蒲璐璐，戴怡鳳，李豆南，郭 燦，姚鍵梅，徐 浩，邱樹毅*

（1.貴州省茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

醬香型白酒獨(dú)特的生產(chǎn)工藝使其在香氣化合物種類以及數(shù)量上比較復(fù)雜[1-2]，主要包括酯類、酸類、醇類、醛類、酮類、酚類、丙酮類、氮雜環(huán)類和含硫類等化合物[3]。這些成分賦予醬香型白酒“空杯留香、醬香明顯、入口綿柔”等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛[4-5]。然而對(duì)于優(yōu)質(zhì)醬酒而言，酒中風(fēng)味物質(zhì)是決定酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素，隨著醬酒酒齡的增加，風(fēng)味也會(huì)不斷提升，使得酒體品質(zhì)有明顯提升。近年來(lái)，眾多醬香型白酒企業(yè)紛紛提出“年份酒”的概念[6-8]，但是這些所謂的“年份酒”中卻摻雜著許多偽劣、冒牌產(chǎn)品，對(duì)醬酒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展產(chǎn)生了不利的影響[9]。目前的研究中，尚未有較好的方法對(duì)醬酒的酒齡進(jìn)行鑒定[10]，因此開發(fā)出有效的酒齡鑒別方法顯得十分必要。而氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于白酒風(fēng)味香氣成分檢測(cè)分析較為成熟，對(duì)白酒的品牌鑒別，品質(zhì)評(píng)價(jià)有重要參考價(jià)值[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)以貴州某企業(yè)不同酒齡的醬香型白酒為主要研究對(duì)象，利用電子鼻和直接進(jìn)樣結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，研究醬香型白酒中揮發(fā)性成分隨著酒齡的變化規(guī)律，揭示其陳化過(guò)程中的物理化學(xué)變化，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、線性判別分析法（linear discriminant analysis，LDA）以及聚類分析（cluster analysis，CA）等科學(xué)方法從不同角度對(duì)酒齡酒進(jìn)行分析鑒別，為產(chǎn)品的品質(zhì)評(píng)價(jià)以及市場(chǎng)監(jiān)督提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

不同酒齡醬香型白酒（JX1（酒齡4年，酒精度54%vol）；JX2（酒齡7年，酒精度53%vol）；JX3（酒齡10年，酒精度53%vol）；JX4（酒齡16年，酒精度52%vol）；JX5（酒齡18年，酒精度51%vol））：某白酒生產(chǎn)企業(yè)。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）：美國(guó)Aglient公司；PEN3便攜式電子鼻：德國(guó)Airsense公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

氣相色譜條件：毛細(xì)管柱，DB-Wax（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；程序升溫：50 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至120 ℃；再以8 ℃/min升至230 ℃，保持1 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：氦氣（He），流速：1 mL/min；溶劑延遲3 min；直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃；傳輸線溫度250 ℃。全掃模式，掃描質(zhì)量范圍45～500 amu。

1.3.2 進(jìn)樣方式

直接吸取1 μL的樣品進(jìn)行氣相色譜（GC）分析，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.3.3 電子鼻檢測(cè)分析

將樣品稀釋300倍后，準(zhǔn)確吸取1 mL至20 mL頂空瓶中。電子鼻測(cè)定其揮發(fā)性氣味，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。電子鼻運(yùn)行參數(shù)：測(cè)定時(shí)間120 s；沖洗時(shí)間60 s；進(jìn)樣準(zhǔn)備時(shí)間5 s；進(jìn)樣流速600 mm/min。

電子鼻傳感器性能如表1所示。

表1 電子鼻傳感器名稱及性能描述Table 1 Name and performance description of electronic nose sensor

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用電子鼻自帶軟件Winmuster軟件對(duì)電子鼻分析數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分和線性判別分析；未知化合物經(jīng)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）11.0 譜庫(kù)相匹配，只有當(dāng)匹配度均＞80（最大值為100）的鑒定結(jié)果才予以確認(rèn)，利用Origin18.0進(jìn)行分析。按峰面積歸一化法計(jì)算各物質(zhì)的相對(duì)含量。運(yùn)用SPSS 22.0對(duì)香氣成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酒齡樣品的GC-MS分析

由表2可知，5種不同酒齡醬酒共檢查出52種揮發(fā)性成分，主要包括酯類15種、醇類16種、酸類7種、酮類4種、呋喃類3種、烷烴類3種以及其他物質(zhì)4種。其中JX1檢測(cè)出43種揮發(fā)性成分，JX2中檢測(cè)出47種，JX3檢測(cè)出47種，JX4檢測(cè)出47種，JX5檢測(cè)出46種?？傮w而言，隨著酒齡的增加，多數(shù)揮發(fā)性成分種類呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。亞油酸乙酯為白酒中三大高級(jí)脂肪酸之一，為白酒空杯留香的主要成分[14]，對(duì)白酒的口感、風(fēng)味和穩(wěn)定性起到至關(guān)重要的作用。存儲(chǔ)液面比率大、日光、加熱以及酒精度等都能促進(jìn)亞油酸乙酯的分解作用[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，僅在JX5中檢出亞油酸乙酯，這可能是由于JX5酒精度稍低，導(dǎo)致亞油酸乙酯溶解度下降析出。針對(duì)5種酒齡醬香型酒的GC-MS初步分析結(jié)果表明，不同酒齡的酒樣，所含揮發(fā)性物質(zhì)種類以及含量存在一定差異。

表2 不同酒齡醬香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 2 Results of volatile substances in sauce-flavor Baijiu with different ages analyzed by GC-MS

續(xù)表

四甲基吡嗪是白酒中主要功能性成分之一，有研究表明，四甲基吡嗪需要通過(guò)微生物的代謝在酶的作用下產(chǎn)生前體物質(zhì)乙偶姻和氨，再進(jìn)一步縮合反應(yīng)而成，且制曲階段高溫能明顯強(qiáng)化乙偶姻與銨鹽縮合產(chǎn)生四甲基吡嗪。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著酒齡的增加，四甲基吡嗪的含量降低，但四甲基吡嗪的前體物質(zhì)乙偶姻含量增加[17-18]。這可能是由于隨著存儲(chǔ)時(shí)間的增加及氣候的變化，四甲基吡嗪又分解為乙偶姻與銨鹽等物質(zhì)。

為進(jìn)一步探究酒齡酒與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系，運(yùn)用SPSS22.0對(duì)五批醬香型酒齡酒揮發(fā)性成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸、戊酸、己酸、乙偶姻等揮發(fā)性成分與酒齡呈正比，而苯乙酸乙酯、2-甲基丙醇、2-甲基丁醇、呋喃、四甲基吡嗪等成分與酒齡呈負(fù)相關(guān)。

隨著酒齡的增加，酯類物質(zhì)含量總體呈上升趨勢(shì)，醇類物質(zhì)呈現(xiàn)波浪形變化趨勢(shì)，其中JX5醇類含量最少；酸類物質(zhì)總體呈上升趨勢(shì)，呋喃類成分則隨著酒齡的增加，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)?？赡苁窃陉愥勥^(guò)程中，空氣緩慢進(jìn)入陶壇，在陶壇表面發(fā)生接觸性催化氧化反應(yīng)，如醇類物質(zhì)被氧化成有機(jī)酸，導(dǎo)致醇香減少、酯香增加[19]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道：較高的氧初始濃度有利于提高陳釀過(guò)程中香氣化合物的濃度，也是導(dǎo)致就得陳年香氣更為明顯的一個(gè)原因[20]。

白酒的陳化是陳釀過(guò)程中新產(chǎn)生的所有香氣物質(zhì)和發(fā)生變化的原料香、曲香和發(fā)酵香的一種復(fù)合香[21]，綜上所述，陳化主要是酸酯平衡、風(fēng)味物質(zhì)相互作用、低沸點(diǎn)風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)以及貯存容器表面活性中心參與等綜合作用的結(jié)果。

2.2 不同酒齡樣品的聚類分析

從不同酒齡酒揮發(fā)性成分的聚類結(jié)果分析可知（如圖1所示），5種酒齡的醬香酒總體可分為兩大類，JX1、JX2、JX3、JX4為一類，JX5為一類，且隨著酒齡的增加醬香型白酒的香氣成分種類和含量都發(fā)生了變化，其中第一大類又分為2小類：（1）JX4，（2）JX1、JX2、JX3；這表明酒齡為4年、7年和10年的樣品相關(guān)性較大，在揮發(fā)性成分構(gòu)成及相對(duì)含量上更為接近，但與酒齡為16年、18年的樣品相關(guān)性就略小，說(shuō)明醬酒酒齡越接近，揮發(fā)性成分也就越接近，但在酒齡達(dá)到10年以上時(shí)，酒體中揮發(fā)性成分則出現(xiàn)較大的變化，呈現(xiàn)出典型特征。研究結(jié)果也表明聚類分析可以較好地對(duì)不同酒齡的醬香型白酒進(jìn)行分類。

圖1 不同酒齡醬香型白酒揮發(fā)性成分的聚類分析樹狀圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis of volatile components in sauce-flavor Baijiu with different ages

2.3 不同酒齡樣品的主成分分析

2.3.1 電子鼻PCA降維處理

5種不同酒齡的醬酒電子鼻PCA及LDA結(jié)果見圖2。由圖2A可知，第一主成分方差貢獻(xiàn)率為98.29%，第二主成分方差貢獻(xiàn)率為1.34%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率99.63%，說(shuō)明電子鼻對(duì)五個(gè)酒齡樣品揮發(fā)性成分的信息提取較為完整，而從相同酒齡的所有測(cè)定樣品點(diǎn)均落在相鄰的區(qū)域內(nèi)可知電子鼻檢測(cè)的區(qū)分度良好。同時(shí)，兩軸變化率大于99%，表示分析中無(wú)干擾成分，幾乎保留了所有原始信息，可進(jìn)行有效分析。五個(gè)酒齡樣品在PC2軸差異不大，在PC1軸能區(qū)分開來(lái)。從各批樣品橢圓的距離來(lái)看，JX1與JX2氣味接近，JX3與JX4 氣味接近，JX5自成一類?？梢姴煌瑑?chǔ)存酒齡醬酒其揮發(fā)性成分存在差異，且差異主要體現(xiàn)在第一主成分上，與主成分分析結(jié)果相似。

圖2 不同酒齡醬香型白酒揮發(fā)性成分主成分分析（A）及線性判別分析（B）Fig.2 Principal component analysis (A),linear discriminant analysis (B)of volatile components in sauce-flavor Baijiu with different ages

通過(guò)SPSS22.0對(duì)5個(gè)不同酒齡10個(gè)傳感器的響應(yīng)值進(jìn)行主成分分析，得出第一主成分和第二主成分的成分矩陣表，進(jìn)而求得兩個(gè)主成分的表達(dá)公式：

（其中ZS1表示S1傳感器響應(yīng)值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的結(jié)果，其他傳感器數(shù)值同樣經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理）

由第一表達(dá)式可知，傳感器W1C、W2W對(duì)第一主成分影響較大。結(jié)合表1各傳感器對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)可知五個(gè)酒齡酒樣品中的有機(jī)硫化合物以及芳香成分含量存在明顯差異。

2.3.2 電子鼻LDA降維處理

LDA線性判別分析是在PCA分析后進(jìn)行，對(duì)電子鼻傳感器所感應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)一步優(yōu)化處理，更好的將數(shù)據(jù)之間的差異性擴(kuò)大，進(jìn)而反映不同分析的差異情況，注重響應(yīng)值在空間的分布及距離分析[22-25]。如圖2B所示，判別式LD1和LD2的方差貢獻(xiàn)率分別為82.03%和14.75%，總方差貢獻(xiàn)率96.78%，較好的反應(yīng)了樣品的信息。5個(gè)酒齡的樣品沒(méi)有重疊，表明LDA可以對(duì)樣品進(jìn)行有效區(qū)分。由圖2B可知，不同酒齡的醬酒樣品間區(qū)分效果良好，通過(guò)第一主成分就能夠區(qū)分，且樣品點(diǎn)相對(duì)于PCA降維處理方式，區(qū)分效果更為顯著。

3 結(jié)論

本研究從酒樣揮發(fā)性香氣成分的層面研究了不同酒齡醬香型白酒的差異，通過(guò)電子鼻以及GC-MS快速分析了5種不同酒齡的醬香型白酒。結(jié)果顯示：GC-MS從5種不同酒齡的醬香型白酒中共檢測(cè)出52種揮發(fā)性成分，主要包括酯類15種，醇類16，酸類7種，酮類4種，呋喃類3種，烷烴類3種，其他類4種。五種酒齡醬香型酒中揮發(fā)性成分種類和含量存在差異，其中JX1檢測(cè)出43種，JX2中檢測(cè)出47種，JX3檢測(cè)出47種，JX4檢測(cè)出47種，JX5檢測(cè)出46種。同時(shí)對(duì)酒樣的電子鼻分析數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分（PCA）和線性判別分析（LDA），結(jié)果顯示：不同酒齡的樣品沒(méi)有重疊，表明LDA與PCA分析均可以對(duì)樣品進(jìn)行有效區(qū)分，但LDA數(shù)據(jù)降維分析方式相對(duì)于PCA分析方式，對(duì)不同酒齡樣品的區(qū)分效果更好。此外，研究初步證實(shí)對(duì)不同酒齡醬香型白酒揮發(fā)性成分種類的相對(duì)含量進(jìn)行聚類分析（CA），可以對(duì)不同酒齡醬香型白酒揮發(fā)性氣味進(jìn)行歸類。研究中發(fā)現(xiàn)且隨著酒齡則增加，酯類物質(zhì)含量呈先減少后增加趨勢(shì)，酸類物質(zhì)呈上升趨勢(shì)，呋喃類隨著酒齡的增加，上升趨勢(shì)明顯。

本課題采用電子鼻和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)5種不同酒齡的醬香型白酒的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究分析，該方法具有高效可靠、無(wú)毒無(wú)害、節(jié)省溶劑耗材等優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的效果較好，便于定量研究。為今后醬香酒酒齡鑒別方法和模型體系的建立打下研究基礎(chǔ)。