 57.18±2.03 1.48 0.28 52.39±0.64 55.55±2.72 51.81±0.36 51.41±0.91 3.25 0.14細胞周期（%）S 期18.53±0.38d 21.61±0.41-0.77 0.02 24.59±1.92 24.49±1.10 26.97±1.00 26.52±0.81 2.02 0.25 G2 期21.33±1.57 21.21±2.44 0.06 0.96 23.03±1.28 19.96±1.61 21.23±1.36 22.08±1.71 1.50 0.34

圖6 CCNL1 過表達或干擾對細胞周期的影響Fig.6 Effects of CCNL1 overexpression or interference on cell cycle

2.6 CCNL1 表達變化對HTR?8/SVneo 細胞凋亡的影響流式分析結(jié)果顯示，CCNL1?OE組和CCNL1?NC 組中凋亡細胞比例分別為（8.52 ± 0.99）%和（11.42 ± 0.16）%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖7。

圖7 CCNL1 過表達或干擾對細胞凋亡的影響Fig.7 Effects of CCNL1 overexpression orInterference on cell apoptosis

3 討論

FGR 是一種常見的新生兒出生體重異常疾病，發(fā)病機制復雜，目前仍未闡明。胎盤是胚胎生長發(fā)育的關(guān)鍵器官，承擔母體及胎兒之間營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運。研究［10-12］表明FGR 胎盤組織中存在著異常表達的基因，這些基因可通過調(diào)控胎盤滋養(yǎng)層細胞的功能，改變滋養(yǎng)細胞的侵襲、遷移能力，打破胎盤滋養(yǎng)細胞增殖/凋亡平衡而導致胎盤功能障礙，與FGR 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

近年來，多個研究報道了CCNL1為新生兒出生體重相關(guān)基因，與FGR 的發(fā)生密切相關(guān)。研究［13］發(fā)現(xiàn)CCNL1 家族成員Cyclin D1 敲除后，小鼠出生體重下降，發(fā)育異常率增加，CCNL1 基因與FGR 間的關(guān)系引起人們關(guān)注。CCNL1 是細胞周期蛋白家族的一員，參與前體mRNA 的剪切及RNA 的加工，并與細胞周期蛋白依賴性激酶的作用相關(guān)［14］。目前國內(nèi)外有很多研究發(fā)現(xiàn)，CCNL1 在腫瘤進展方面發(fā)揮重要作用，被認為是腫瘤預后因子和調(diào)節(jié)細胞增殖因子，研究發(fā)現(xiàn)CCNL1 可以改變多種腫瘤細胞的侵襲、遷移能力［15-18］。胎盤被認一種類腫瘤組織，其功能細胞——滋養(yǎng)細胞具有與腫瘤細胞相似的侵襲及增殖行為，不同之處在于腫瘤不受控制，而人滋養(yǎng)細胞的侵襲局限于子宮內(nèi)膜和子宮肌層的上三分之一處［19］。故猜測CCNL1基因在胎盤的發(fā)育和功能中也發(fā)揮一定作用。但目前CCNL1 調(diào)控胎盤滋養(yǎng)層細胞功能作用機制并不完全清楚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCNL1 在HTR?8/SVneo 中過表達后，細胞的增殖、侵襲、遷移能力降低，而CCNL1 在HTR?8/SVneo 中干擾后，細胞的增殖、侵襲、遷移能力增強。細胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期、即DNA 合成前期（G1 期）、DNA 合成期（S 期）與DNA 合成后期（G2 期），CCNL1 在HTR?8/SVneo 中過表達后，細胞阻滯于S 期。這些結(jié)果均表明CCNL1 在HTR?8/SVneo中是一個抑制增殖因子。推測過表達CCNL1基因會減少滋養(yǎng)層細胞侵入子宮蛻膜與子宮肌層能力，導致胎盤的淺著床，不利于子宮螺旋動脈的重鑄，影響胎盤發(fā)育，限制母胎血液循環(huán)及營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運。國內(nèi)外學者和本課題組前期研究均發(fā)現(xiàn)胎盤的體積和重量與新生兒出生體重成正相關(guān)，巨大兒胎盤明顯增大，而FGR 胎盤則明顯縮小［20-21］。由此可見胎盤中高表達CCNL1 可影響胎盤發(fā)育從而導致FGR 的發(fā)生。

綜上所述，CCNL1 能夠抑制HTR?8/SVneo 增殖，降低侵襲、遷移能力，可能影響細胞周期分布。本研究探討了CCNL1 對人絨毛膜滋養(yǎng)細胞生物學行為的影響，為從胎盤層面尋找FGR 防治提供了思路，有助于闡明在FGR 發(fā)生中的分子機制，并可能為FGR 防治提供潛在的干預靶標，以改善妊娠結(jié)局，提高新生兒的生存質(zhì)量。