張亞男 周佺 農(nóng)海斌 韋壽鋒 張瓊 白亦光 劉明富 曾高峰 宗少暉

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科（南寧530021）；2廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（南寧530000）；3廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心（南寧530021）

在全球男性常見的惡性腫瘤中，前列腺癌發(fā)病率僅次于肺癌居第二位，占惡性腫瘤總數(shù)的13.5%［1］。前列腺癌在早期癥狀不明顯，大約50%的患者確診即伴有骨轉(zhuǎn)移，有超過約75%的前列腺癌患者會最終發(fā)生骨轉(zhuǎn)移［2］。癌細(xì)胞侵犯到骨骼會引起的脊髓壓迫、病理性骨折等骨骼并發(fā)癥，嚴(yán)重者可能出現(xiàn)全身器官功能衰竭［3］。由于大多數(shù)患者確診時已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或已到晚期，臨床上對于此類患者沒有根治性方案［4］。目前治療前列腺癌主要應(yīng)用手術(shù)、化療、內(nèi)分泌治療、放療等方法［5-6］，近年來雖然通過改進(jìn)治療技術(shù)、優(yōu)化治療方案，前列腺癌的中位生存期有所提高［7］，但是前列腺癌一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，無法徹底治愈，而目前的放化療等治療手段給患者帶來嚴(yán)重副作用［8-9］，因此尋求防治前列腺癌及其轉(zhuǎn)移的新靶點具有重要意義。磷脂酰肌醇3?激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路參與細(xì)胞增殖、分化和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細(xì)胞調(diào)節(jié)過程，是腫瘤的基礎(chǔ)信號通路之一［10］。磷酸肌醇依賴性蛋白激酶?1（PDK?1）被認(rèn)為是PI3K?AKT 級聯(lián)的重要上游脂質(zhì)激酶，通過磷酸化的方式激活A(yù)KT，觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步激活A(yù)KT下游因子［11］。目前對PDK?1 研究逐漸成為腫瘤研究的熱點，但是對PDK?1 的具體分子機制研究尚未明確。有學(xué)者在非霍奇金淋巴瘤中抑制PDK?1 阻斷其下游的信號傳導(dǎo)通路，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻斷細(xì)胞周期抑制非霍奇金淋巴瘤的生長［12］，表明通過藥物抑制PDK?1 可以抑制非霍奇金淋巴瘤生長。因此推測BX?912 可能抑制前列腺癌的生長與轉(zhuǎn)移，本研究通過體外、體內(nèi)驗證其對前列腺癌的影響，為研究前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料30 只8 周齡C57BL/6 雄鼠購于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，體質(zhì)量18～22 g，RM?1 購于美國ATCC 公司，BX?912 購美國Selleck 公司，胎牛血清購于美國VWR 公司，DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、PBS 和2.5%結(jié)晶紫染液購于索萊寶公司，CCK?8 購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞增殖?毒性檢測（CCK?8）RM?1 以2 000個/孔密度接種于96 孔板上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后用含有不同濃度BX?912（0、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）的完全培養(yǎng)基換液，分別培養(yǎng)12、24、36、48 h 后，每孔加入10 μL CCK?8，將96 孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h，Microplate Reader795 酶標(biāo)儀測450 nm 波長處的OD值。

1.3 細(xì)胞劃痕實驗取對數(shù)期生長RM?1 以5 ×105個/孔種植于6 孔板中培養(yǎng)至95%融合度，每孔加入20 μg/mL 的絲裂霉素C，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h，吸去培養(yǎng)基，用滅菌100 μL 槍頭在孔中垂直劃線，PBS 小心清洗3 次，分別加入配置好含有BX?912（0、2.5、5 μmol/L）的無血清DMEM 培養(yǎng)基，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，在加藥后（0、8、16、24 h）時間點在倒置顯微鏡下觀察拍照，分析細(xì)胞遷移率。

1.4 細(xì)胞克隆實驗取對數(shù)生長期的RM?1，用0.25%含有EDTA 的胰蛋白酶消化下來，計數(shù)后每孔加入250 個RM?1，置于5% CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約12 h 后細(xì)胞貼壁，用含有不同濃度的BX?912（0、2.5、5 μmol/L）的完全培養(yǎng)基換液（含10%胎牛血清），每隔3 d 換液，若培養(yǎng)皿中出現(xiàn)多個肉眼可見的克隆，用結(jié)晶紫染色液參照說明書對細(xì)胞進(jìn)行染色。計算克隆形成數(shù)目及克隆形成率。

1.5 前列腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型的建立30 只C57BL/6 雄鼠用5%水合氯醛（0.2 mL/只）腹腔注射，麻醉滿意后，備皮，碘伏消毒三次右下肢膝關(guān)節(jié)周圍，用微量注射器從右下肢脛骨近端脛骨頭凹點進(jìn)針，旋轉(zhuǎn)穿刺2～3 mm，緩慢注射10 μL 配置好的細(xì)胞懸液（含5 × 105個RM?1），拔出注射器，碘伏消毒，待小鼠蘇醒后放回籠中。

1.6 BX?912對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型干預(yù)造模成功后，30 只小鼠隨機分為3 組，分別為對照組（PBS）、低濃度組（1 mg/kg）、高濃度組（5 mg/kg）。每隔1 天腹腔注射相應(yīng)劑量的藥物。14 d 取右下肢脛骨行Micro?CT 檢測（SCANCO Medical AG，型號：μCT100），掃描參數(shù)：電壓70 kV，電流200 μA，分辨率10 μm，隨機選取脛骨近端骨溶解區(qū)域分析骨體積分?jǐn)?shù)，骨小梁數(shù)目及骨小梁厚度，然后游離瘤體稱重并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用（）表示，單因素方差分析用于比較不同組別之間的差異，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK?8 檢測RM?1 增殖活性結(jié)果在BX?912干預(yù)12、24、36、48 h 時間點分別通過CCK?8 檢測RM?1增殖活性。在BX?912濃度為1.25 μmol/L及以上時對RM?1 有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性（P＜0.05），在0.625 μmol/L 及以下濃度時，BX?912對RM?1 無毒性作用（P＞0.05，表1）。

表1 CCK?8 實驗測定RM?1 增殖活性Tab.1 The proliferative activity of RM?1 was detected by CCK?8 ±s

表1 CCK?8 實驗測定RM?1 增殖活性Tab.1 The proliferative activity of RM?1 was detected by CCK?8 ±s

注：通過CCK?8 在12、24、36、48 h 時間點測定BX?912 干預(yù)RM?1 的OD 值，*P ＜0.05

BX?912 濃度（μmol/L）0 0.156 0.313 0.625 1.25 2.5 5 10 20 40干預(yù)12 h 0.734±0.014 0.728±0.009 0.729±0.008 0.722±0.017 0.656±0.055*0.654±0.035*0.582±0.026*0.532±0.016*0.476±0.029*0.358±0.030*干預(yù)24 h 1.577±0.085 1.598±0.007 1.612±0.068 1.619±0.028 1.478±0.055*1.263±0.032*0.970±0.039*0.755±0.039*0.464±0.028*0.340±0.034*干預(yù)36 h 1.973±0.707 1.997±0.091 1.970±0.145 1.997±0.211 1.760±0.010*1.554±0.061*1.257±0.074*0.989±0.026*0.505±0.066*0.300±0.026*干預(yù)48 h 3.554±0.139 3.571±0.107 3.626±0.166 3.679±0.065 3.213±0.115*2.877±0.100*2.453±0.105*1.813±0.104*0.538±0.046*0.222±0.076*

2.2 劃痕實驗檢測RM?1 的遷移能力結(jié)果通過細(xì)胞劃痕實驗觀察BX?912 對RM?1 細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示BX?912 能顯著抑制RM?1 的遷移能力（圖1A），隨著BX?912 濃度的增加，抑制效果更加明顯（圖1B）。

圖1 BX?912 抑制RM?1 的遷移Fig.1 BX?912 inhibits the migration of RM?1

2.3 克隆實驗檢測RM?1 獨立生存能力克隆結(jié)果顯示，BX?912 干預(yù)組克隆形成數(shù)目較對照組低（圖2A），對克隆數(shù)目計數(shù)顯示三組克隆形成數(shù)：0 μmol/L 組＞2.5 μmol/L 組＞5 μmol/L 組（P＜0.05，圖2B），三組克隆形成率0 μmol/L 組＞2.5 μmol/L 組＞5 μmol/L 組（P＜0.05，圖2C），提示BX?912 能抑制RM?1 的獨立生存能力，隨著BX?912 濃度的增加，這種抑制作用更加明顯。

圖2 BX?912 抑制RM?1 克隆形成Fig.2 BX?912 inhibits clone formation of RM?1

2.4 BX?912 干預(yù)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型結(jié)果造模7 d 后，小鼠右下肢脛骨近端可觸及綠豆大小包塊，造模成功，進(jìn)行藥物干預(yù)，14 d 后處死小鼠，游離瘤體觀察瘤體大小情況（圖3A），進(jìn)一步對瘤體稱重統(tǒng)計分析，瘤體質(zhì)量的比較結(jié)果為：對照組＞低濃度組＞高濃度組（P＜0.05，見圖3B），表明BX?912 能抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤體的生長，并呈濃度依賴性。Micro?CT 檢測顯示骨侵蝕情況：對照組＞低濃度組＞高濃度組（P＜0.05，圖3D），表明BX?912 抑制了前列腺癌骨質(zhì)破壞。選取骨溶解區(qū)域?qū)菂?shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目和骨小梁厚度（高濃度組＞低濃度組＞對照組，P＜0.05，圖3C?F），表明與對照組相比，BX?912 處理組骨質(zhì)破壞受到抑制。

圖3 BX?912 對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移模型的影響Fig.3 Effect of BX?912 on bone metastasis model of prostate cancer

3 討論

前列腺癌是一種骨轉(zhuǎn)移率極高的惡性上皮樣腫瘤，且一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，目前無法徹底治愈［13-14］，嚴(yán)重的并發(fā)癥及治療副作用給患者及家庭帶來巨大的精神壓力及沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［15］。前列腺癌的發(fā)生的分子機制錯綜復(fù)雜，糾其根源是基因?qū)用嫔系氖д{(diào)［16］，所以目前對于前列腺癌的研究主要集中在其發(fā)病機制的分子信號通路上［17-18］。

PI3K/AKT 通路與前列腺癌的發(fā)生息息相關(guān)，在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲和生長，激活此通路可以促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展［19］。有研究［20］表明PI3K/AKT 信號傳導(dǎo)途徑在大多數(shù)癌癥中被過度激活，PI3K/AKT 通路與其他通路相互作用可以驅(qū)動前列腺癌的進(jìn)展。而AKT 屬于PDK?1 的下游激活元素，理論上抑制PDK?1 可以間接抑制了AKT 的磷酸化［21］。因此推測通過靶向抑制PDK?1 可能會抑制前列腺癌生長與轉(zhuǎn)移。本研究在CCK?8 結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計細(xì)胞劃痕實驗和細(xì)胞克隆實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BX?912 顯著抑制RM?1 細(xì)胞的遷移能力和獨立生存能力。本研究結(jié)果顯示低濃度組和高濃度組的瘤體較小，骨質(zhì)破壞受到抑制，并且這種抑制呈現(xiàn)濃度依賴性，進(jìn)一步驗證了通過靶向抑制PDK?1 可以抑制前列腺癌對骨骼的破壞。

本研究仍存在不足之處，骨形成和骨吸收是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞動態(tài)相互作用的過程，破骨細(xì)胞是骨組織內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，其來源于骨髓源巨噬細(xì)胞的分化，分化過程受巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M?CSF）和核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）兩種關(guān)鍵因子的調(diào)控［22］，同時成骨細(xì)胞分泌的骨保護(hù)素（OPG）可以競爭性抑制RANKL，骨微環(huán)境的改變會使這些因子發(fā)生相應(yīng)的變化，腫瘤細(xì)胞侵襲骨骼會造成這種穩(wěn)態(tài)調(diào)控的失調(diào)，這涉及到多種因子及調(diào)節(jié)蛋白的參與［23］，而BX?912 在這些機制中作用尚不清楚。除此之外，有關(guān)BX?912 抑制RM?1 增殖與遷移生物學(xué)分子機制有待進(jìn)一步研究。