孟金明，劉秋鳴，熊思敏，郭慧芝，吳 娜*

（紅河學(xué)院 化學(xué)與資源工程學(xué)院，云南 蒙自 661100）

枇杷（Eriobotrya japonica）對(duì)于我國(guó)南方來(lái)說(shuō)是一種珍稀的特色果品，蒙自長(zhǎng)虹枇杷果實(shí)果肉鮮嫩多汁、甜中帶酸、風(fēng)味獨(dú)特，一直深受人們的歡迎[1-3]。梨和枇杷一樣屬于薔薇科，其中貢梨表皮金黃，果肉鮮嫩多汁，口感香脆，深受廣大消費(fèi)者喜歡[4-6]。果酒是以各種水果或果汁為原料，通過(guò)自然發(fā)酵或人工添加酵母菌釀造而成的低酒精度飲料酒，果酒不僅保留了水果中絕大部分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且水果經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生多種功能性成分，因而果酒具備較好的保健功能[7]。目前對(duì)于果酒發(fā)酵工藝的研究主要集中在葡萄酒等單一品種果酒，對(duì)于使用兩種及以上水果為原料釀造復(fù)合果酒的研究呈逐漸上升的趨勢(shì)[8-9]。目前，大部分對(duì)枇杷和貢梨的研究主要集中在保鮮、活性成分提取以及果脯類(lèi)食品的加工等方面，而對(duì)于將兩者釀制成果酒的研究鮮有報(bào)道[11-12]。枇杷和梨同屬于藥食同源的食物，在中醫(yī)中均具有生津健胃、潤(rùn)肺止咳之功效，因此將兩者釀制成復(fù)合果酒，不僅可以豐富果酒的品種，還能賦予果酒多種保健功效，復(fù)合消費(fèi)者對(duì)于健康飲食的需求。本研究以枇杷與貢梨為原料，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化枇杷-貢梨復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝，釀造出綠色營(yíng)養(yǎng)滿(mǎn)足廣大消費(fèi)者需求的復(fù)合果酒，不僅可以解決水果資源因不易貯藏和保鮮造成的浪費(fèi)問(wèn)題，而且可以豐富市場(chǎng)上果酒的種類(lèi)，滿(mǎn)足人們對(duì)復(fù)合果酒的不同消費(fèi)需求；還可以對(duì)枇杷和貢梨的深加工產(chǎn)業(yè)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷：蒙自長(zhǎng)虹星；貢梨：市售。纖維素酶（80 000 U/g）、果膠酶（80 000 U/g）、焦亞硫酸鉀、檸檬酸：友誼食品添加劑公司；果酒酵母：安琪酵母有限公司；甲醇、乙醇（均為色譜純）：天津化學(xué)試劑三廠(chǎng)；維生素C、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、硫酸、酚酞（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水均使用蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010型氣相色譜儀：日本島津有限責(zé)任公司；GSP-9160MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；CP224C型電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海雷磁-上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；手持糖度計(jì)LB90A：廣州市銘睿電子科技有限公司；JYLY15型九陽(yáng)高速破壁調(diào)理機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枇杷-貢梨復(fù)合果酒加工工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

預(yù)處理：挑選無(wú)機(jī)械破損、成熟的新鮮長(zhǎng)虹枇杷果實(shí)，洗凈，在95 ℃的沸水中熱燙20～30 s后放入冷水冷卻，去除果皮、果核、白膜，將果肉放入含有0.05%維生素C和0.15%檸檬酸的護(hù)色液中浸泡10 min，取出放入榨汁機(jī)中破碎打漿；選擇無(wú)蟲(chóng)害、成熟度的貢梨，洗凈，去除果皮和果核，切成小塊，放入護(hù)色液中浸泡10 min，取出放入榨汁機(jī)中，加入0.1%的維生素C破碎打漿。

酶解：將枇杷汁和貢梨汁按一定比例混合，按0.1 g/L的用量分別加入纖維素酶和果膠酶，50 ℃恒溫水浴攪拌3 h，酶解后迅速加熱至90 ℃滅酶5 min，冷卻備用。

調(diào)配：添加適量偏重亞硫酸鉀，用白砂糖調(diào)節(jié)果汁糖度，用檸檬酸調(diào)節(jié)果汁的pH。

酵母活化：稱(chēng)取1g的活性干酵母于燒杯中，再加入10mL 2%的葡萄糖溶液，在37 ℃條件下活化30～40 min。

過(guò)濾、澄清：發(fā)酵結(jié)束后，用過(guò)濾袋分離果酒和果渣，即得枇杷-貢梨復(fù)合果酒。

1.3.3 枇杷-貢梨復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

枇杷汁和貢梨汁體積比的確定：將破碎打漿后的枇杷汁和貢梨汁分別按1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1的體積比進(jìn)行混合，調(diào)整初始糖度240 g/L、初始pH4.0、酵母接種量為0.10%、SO2添加量為40 mg/L，置于20 ℃的條件下發(fā)酵，以感官評(píng)分和酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并考察枇杷汁和貢梨汁體積比對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵的影響。

初始pH值的確定：枇杷汁與貢梨汁的體積比為1∶2，加入40 mg/L的SO2（焦亞硫酸鉀），初始pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，接入0.1%的酵母，在22 ℃的條件下發(fā)酵7 d，測(cè)定果酒的酒精度及殘?zhí)橇?，并考察初始pH值對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵的影響。

酵母添加量的確定：枇杷汁與貢梨汁的體積比為1∶2，加入40 mg/L的SO2，初始pH值為4.5，分別接入0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%的活化酵母，在22 ℃的條件下發(fā)酵7 d，測(cè)定果酒的酒精度及殘?zhí)橇?，并考察酵母添加量?duì)復(fù)合果酒發(fā)酵的影響。

發(fā)酵溫度的確定：枇杷汁與貢梨汁的體積比為1∶2，加入40 mg/L的SO2，初始pH值為4.5，接入0.2%的酵母、分別置于20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃和28 ℃的條件下發(fā)酵7 d，測(cè)定果酒的酒精度及殘?zhí)橇?，并分析發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵的影響。

SO2添加量的確定：枇杷汁與貢梨汁的體積比為1∶2，加入0、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L和100 mg/L的SO2，初始pH值為4.5，接入0.2%的酵母、在22 ℃的條件下發(fā)酵7 d，測(cè)定果酒的酒精度及殘?zhí)橇?，并考察SO2添加量對(duì)復(fù)合果酒發(fā)酵的影響。

1.3.4 枇杷-貢梨復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，從中選擇初始pH值（A）、酵母添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）和SO2添加量（D）4個(gè)因素為自變量，以酒精度（Y）作為響應(yīng)值，采用4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析法，對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[13]。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design

1.3.5 理化指標(biāo)測(cè)定

酒精度測(cè)定：采用密度瓶法；總糖測(cè)定：采用直接滴定法[14]。

1.3.6 感官指標(biāo)測(cè)定

枇杷-貢梨復(fù)合果酒感官評(píng)價(jià)參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，請(qǐng)經(jīng)果酒感官培訓(xùn)的10 位人員，對(duì)果酒色澤、透明度、香氣、滋味和典型性5 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，取平均值作為最終感官得分[15]。

表2 枇杷-貢梨復(fù)合果酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of loquat-pear compound fruit wine

續(xù)表

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步處理及作圖，用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，認(rèn)為P＜0.05時(shí)差異顯著，試驗(yàn)結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷-貢梨復(fù)合果酒單因素試驗(yàn)

2.1.1 果汁混合比例的確定

由圖1可知，枇杷汁與貢梨汁的不同體積比對(duì)復(fù)合果酒的感官品質(zhì)影響較大，枇杷經(jīng)榨汁所得枇杷汁相比于梨汁而言較濃稠，當(dāng)枇杷汁比例過(guò)高時(shí)酒體顏色加深，澄清度有所下降，造成果酒感官品質(zhì)的下降；而當(dāng)梨汁含量較高時(shí)果酒顏色較淺，酒體果香不夠突出。枇杷汁與貢梨汁體積比為1∶2時(shí)，果酒的感官評(píng)分是最高的，達(dá)到81.33分，復(fù)合果酒顏色為淡黃色，口感較為柔和，同時(shí)含有兩種水果的風(fēng)味，枇杷香氣特征突出。不同的枇杷汁與貢梨汁體積比對(duì)酒精度的影響不大，酒精度基本處于12%vol～12.5%vol范圍內(nèi)且組間差異不顯著（P＞0.05）；果酒的酒精度主要與初始糖度相關(guān)，雖然發(fā)酵的果汁比例不同但是發(fā)酵初始糖度一致，所以所得果酒的酒精度變化不大。因此，選擇枇杷汁與貢梨汁的最佳體積比為1∶2。

圖1 不同枇杷汁與貢梨汁的體積比對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of different volume ratio of loquat juice and pear juice on the quality of loquat-pear compound fruit wine

2.1.2 不同初始pH對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒發(fā)酵的影響

由圖2可知，隨著發(fā)酵液初始pH值的升高，復(fù)合果酒酒精度呈先上升后下降的趨勢(shì)，殘?zhí)橇恐饾u降低。當(dāng)發(fā)酵液初始pH值＜4.0時(shí)，發(fā)酵環(huán)境酸性較高，不利于酵母菌的生長(zhǎng)，影響發(fā)酵速率，所得果酒的酒精度偏低，酒精度在10.39%vol～11.95%vol之間；當(dāng)發(fā)酵液的初始pH值為4.5時(shí)，有利于酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，果酒發(fā)酵更充分，復(fù)合果酒的酒精度達(dá)到最高值12.50%vol，發(fā)酵液殘?zhí)橇拷档阶畹?.45 g/L；當(dāng)發(fā)酵液的初始pH值＞4.5時(shí)，其他微生物的生長(zhǎng)和繁殖增多，進(jìn)而消耗較多的可發(fā)酵性糖，雜菌的生長(zhǎng)繁殖還會(huì)影響酵母的繁殖和酒精代謝，這時(shí)復(fù)合果酒的酒精度較低，發(fā)酵液殘?zhí)橇柯杂猩遊16-17]。初始pH值為4.5、4.0、5.0的酒精度組間存在顯著性差異（P＜0.05）。因此，選擇發(fā)酵液初始pH值為4.5。

圖2 不同初始pH值對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒的影響Fig.2 Effect of different initial pH on the quality of loquat-pear compound fruit wine

2.1.3 不同酵母添加量對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒發(fā)酵的影響

由圖3可知，隨著酵母添加量的增加，復(fù)合果酒的酒精度呈先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵液的殘?zhí)橇坎粩嘟档汀．?dāng)酵母添加量在0.05%～0.20%時(shí)，初始酵母數(shù)量較低會(huì)導(dǎo)致酒精發(fā)酵階段酵母數(shù)量不足，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵時(shí)間結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液還殘留較多的可發(fā)酵性糖，進(jìn)而所得復(fù)合果酒的酒精度偏低；當(dāng)酵母的添加量為0.2%時(shí)，初始酵母數(shù)量較高，在酒精發(fā)酵階段酵母菌的數(shù)量充足，果酒發(fā)酵充分，可發(fā)酵性糖的消耗激增，所得復(fù)合果酒的酒精度達(dá)到最高值12.5%vol；當(dāng)初始酵母添加量＞0.2%之后，因?yàn)榻湍傅拇罅可L(zhǎng)繁殖，會(huì)有較多的糖類(lèi)用于酵母的生長(zhǎng)和繁殖，進(jìn)而用于酒精代謝的糖類(lèi)偏少，使得所得復(fù)合果酒的酒精度偏低[18]。酵母添加量為0.20%與0.10%、0.30%的酒精度組間存在顯著性差異（P＜0.05）。因此，最優(yōu)的酵母添加量為0.20%。

圖3 不同酵母添加量對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different yeast inoculum on the quality of loquat-pear compound fruit wine

2.1.4 不同發(fā)酵溫度對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒發(fā)酵的影響

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在20～22 ℃時(shí)，復(fù)合果酒的酒精度偏低而發(fā)酵液殘?zhí)呛孔罡撸驗(yàn)檩^低的發(fā)酵溫度不利于酵母菌的生長(zhǎng)和繁殖，酵母的代謝速率隨之減緩，發(fā)酵時(shí)間隨之延長(zhǎng)，復(fù)合果酒的酒精度偏低；當(dāng)發(fā)酵溫度為22 ℃時(shí)，酵母的生長(zhǎng)和繁殖速率最有利酒精的合成，果酒發(fā)酵充分，此時(shí)復(fù)合果酒酒精度最高12.39%vol，發(fā)酵液殘?zhí)橇孔畹?.26 g/L；當(dāng)發(fā)酵溫度高于26 ℃之后，酵母菌的生長(zhǎng)繁殖速度加快，衰老和死亡速率隨之提高，較高的發(fā)酵溫度有利于其他微生物的生長(zhǎng)和繁殖，酵母的酒精代謝會(huì)受到抑制，因此復(fù)合果酒的酒精度低隨之降低[19-20]。發(fā)酵溫度為22 ℃與發(fā)酵溫度為20 ℃、24 ℃的酒精度組間具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，最適的發(fā)酵溫度為22 ℃。

圖4 不同發(fā)酵溫度對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperature on the quality of loquat-pear compound fruit wine

2.1.5 不同SO2添加量對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒發(fā)酵的影響

由圖5可知，復(fù)合果酒的酒精度隨SO2添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵液殘?zhí)呛坎粩嗌?。?dāng)SO2的添加量＜60 mg/L之前，發(fā)酵液中其他微生物的生長(zhǎng)不能被徹底抑制，其生長(zhǎng)和繁殖不僅會(huì)消耗較多的糖還會(huì)影響酵母的生長(zhǎng)和代謝，導(dǎo)致酒精度的積累量偏低；當(dāng)SO2添加量為60 mg/L時(shí)，酒精度達(dá)到最高值，為12.53%vol；當(dāng)SO2添加量＞60 mg/L之后，對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生抑制作用，復(fù)合果酒的酒精度隨之降低，而殘?zhí)橇縿t隨之增加[21]。SO2添加量為60 mg/L的酒精度與其他處理組均具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，SO2的最佳添加量為60 mg/L。

圖5 不同SO2添加量對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of different SO2 addition on the quality of loquat-pear compound fruit wine

2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)優(yōu)化與結(jié)果分析[22]

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，固定枇杷汁與貢梨汁最佳體積比為1∶2，選擇初始pH值（A）、酵母添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）和SO2添加量（D）四個(gè)因素為自變量，以酒精度（Y）作為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3中得到的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線(xiàn)性回歸擬合，可以初步得到枇杷-貢梨復(fù)合果酒的酒精度（Y）對(duì)應(yīng)發(fā)酵工藝條件中初始pH值（A）、發(fā)酵溫度（B）、酵母添加量（C）和SO2添加量（D）的回歸方程模型為Y=12.81+0.22A+0.023B+0.071C+0.046D+0.14AB-0.067AC+0.11AD-0.27BC+0.15BD-0.15CD-0.96A2-0.68B2-0.66C2-0.47D2。

由表4可知，該模型P值＜0.000 1，差異極顯著；失擬項(xiàng)的P值為0.786 0＞0.05，所以差異不顯著，可得出試驗(yàn)所得的模型擬合性較好[23-24]。從模型中各個(gè)影響因素的決定系數(shù)R2=0.978 3，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.974 4，對(duì)于實(shí)際試驗(yàn)中的響應(yīng)值，該模型能夠做出98.72%的解釋?zhuān)虼吮灸Ｐ瓦m用于分析和預(yù)測(cè)枇杷-貢梨復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝條件。一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AB、AD對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)系數(shù)的P值均＜0.001，模型的曲面效應(yīng)極顯著；交互項(xiàng)BC、BD、CD對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。通過(guò)比較F值的大小可以得出，對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒酒精度產(chǎn)生影響順序?yàn)槌跏紁H值（A）＞酵母添加量（C）＞SO2添加量（D）＞發(fā)酵溫度（B）。

2.2.1 交互作用分析

從響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)的變化趨勢(shì)可以反映出各個(gè)因素之間的交互作用對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒的酒精度的影響情況。曲面坡度大小來(lái)表示各因素對(duì)酒精度（響應(yīng)值）的影響程度，曲面坡度越陡峭表示各因素的交互作用對(duì)酒精度的影響程度越大，曲面坡度越平緩則影響程度越小[25-26]。

由圖6可知，初始pH值和發(fā)酵溫度交互形成的曲面的坡度較大，說(shuō)明其對(duì)酒精度的影響較大，但等高線(xiàn)圖近似橢圓形說(shuō)明交互作用較顯著；初始pH值和酵母添加量、初始pH值和SO2添加量?jī)蓛山换バ纬傻那娴钠露容^大，說(shuō)明其兩兩對(duì)酒精度的影響較大，但是等高線(xiàn)圖近似圓形說(shuō)明兩兩交互作用不顯著；發(fā)酵溫度和酵母添加量、發(fā)酵溫度和SO2添加量、酵母添加量和SO2添加量因素對(duì)酒精度的影響較大且交互作用極顯著。

圖6 初始pH值、二氧化硫添加量、酵母添加量和發(fā)酵溫度交互作用對(duì)復(fù)合果酒酒精度影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial pH value,SO2 addition,yeast inoculum and fermentation temperature on the alcohol content of compound wine

2.2.2 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)與檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)該模型優(yōu)化求解得出枇杷-梨復(fù)合果酒發(fā)酵工藝的最佳參數(shù)為：初始pH值為4.56，發(fā)酵溫度為22.06 ℃，酵母添加量為0.2%，SO2添加量為61.23 mg/L；模型預(yù)測(cè)酒精度為12.83%vol。為了便于實(shí)際操作，將枇杷-貢梨復(fù)合果酒的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件修改為枇杷汁與貢梨汁的體積比為1∶2，SO2的添加量為61 mg/L，發(fā)酵溫度為22 ℃，初始pH值為4.6，酵母添加量為0.2%。在此最佳條件下，復(fù)合果酒的酒精度為12.67%vol，表明實(shí)際值與理論值相差較小，用此模型進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)模型具有可靠性。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對(duì)枇杷-貢梨復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中主要發(fā)酵條件的分析，得出對(duì)復(fù)合果酒影響最大的是酵母添加量，其次是初始pH值和發(fā)酵溫度，而SO2添加量的影響最??；枇杷-貢梨復(fù)合果酒的最佳發(fā)酵工藝條件為：枇杷汁與貢梨汁的體積比1∶2，SO2添加量61 mg/L，發(fā)酵溫度22 ℃，初始pH值4.6，酵母添加量0.2%。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，復(fù)合果酒的酒精度為12.67%vol，酒體呈淡黃色、澄清透明、果香濃郁、口感醇厚。枇杷-貢梨復(fù)合果酒的研制不僅為枇杷和貢梨的深加工藝提供理論依據(jù)，還可以豐富果酒市場(chǎng)，推動(dòng)果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。