柳佳娜，張 賓，劉 宇，鄧尚貴，周小敏，姜 維*

（1.浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué) 創(chuàng)新應(yīng)用研究院，浙江 舟山 316022；3.浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司，浙江 舟山 316020）

生物胺是一類具有生物活性的含氮有機(jī)化合物的總稱，主要是氨基酸脫羧酶對(duì)游離氨基酸脫羧反應(yīng)的產(chǎn)物[1-2]。人體內(nèi)的微量生物胺具有重要的生理功能，但自身合成的量就能滿足需要，一般不需要外源攝入[3]。當(dāng)人體攝入少量生物胺，可通過體內(nèi)的胺氧化酶進(jìn)行降解，如果攝入量超過人體自身的降解能力，會(huì)導(dǎo)致臉紅、嘔吐、呼吸加快、支氣管痙攣、頭痛以及高血壓等中毒癥狀。對(duì)先天性生物胺解毒能力低，或因飲酒、服用藥物等導(dǎo)致暫時(shí)性缺失生物胺解毒能力的人群，攝入少量生物胺即產(chǎn)生中毒癥狀。

生物胺在食品中廣泛存在，常見的有組胺、酪胺、腐胺和尸胺等，已經(jīng)在酒類[4]、肉制品[5]、水產(chǎn)品[6]、乳制品[7]和調(diào)味品[8]中檢測到較高濃度的生物胺。減少食品中的生物胺主要有兩條途徑：抑制生物胺的產(chǎn)生和去除已產(chǎn)生的生物胺。目前，絕大部分研究集中在抑制生物胺的產(chǎn)生，生物胺的產(chǎn)生需要滿足三個(gè)條件：①游離氨基酸；②產(chǎn)氨基酸脫羧酶的微生物；③適宜微生物產(chǎn)氨基酸脫羧酶及氨基酸脫羧酶發(fā)揮作用的環(huán)境。采用輻照[9]、超高壓[10]、添加劑[11-12]和氣調(diào)包裝[13]等技術(shù)，可以有效抑制生物胺產(chǎn)生菌的生長或降低氨基酸脫羧酶的活性，從而減少生物胺的產(chǎn)生，但難以應(yīng)用到需要微生物的發(fā)酵類食品中。

生物胺性質(zhì)穩(wěn)定，去除已經(jīng)產(chǎn)生的生物胺是生物胺控制的難點(diǎn)。研究表明，采用胺氧化酶可以分解食品中的生物胺，但成本較高，短期內(nèi)難以產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用[14]。采用生物胺降解菌是去除食品尤其是發(fā)酵食品中生物胺的重要途徑之一，研究人員已經(jīng)分離出多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）[15-16]、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）[17]、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）[18]、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[19]等生物胺降解菌，但數(shù)量不多。不同生物胺降解菌的生長和生物胺降解特性差異較大，實(shí)際應(yīng)用中往往需要考量其與生產(chǎn)過程在溫度、酸堿度和鹽度等方面的匹配度，以及對(duì)食品風(fēng)味和品質(zhì)等方面的影響，以期挑選出符合要求的生物胺降解菌作為發(fā)酵劑。因此，有必要篩選高效降解生物胺的微生物，并明確其生長和生物胺降解特性，提高特定應(yīng)用場景中生物胺降解菌的選擇范圍。

本研究以不同發(fā)酵時(shí)期的魚露為原料，采用化學(xué)成分限定培養(yǎng)基（chemical defined medium，CDM）選擇性富集、分離和純化乳酸菌，通過高效液相色譜法篩選高效生物胺降解乳酸菌，確定降解菌株的分類學(xué)歸屬，并研究其生長和生物胺降解特性，以期為發(fā)酵食品中生物胺控制提供有應(yīng)用潛力的功能發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

不同發(fā)酵時(shí)期（0.5、1、3和6個(gè)月）的魚露：浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

標(biāo)準(zhǔn)品腐胺、尸胺、組胺、酪胺和衍生劑丹磺酰氯：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲醇（色譜純）：默克生命科學(xué)技術(shù)（南通）有限公司；API50CH和API 50CHL鑒定試劑條：梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；鹽酸、丙酮、硝酸銀等其他化學(xué)試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。除特殊說明外，所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

參考文獻(xiàn)[20]方法制備用于乳酸菌培養(yǎng)的CDM液體培養(yǎng)基，并使用4種生物胺代替硫酸銨，腐胺100 mg/L，尸胺100 mg/L，組胺100 mg/L，酪胺100 mg/L，固體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂。

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；JXDC-20氮吹儀：上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；H2050R高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DW-86L388超低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；CX41生物纖維鏡：奧林巴斯（中國）有限公司；UV2600紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；DH6000BⅡ電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特儀器有限公司；BSC-150恒溫恒濕箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：密理博（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物胺的測定

采用丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色譜法測定生物胺含量[21]。

1.3.2 生物胺降解乳酸菌的富集、分離與純化

1 g魚露樣品加入到20 mL的CDM液體培養(yǎng)基（NaCl含量3%）中，37 ℃條件下靜置富集培養(yǎng)48 h，稀釋100～104倍后取0.1 mL分別涂布于CDM瓊脂培養(yǎng)基（NaCl含量3%）平板，37 ℃下培養(yǎng)48 h，分離挑選單菌落，在CDM瓊脂培養(yǎng)基（NaCl含量3%）平板上4次劃線純化，對(duì)純化后微生物編號(hào)，添加20%甘油后保藏于-80 ℃冰箱中。

1.3.3 乳酸菌的生物胺降解能力評(píng)價(jià)

2%乳酸菌（V/V）接種于MRS肉湯培養(yǎng)基（NaCl含量3%）中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，4 ℃、8 000×g離心10 min收集菌體。0.05 mol/L pH=6.0磷酸鹽緩沖液（NaCl含量3%）洗滌兩次，將菌體重懸到含腐胺、尸胺、組胺和酪胺各100 mg/L的上述磷酸鹽緩沖液中，調(diào)整菌濃度為OD600nm值=0.8。取8 mL菌懸液加入到10 mL培養(yǎng)管中，37 ℃條件下靜置保持24 h。不添加菌體的含生物胺上述磷酸鹽緩沖液在同樣條件下保持24 h，作為對(duì)照組。測定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組上清液中的4種生物胺含量，生物胺降解率計(jì)算公式如下：

1.3.4 乳酸菌產(chǎn)生物胺能力評(píng)價(jià)

將2%乳酸菌（V/V）接種于MRS肉湯培養(yǎng)基（NaCl含量3%和鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸各300 mg/L）中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h。不接種乳酸菌的培養(yǎng)基在同樣條件下保持48 h，作為對(duì)照組。測定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的生物胺含量，乳酸菌產(chǎn)生物胺能力為實(shí)驗(yàn)組的生物胺含量減去對(duì)照組生物胺含量。經(jīng)過比較，選擇降解組胺、尸胺、腐胺和酪胺能力強(qiáng)且本身不產(chǎn)該4種生物胺的菌株，作為本研究的高效降解生物胺乳酸菌。

1.3.5 菌株FSCBAD033的鑒定

使用API50CH和API 50CHL檢測菌株對(duì)49種不同碳源的發(fā)酵能力。將菌株涂布接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基（NaCl含量3%）上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色。

分子生物學(xué)鑒定：委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提取菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），擴(kuò)增16SrRNA序列并進(jìn)行測序。測出的16SrRNA基因序列提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)。在EzBioCloud平臺(tái)上比較菌株與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列相似性[22]。選擇相似度高的屬內(nèi)和屬間序列，使用MEGA 11軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉法（bootstrap）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)（重復(fù)1 000次），確定菌株FSCBAD033的種屬關(guān)系。

1.3.6 菌株FSCBAD033生長曲線的繪制及環(huán)境因素對(duì)菌株生長的影響

接種環(huán)挑取少量斜面保存的菌株FSCBAD033于20 mL MRS肉湯培養(yǎng)基（NaCl含量3%）中，37 ℃下活化培養(yǎng)12 h。取活化好的種子液按照2%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基（NaCl含量3%）和含生物胺MRS肉湯培養(yǎng)基（NaCl含量3%和腐胺、尸胺、組胺、酪胺各100 mg/L），37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，間隔時(shí)間測定波長600 nm下的吸光度值作為生物量，繪制生長曲線。

參照上述步驟，在MRS肉湯培養(yǎng)基中：在初始pH值6.0和NaCl含量3%的條件下，依次考察溫度（5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、初始pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）、NaCl含量（0、1%、2%、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%、30%）對(duì)菌株FSCBAD033生長的影響。

1.3.7 菌株FSCBAD033去除生物胺作用方式分析

按照1.3.3的方法制備洗滌兩次后的菌體，將菌體重懸到0.05 mol/L pH=6.0的磷酸鹽緩沖液（NaCl含量3%）中，調(diào)整菌液濃度為OD600nm值=0.8，取部分菌懸液121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。向滅活和未滅活的菌懸液中分別加入四種混合生物胺，使各生物胺的終質(zhì)量濃度均為100 mg/L，37 ℃下保持24 h。不添加菌懸液的含生物胺磷酸鹽緩沖液在同樣條件下保持24 h，作為對(duì)照組。測定滅活菌實(shí)驗(yàn)組、未滅活菌實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組上清液中的生物胺含量，分析生物胺的脫除是物理吸附還是生物降解作用。生物胺脫除率計(jì)算公式如下：

1.3.8 菌株FSCBAD033對(duì)混合生物胺的降解動(dòng)力學(xué)研究

按照1.3.3的方法，在0.05 mol/L pH=6.0的磷酸鹽緩沖液（含3% NaCl和腐胺、尸胺、組胺、酪胺各100 mg/L），37 ℃條件下靜置保持24 h，不添加菌體的含生物胺上述磷酸鹽緩沖液在同樣條件下保持24 h作為對(duì)照組，間隔3 h取樣，測定生物胺降解率，繪制菌株對(duì)混合生物胺的降解動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.9 環(huán)境因素對(duì)菌株降解生物胺的影響

參考1.3.3的方法，在初始pH值6.0和NaCl含量3%的條件下，考察溫度（5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、初始pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）、NaCl含量（0、1%、2%、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%、30%）對(duì)菌株降解四種生物胺的影響。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel2019軟件處理數(shù)據(jù)，采用Origin 9.0軟件繪圖，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

通過選擇性富集、分離和純化，從魚露樣品中共分離到42株乳酸菌菌株（編號(hào)FSCBAD001～FSCBAD042），來源見表1。由表1可知，發(fā)酵時(shí)間長的魚露樣品中分離到的乳酸菌菌株相對(duì)更多。

表1 發(fā)酵魚露樣品中分離到的乳酸菌菌株Table 1 Lactic acid bacteria strains isolated from fish sauce samples

2.2 生物胺降解乳酸菌的篩選

采用含生物胺菌懸液培養(yǎng)法，評(píng)價(jià)了42株乳酸菌菌株的生物胺降解能力，結(jié)果見表2。其中，8株乳酸菌表現(xiàn)出對(duì)腐胺、尸胺、組胺和酪胺中一種或多種生物胺的降解活性，未檢測到其余34株乳酸菌對(duì)該4種生物胺的降解活性。有2株乳酸菌（FSCBAD006和FSCBAD033）對(duì)4種生物胺均有降解活性，且菌株FSCBAD033的活性明顯高于菌株FSCBAD006，降解了86.4%腐胺、78.5%尸胺、72.3%組胺和100%酪胺。其余6株乳酸菌可以降解2～3種生物胺，其中，菌株FSCBAD018降解89.4%尸胺，菌株FSCBAD022降解100%酪胺，F(xiàn)SCBAD038菌株降解80.6%腐胺和65.2%尸胺，這些菌株對(duì)特定生物胺表現(xiàn)出較好的降解活性。

表2 乳酸菌菌株降解生物胺能力的比較Table 2 Comparison of biogenic amines degradation ability by different lactic acid bacteria strains

采用含生物胺前體氨基酸培養(yǎng)基培養(yǎng)法，評(píng)價(jià)了8株生物胺降解乳酸菌的產(chǎn)生物胺能力，結(jié)果見表3。由表3可知，除菌株FSCBAD006和FSCBAD033外，其余6株乳酸菌均具備產(chǎn)生物胺的能力，不宜作為生物胺降解功能菌。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，具備降解特定生物胺的菌株均未觀察到產(chǎn)該生物胺的能力，與以往的研究報(bào)道相符，這也有可能是因?yàn)榫曜陨韺⒁呀?jīng)產(chǎn)生的生物胺再次降解[21，23-24]。

表3 生物胺降解乳酸菌菌株產(chǎn)生物胺能力的分析結(jié)果Table 3 Analysis results of the biogenic amines forming ability of biogenic amines degrading lactic acid bacteria strains

綜上，分離自發(fā)酵6個(gè)月魚露樣品中的菌株FSCBAD033，對(duì)食品中4種常見生物胺（腐胺、尸胺、組胺和酪胺）表現(xiàn)出高效的降解能力，且在含有前體氨基酸的培養(yǎng)基中不積累該4種生物胺，進(jìn)一步根據(jù)文獻(xiàn)[21]方法分析菌株FSCBAD033產(chǎn)色胺、苯乙胺、精胺和亞精胺的能力，發(fā)現(xiàn)其不產(chǎn)上述4種生物胺。因此，選擇菌株FSCBAD033為本研究的高效生物胺降解菌。

2.3 生物胺降解菌株FSCBAD033的鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)及生理生化試驗(yàn)

菌株FSCBAD033的菌落呈圓形乳白色、表面光滑、中間凸起，革蘭氏陽性，細(xì)胞呈短桿狀，API 50CH和API 50CHL分析結(jié)果表明，菌株FSCBAD033可以利用阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、核糖、蔗糖、海藻糖和木糖。

2.3.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將菌株FSCBAD033的16S rRNA基因序列提交至NCBI Genbank，獲得登錄號(hào)MW642087，在EzBioCloud平臺(tái)上分析菌株FSCBAD033的16S rRNA基因序列與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株相似度，發(fā)現(xiàn)與發(fā)酵檸檬乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）CECT 562T的相似度最高（99.80%）。選擇16S rRNA基因序列相似度較高的乳桿菌科（Lactobacillaceae）檸檬桿菌屬（Limosilactobacillus）菌株以及乳桿菌科其他兩個(gè)屬菌株的16S rRNA基因序列，與菌株FSCBAD033的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

圖1 基于16S rRNA基因序列菌株FSCBAD033的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain FSCBAD033 based on 16S rRNA gene sequences

由圖1可知，菌株FSCBAD033與L.fermentumCECT 562T聚為一支，并且明顯區(qū)別于其他菌株，從分子生物學(xué)上可將菌株FSCBAD033歸類為L.fermentum。2020年，原發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）被重新分類為發(fā)酵檸檬乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）[25-26]。因此，菌株FSCBAD033被鑒定為發(fā)酵檸檬乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）。

2.4 菌株FSCBAD033的生長特性研究

2.4.1 菌株FSCBAD033的生長曲線

菌株FSCBAD033在MRS培養(yǎng)基（含3%NaCl）和含生物胺MRS培養(yǎng)基（含3%NaCl和腐胺、尸胺、組胺和酪胺各100 mg/L）的生長曲線見圖2。

圖2 發(fā)酵檸檬乳桿菌FSCBAD033的生長曲線Fig.2 Growth curve of Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

由圖2可知，將菌株FSCBAD033按照2%（V/V）接種到不含生物胺的MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)，接種后4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，最大生物量（OD600nm值）為1.728。菌株FSCBAD033按照2%（V/V）接種到含有4種生物胺的MRS培養(yǎng)基中，接種后6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，18 h進(jìn)入穩(wěn)定期，最大生物量（OD600nm值）為1.624。因此，生物胺通過延長遲滯期和降低對(duì)數(shù)期生長速率的方式，一定程度上抑制了菌株FSCBAD033的生長，可能是因?yàn)樯锇窌?huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性，導(dǎo)致細(xì)胞的凋零或死亡[27-28]。

2.4.2 溫度對(duì)菌株FSCBAD033生長的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，菌株FSCBAD033的生物量呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)溫度為5 ℃、10 ℃、15 ℃和55 ℃時(shí)，菌株FSCBAD033基本不生長，菌株FSCBAD033在溫度25～40 ℃的范圍內(nèi)生物量較高（OD600nm值＞1），當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)獲得最高生物量（OD600nm值=1.815）。

圖3 溫度對(duì)發(fā)酵檸檬乳桿菌FSCBAD033生長的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.4.3 初始pH值對(duì)菌株FSCBAD033生長的影響

由圖4可知，隨著初始pH值的升高，菌株FSCBAD033的生物量呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)初始pH值為2和3時(shí)，菌株FSCBAD033基本不生長，菌株FSCBAD033在初始pH值4～8的范圍內(nèi)生物量較高（OD600nm值＞1），當(dāng)初始pH值為6時(shí)獲得最高生物量（OD600nm值=1.834）。

圖4 初始pH值對(duì)發(fā)酵檸檬乳桿菌FSCBAD033生長的影響Fig.4 Effect of initial pH value on the growth of Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.4.4 NaCl含量對(duì)菌株FSCBAD033生長的影響

由圖5可知，隨著NaCl含量的升高，菌株FSCBAD033的生物量呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)NaCl含量＞24%時(shí)，菌株FSCBAD033基本不生長，菌株FSCBAD033在NaCl含量0～15%的范圍內(nèi)生物量較高（OD600nm值＞1），低含量NaCl（＜3%）可以促進(jìn)菌株FSCBAD033的生長，當(dāng)NaCl含量為3%時(shí)獲得最高生物量（OD600nm值=1.892）。

圖5 NaCl含量對(duì)發(fā)酵檸檬乳桿菌FSCBAD033生長的影響Fig.5 Effect of NaCl content on the growth of Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.5 菌株FSCBAD033的生物胺降解特性研究

2.5.1 菌株FSCBAD033脫除生物胺的作用方式

由圖6可知，未滅活菌株FSCBAD033對(duì)4種生物胺的脫除能力較強(qiáng)（均＞65%），滅活菌株FSCBAD033對(duì)4種生物胺的脫除能力較弱（均＜5%），說明菌株FSCBAD033脫除4種生物胺主要通過生物降解的方式，物理吸附作用不明顯。

圖6 滅活和未滅活發(fā)酵檸檬乳桿菌FSCBAD033的生物胺脫除率比較Fig.6 Comparison of biogenic amines removal rates between inactivated and unactivated Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.5.2 菌株FSCBAD033對(duì)混合生物胺的降解動(dòng)力學(xué)研究

由圖7可知，菌株FSCBAD033對(duì)酪胺的降解能力最強(qiáng)，3 h降解52.4%酪胺，12 h降解100%酪胺；對(duì)其他3種生物胺也表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解能力，時(shí)間3～12 h范圍內(nèi)降解率：尸胺＞腐胺＞組胺，時(shí)間15～24 h范圍內(nèi)降解率：腐胺＞尸胺＞組胺，24 h腐胺、尸胺和組胺的降解率分別為83.1%、77.9%和67.8%。

圖7 發(fā)酵檸檬乳桿菌FSCBAD033對(duì)四種生物胺的降解動(dòng)力學(xué)曲線Fig.7 Degradation kinetics of 4 biogenic amines by Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.5.3 溫度對(duì)菌株FSCBAD033降解生物胺的影響

由圖8可知，菌株FSCBAD033對(duì)4種生物胺的降解率均隨溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，菌株FSCBAD033在溫度30～40℃的范圍內(nèi)對(duì)4種生物胺的降解率均超過50%，其中，酪胺降解率維持在100%，腐胺（85.7%）、尸胺（76.4%）和組胺（69.8%）最高降解率的溫度分別是35℃、37℃和37℃；當(dāng)溫度為5 ℃、10 ℃、50 ℃和55 ℃時(shí)，菌株FSCBAD033未表現(xiàn)出明顯的生物胺降解活性。生物體一般通過胺氧化酶或胺脫氫酶實(shí)現(xiàn)對(duì)生物胺的分解作用，溫度可對(duì)微生物產(chǎn)酶和酶活性產(chǎn)生較大的影響，從而影響生物胺的降解[29]。

圖8 溫度對(duì)發(fā)酵檸檬乳桿菌FSCBAD033降解四種生物胺的影響Fig.8 Effect of temperature on the degradation of 4 biogenic amines by Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.5.4 初始pH值對(duì)菌株FSCBAD033降解生物胺的影響

由圖9可知，菌株FSCBAD033對(duì)4種生物胺的降解率均隨初始pH值的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，菌株FSCBAD033在初始pH值5～7的范圍內(nèi)對(duì)4種生物胺的降解率均＞50%，其中，在初始pH值4～7的范圍內(nèi)可全部降解酪胺，腐胺（86.7%）、尸胺（82.4%）和組胺（78.4%）最高降解率的初始pH值分別是5、5和7；當(dāng)初始pH值為2時(shí)，菌株FSCBAD033對(duì)4種生物胺均未表現(xiàn)出明顯的降解活性。因此，菌株FSCBAD033在初始pH值5～7的范圍內(nèi)，能保持較好的生物胺降解活性。

圖9 初始pH值對(duì)發(fā)酵檸檬乳桿菌FSCBAD033降解四種生物胺的影響Fig.9 Effect of initial pH on the degradation of 4 biogenic amines by Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

2.5.5 NaCl含量對(duì)菌株FSCBAD033降解生物胺的影響

由圖10可知，菌株FSCBAD033對(duì)4種生物胺的降解率整體上隨NaCl含量的升高呈現(xiàn)先平穩(wěn)后下降的趨勢，菌株FSCBAD033在NaCl含量＜6%的范圍內(nèi)對(duì)4種生物胺的降解率均＞50%，其中，在NaCl含量不高于3%的范圍內(nèi)可全部降解酪胺，當(dāng)NaCl含量＞18%時(shí)，菌株FSCBAD033對(duì)4種生物胺的降解率均低于50%；當(dāng)NaCl含量＞24%時(shí)，菌株FSCBAD033對(duì)4種生物胺均未表現(xiàn)出明顯的降解活性。因此，菌株FSCBAD033在NaCl含量＜6%的范圍內(nèi)，能保持較好的生物胺降解活性。

圖10 NaCl含量對(duì)發(fā)酵檸檬乳桿菌FSCBAD033降解四種生物胺的影響Fig.10 Effect of NaCl content on the degradation of 4 biogenic amines by Limosilactobacillus fermentum FSCBAD033

3 結(jié)論

本研究從發(fā)酵3個(gè)月的魚露樣品中篩選到一株高效生物胺降解乳酸菌菌株FSCBAD033，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、碳源利用情況分析和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為發(fā)酵檸檬乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）。該菌株在0.05 mol/L pH=6.0的磷酸鹽緩沖液（含3%NaCl和腐胺、尸胺、組胺、酪胺各100 mg/L）中，37 ℃條件下靜置保持24 h后可降解86.4%腐胺、78.5%尸胺、72.3%組胺和100%酪胺，且在含有前體氨基酸的培養(yǎng)基中不積累上述4種生物胺。菌株FSCBAD033在溫度25～40 ℃、初始pH值4～8、NaCl含量1%～15%的范圍內(nèi)生長良好，在溫度30～40 ℃、初始pH值5～7、NaCl含量＜6%的范圍內(nèi)對(duì)腐胺、尸胺、組胺和酪胺的降解率均＞50%。本研究篩選到的高效生物胺降解菌菌株FSCBAD033，有潛力作為功能發(fā)酵劑用于降低食品中的生物胺含量，研究數(shù)據(jù)也為其應(yīng)用對(duì)象的選擇提供重要參考。