許春艷，楊春暉，鞠 巖，王 鵬，2，續(xù)丹丹，2，張 健，2，王文平*

（1.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；2.北京市食品釀造研究所有限責(zé)任公司，北京 100050）

黃豆渣是豆腐、豆?jié){、腐乳等豆制品加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，其營(yíng)養(yǎng)豐富，主要包括膳食纖維、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及礦物質(zhì)元素等，還含有異黃酮、皂苷等抗氧化活性成分，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、輔助糖尿病治療等保健功能[1-2]。但豆渣因顆粒大、口感粗糙，水分含量高、易腐爛、不易貯存等原因，長(zhǎng)期被人們忽視，多作為畜禽飼料或直接廢棄，造成極大的資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。

目前，豆渣主要用于豆渣飼料加工[3]、功能成分[4-5]提取、豆渣食品研制[6-9]、制曲[10]、培養(yǎng)基制作[11]等，也有很多發(fā)酵豆渣的研究[12-13]。申春莉等[14]采用靈芝菌絲體固態(tài)發(fā)酵豆渣后，總膳食纖維及脂肪含量下降，而可溶性蛋白、氨基酸態(tài)氮及多肽含量升高；GUPTA S等[15]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌發(fā)酵豆渣后，豆渣的營(yíng)養(yǎng)成分得到改善，抗氧化活性提高。

目前，對(duì)豆渣發(fā)酵產(chǎn)品多停留在前發(fā)酵階段或制曲階段，缺少對(duì)后發(fā)酵過(guò)程中豆渣醬各種營(yíng)養(yǎng)成分及風(fēng)味成分的研究[16-18]。本研究以豆渣為主要原料，采用米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951制曲后進(jìn)行發(fā)酵，制備黃豆渣醬，按照國(guó)標(biāo)方法對(duì)其感官、理化及微生物指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）、氨基酸自動(dòng)分析儀、超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分別對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味成分、游離氨基酸、異黃酮及酚類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并考察其對(duì)體外抗氧化活性，以期實(shí)現(xiàn)豆渣的高值化利用，減少資源浪費(fèi)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆渣：自制；小麥粉、食鹽：市售；米曲霉（Aspergillusoryzae）AS3.951（滬釀3.042）曲精：北京市食品釀造研究所；氯化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚（分析純）、碳酸鈉（分析純）、維生素C（vitamin C，VC）（分析純）、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：美國(guó)Sigma公司；黃酮及多酚單體標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國(guó)默克有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9051A電熱恒溫干燥箱、DHP-9051B微生物培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KJELTEC 2300凱氏定氮儀：美國(guó)FOSS公司；722型數(shù)顯可見分光光度計(jì)：上海光學(xué)儀器五廠有限公司；1290 infinity II-6470超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀、5975-7890A氣相色譜-質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent科技有限公司；5424高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf科技有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本日立科技有限公司；65 μm PDMS/DVB萃取頭：美國(guó)Supelco有限公司；DT-FXG發(fā)酵罐：浙江東鐵機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃豆渣醬加工工藝流程及操作要點(diǎn)[19]

操作要點(diǎn)：

黃豆渣、蒸煮：取生產(chǎn)腐乳后的殘余黃豆渣，在壓力0.1 MPa、溫度121 ℃條件下蒸煮40 min，保溫保壓2 h，獲得熟料。

冷卻、混勻：待黃豆渣熟料于冷卻槽中自然降溫至60 ℃時(shí)與小麥粉按質(zhì)量比3∶2混合均勻。

制曲：當(dāng)混合物料冷卻至35 ℃時(shí)，接種質(zhì)量比為0.07%的米曲霉AS3.951曲精，攪拌均勻后，在30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，每4～6 h翻曲一次，制得曲料；此時(shí)曲料呈黃綠色，表面有孢子。

發(fā)酵：在曲料中拌入20°Bé的鹽水（溫度50 ℃），鹽水與曲料質(zhì)量比為5∶3，攪拌均勻后放入發(fā)酵罐中，每個(gè)發(fā)酵罐中加入10 kg曲料，于42 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每天攪拌一次，發(fā)酵60 d。

滅菌、灌裝：發(fā)酵產(chǎn)物滅菌后灌裝即得黃豆渣醬成品。

1.3.2 黃豆渣醬基本指標(biāo)的測(cè)定

（1）感官指標(biāo)

按照GB 2718—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)釀造醬》對(duì)黃豆渣醬的色澤、滋味、氣味及狀態(tài)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

（2）理化指標(biāo)

水分含量：按照GB 5009—2016《食品中水分的測(cè)定》測(cè)定；銨鹽含量：按照GB 5009.234—2016《食品中銨鹽的測(cè)定》測(cè)定；氨基酸態(tài)氮含量：按照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》測(cè)定；總氮含量：按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》測(cè)定；總酸含量：按照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》測(cè)定；還原糖含量：按照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測(cè)定》測(cè)定；食鹽含量：按照GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測(cè)定》測(cè)定。

（3）微生物指標(biāo)

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌：按照GB 29921—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》測(cè)定；大腸菌群：按照GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》測(cè)定。

1.3.3 黃豆渣醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

樣品處理：準(zhǔn)確稱取4.0 g黃豆渣醬樣品于20 mL頂空瓶中，加入1.0 g氯化鈉調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，吸取內(nèi)標(biāo)物3-辛醇溶液（100 μg/mL）10 μL。用65 μm PDMS/DVB萃取頭對(duì)樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行富集提取。萃取溫度50 ℃，萃取時(shí)間40 min，振蕩速率200 r/min，振蕩時(shí)間40 min。萃取后于氣相色譜儀進(jìn)樣口解吸5 min，進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣（He），流速1.0 mL/min，采用不分流模式進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250 ℃。升溫程序：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至100 ℃，再以6 ℃/min的速度升至220 ℃并保持10 min。

MS條件：電離方式為電子離子（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃；掃描模式為全掃描，掃描范圍35～400 amu。

定性及定量方法：采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）08譜庫(kù)檢索進(jìn)行化合物組成的分析，保留匹配度＞750的化合物；采用半定量法定量。

1.3.4 黃豆渣醬游離氨基酸組成的測(cè)定

按照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》測(cè)定黃豆渣醬中游離氨基酸的含量。

1.3.5 黃豆渣醬活性成分分析

大豆異黃酮及酚類化合物含量的測(cè)定采用UPLC-MS/MS法[20]并進(jìn)行修改。液相色譜條件：色譜柱為Eclipse plusC18色譜柱（50 mm×3.0 mm，1.8 μm），柱溫40 ℃，流速0.4 mL/min。流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇，流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～1 min，90%A；1～6 min，90%～40%A；6～10 min，40%～10%A；10～12 min，10%A，12～14 min，90%A。進(jìn)樣量1.0 μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子（electron spray ionization，ESI）源，負(fù)離子模式，噴霧電壓3 000 V，輔助氣氣化溫度200 ℃，鞘氣流速11 mL/min，鞘氣溫度325 ℃。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間定性，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.6 抗氧化能力分析

DPPH、ABTS自由基清除能力的測(cè)定：參考張歡歡等[21]的方法。分別測(cè)定不同質(zhì)量濃度的黃豆渣醬對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率，并計(jì)算出黃豆渣醬清除DPPH和ABTS自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory concen tration，IC50）值。以抗壞血酸作為自由基清除能力當(dāng)量物質(zhì)，配制不同濃度的抗壞血酸溶液，分別以其濃度（x）和自由基清除率（y）為橫縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y（DPPH自由基清除率）=0.894 2x+1.605 5，R2=0.997；y（ABTS自由基清除率）=0.688 9x-0.321 3，R2=0.996），并計(jì)算DPPH和ABTS自由基清除能力，以μmol維生素C當(dāng)量（vitamin C equivalent，VCE）/g表示。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用OriginPro 8.5.1軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析；試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃豆渣醬的感官指標(biāo)

由表1可知，黃豆渣醬呈棕褐色，有光澤；味鮮醇厚，咸甜適口，無(wú)苦、焦糊及其他異味；有濃厚的醬香和酯香；無(wú)霉斑、無(wú)外來(lái)異物，其感官指標(biāo)符合GB 2718—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)釀造醬》要求。

表1 黃豆渣醬的感官指標(biāo)Table 1 Sensory indexes of soybean residue paste

2.2 黃豆渣醬的理化指標(biāo)

由表2可知，黃豆渣醬的氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到0.44g/100g，高于GB 2718—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)釀造醬》要求≥0.30 g/100 g，其他理化指標(biāo)均滿足國(guó)標(biāo)要求。

表2 黃豆渣醬理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of physical and chemical indexes of soybean residue paste

2.3 黃豆渣醬的微生物指標(biāo)

由表3可知，黃豆渣醬中大腸菌群＜10 CFU/g，致病菌沙門氏菌未檢出，金黃色葡萄球菌＜10 CFU/g，結(jié)果表明，黃豆渣醬微生物指標(biāo)滿足GB 29921—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》及GB 2718—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)釀造醬》要求。

表3 黃豆渣醬微生物指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of microbial indexes of soybean residue paste

2.4 黃豆渣醬中揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

采用GC-MS測(cè)定黃豆渣醬中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，揮發(fā)性成分種類及含量見表4。

表4 黃豆渣醬中揮發(fā)性風(fēng)味化合物GC-MS分析結(jié)果Table 4 Results of volatile flavor substances in soybean residue paste analyzed by GC-MS

續(xù)表

由表4可知，通過(guò)GC-MS分析，從黃豆渣醬中共鑒定出60種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，包括醇類（4種）、酸類（12種）、酯類（11種）、醛類（11種）、酮類（6種）、酚類（3種）和其他類（13種），其中，其他類含量（7 346.39 μg/100 g）最高，酸類物質(zhì)含量（2 234.93 μg/100 g）次之，酚類物質(zhì)含量（243.98 μg/100 g）最少。這些揮發(fā)性化合物互相融合，共同形成了黃豆渣醬味鮮醇厚，醬香和酯香濃厚的獨(dú)特風(fēng)味。

醇類物質(zhì)主要是在發(fā)酵過(guò)程中由微生物代謝、不飽和脂肪酸降解及羰基化合物的還原反應(yīng)生成的，具有芳香和植物香氣[22]。從黃豆渣醬中共檢出4種醇類物質(zhì)，包括正辛醇、苯乙醇、乙醇及苯甲醇。其中，正辛醇含量（500.00μg/100g）最高，苯乙醇含量（227.41 μg/100 g）次之，苯乙醇具有新鮮面包味和玫瑰花香[23]。

酸類物質(zhì)可能是由微生物產(chǎn)生的脂肪酶對(duì)大豆油脂降解所產(chǎn)生，低分子質(zhì)量脂肪酸也可能通過(guò)酵母或乳酸菌代謝生成[24]。從黃豆渣醬中共檢出12種酸類物質(zhì)，包括乙酸、3-甲基丁酸、甲基丙二酸、2-甲基丙酸等。除乙酸外，3-甲基丁酸含量（445.78 μg/100 g）最高，其具有辛辣味、酸味及尖刺的奶酪味[20，25]。

酯類物質(zhì)是由脂肪氧化產(chǎn)生的醇和游離脂肪酸相互作用形成的，主要呈水果香味。從黃豆渣醬中共檢測(cè)出11種酯類物質(zhì)，包括丁二酸單甲酯、十六烷酸乙酯、（E）-9-十八烯酸乙酯、9,12-十八烯酸乙酯、苯乙酸乙酯、3-羥基-2,3,4,5-四甲基-戊酸乙酯、乙酸乙烯酯等。其中，丁二酸單甲酯含量（173.19μg/100g）最高，其次為十六烷酸乙酯（103.92μg/100g）。

醛酮類化合物一般由氨基酸脫氨脫羧、酮酸脫羧、醇氧化等化學(xué)反應(yīng)生成。從黃豆渣醬中共檢出11種醛類和6種酮類，醛類物質(zhì)包括5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、5-甲基-2-糠醛、苯甲醛等，酮類物質(zhì)包括2-叔丁基-5-甲基[1，3]二氧戊環(huán)-4-酮、3-羥基-2-丁酮等。其中，糠醛呈甜香、杏仁香氣，對(duì)國(guó)內(nèi)醬的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[26]?？道賉27]也從黃豆醬中檢測(cè)出了3-羥基-2-丁酮。

酚類物質(zhì)主要是在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)曲霉的降解作用產(chǎn)生[28]。從黃豆渣醬中共檢出3種酚類物質(zhì)，含量為243.98μg/100g，包括4-乙基-2-甲氧基苯酚、苯酚及2-甲氧基酚。其中，4-乙基-2-甲氧基苯酚含量（129.52 μg/100 g）最高。

此外，黃豆渣醬中還檢出呋喃類、吡嗪類等其他物質(zhì)，吡嗪類化合物主要由微生物代謝或美拉德反應(yīng)生成，四甲基吡嗪能為黃豆渣醬提供烘烤可可和堅(jiān)果的香氣[29]。麥芽酚具有焦糖香氣，香氣濃郁[30]。

2.5 黃豆渣醬中游離氨基酸分析

有研究表明，豆渣經(jīng)微生物發(fā)酵后，很多性能均能得到很好的改善[31]。米曲霉發(fā)酵豆渣過(guò)程中能分泌蛋白酶，具有分解蛋白質(zhì)的性能，使發(fā)酵產(chǎn)品中富含氨基酸等多種易被人體吸收的成分[32]。因此，對(duì)黃豆渣醬中的游離氨基酸進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果見表5。

表5 黃豆渣醬中游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of free amino acids in soybean residue paste

由表5可知，從黃豆渣醬中共檢出18種游離氨基酸，總含量為1.403 g/100 g，其中包含7種必需氨基酸（essential amino acid，EAA），含量為0.593 g/100 g，EAA與總氨基酸（total essential amino acid，TAA）含量的比值為0.423，與非必需氨基酸（nonessential amino acid，NNEAA）含量的比值為0.732。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）在1973年提出的理想蛋白模式中EAA/TAA在0.40左右、EAA/NEAA在0.60以上的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較好[33]，說(shuō)明黃豆渣醬中的游離氨基酸含量豐富，蛋白質(zhì)達(dá)到理想蛋白質(zhì)的要求。18種游離氨基酸中包含2種鮮味氨基酸，6種甜味氨基酸，8種苦味氨基酸，1種酸味氨基酸及1種無(wú)味氨基酸，苦味氨基酸（0.538 g/100 g）＞甜味氨基酸（0.532 g/100 g）＞鮮味氨基酸（0.313 g/100 g）＞無(wú)味氨基酸（0.014 g/100 g）＞酸味氨基酸（0.006 g/100 g）。相對(duì)于谷類食品，黃豆渣醬中含有豐富的賴氨酸（0.062 g/100 g），是人體難以合成的，且是一般植物所缺少的，因此多吃黃豆渣食品，有助于彌補(bǔ)谷物中賴氨酸的不足；黃豆渣醬中的支鏈氨基酸（Leu、Ile、Val）含量較高，而芳香族氨基酸（Phe、Tyr）含量較低，恰與動(dòng)物蛋白的氨基酸組成互補(bǔ)。

2.6 黃豆渣醬抗氧化能力分析

2.6.1 黃豆渣中異黃酮及酚類物質(zhì)分析

由表6可知，從黃豆渣醬中檢測(cè)出9種異黃酮類物質(zhì)，包括大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、鳶尾黃酮苷、大豆苷元、染料木素、鳶尾黃素、鷹嘴豆芽素A及黃豆黃素，其中，染料木素含量最高，為4 655.363 g/100 g，其次為大豆苷元（3 857.448 g/100 g）。從黃豆渣醬中檢測(cè)出7種酚類物質(zhì)，包括原兒茶素、沒(méi)食子酸、表沒(méi)食子兒茶素、咖啡酸、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯及阿魏酸，其中，咖啡酸含量最高，為39.869 g/100 g，其次為原兒茶素（23.287 g/100 g）。結(jié)果表明，黃豆渣醬含有豐富的異黃酮及酚類等活性物質(zhì)。

表6 黃豆渣醬中異黃酮及酚類物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果Table 6 Determination results of isoflavones and polyphenol substances in soybean residue paste

2.6.2 抗氧化能力分析

由圖1可知，隨著黃豆渣醬質(zhì)量濃度的升高，ABTS自由基及DPPH自由基的清除率均呈先升高后趨于平緩的趨勢(shì)。黃豆渣醬清除ABTS自由基的IC50值為36.523 μmol VCE/g，清除DPPH自由基的IC50值為10.824 μmol VCE/g。說(shuō)明黃豆渣醬具有很好的抗氧化能力，分析原因可能與黃豆渣醬中含有豐富的異黃酮及酚類物質(zhì)有關(guān)[34]。

圖1 黃豆渣醬對(duì)ABTS（a）及DPPH自由基（b）的清除能力Fig.1 Scavenging capacity of soybean residue paste against ABTS (a)and DPPH free radical (b)

3 結(jié)論

以豆渣為主要原料，采用米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951制曲后發(fā)酵制備黃豆渣醬。黃豆渣醬的感官、理化及微生物指標(biāo)均符合相關(guān)國(guó)標(biāo)要求。采用GC-MS從黃豆渣醬中共檢測(cè)出60種揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括4種醇類、12種酸類、11種酯類、11種醛類、6種酮類、3種酚類和13種其他類物質(zhì)；采用氨基酸自動(dòng)分析儀從黃豆渣醬中共檢出18種游離氨基酸，總含量為1.403 g/100 g，其中7種EAA含量為0.593 g/100 g；黃豆渣醬中含有豐富的異黃酮、酚類物質(zhì)，具有較好的抗氧化能力，清除ABTS自由基的IC50值為36.523 μmolVCE/g，清除DPPH自由基的IC50值為10.824μmolVCE/g。該研究為實(shí)現(xiàn)豆渣的高值化利用奠定了基礎(chǔ)。