李 杰，許 彬，羅建成，李慧星，于海彥，趙怡夢

（1.南陽理工學院 張仲景國醫(yī)國藥學院，河南 南陽 473004；2.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004）

紅小米為南陽盆地特產(chǎn)，因谷殼呈紅色，本地俗稱紅谷，學名為“粟”，也稱作粱、粟米，為禾本科一年生草本植物“粟”加工去皮后的成品。紅小米與糯米、黍米等農作物相比，其淀粉含量較低，蛋白質、脂肪和維生素含量較高，且富含人體必需的8種氨基酸，比例協(xié)調，具有較高的營養(yǎng)價值。紅小米不僅可供食用，也可入藥，起到清熱、止渴，滋陰，補脾腎，健腸胃等功效。隨著“健康中國2030”規(guī)劃綱要的實施，具有養(yǎng)生及保健作用的小米黃酒已成為研究熱點之一，如李安等[1]采用單因素試驗及響應面分析試驗，對小米黃酒的發(fā)酵工藝進行了研究；石黎琳等[2]利用頂空固相微萃取技術，結合氣相色譜-質譜聯(lián)用檢測技術研究了不同品種小米對黃酒風味的影響。

黃酒是世界上最古老的酒類之一，在我國已有3 000余年的歷史，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒[3-4]。黃酒營養(yǎng)成分豐富，被譽為“液體蛋糕”，富含氨基酸、活性多肽、功能性低聚糖、有機酸、多種維生素及微量元素等[5-8]，具有降血壓、降膽固醇、抗氧化、抗衰老和提高免疫力等生理功能[9-12]。

該研究以南陽盆地特色農作物紅小米為主要原料釀制紅小米黃酒，采用單因素試驗與Box-Behnken試驗相結合的方法，以酒精度為評價指標，對前發(fā)酵工藝進行優(yōu)化；在此基礎上，以黃酒國家質量標準為依據(jù)，以感官評分為評價指標，采用均勻設計試驗對后發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，并對釀制的紅小米黃酒進行體外抗氧化活性評價，以期為紅小米黃酒釀造的工程化實踐操作提供有價值的參考，為進一步研究紅小米黃酒抗氧化作用的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅小米：南陽市鎮(zhèn)平縣；紹酒風味T3釀酒曲（根霉菌、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、釀酒酵母）：安琪酵母股份有限公司；麥曲：山東梁山徐曙生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）：上海北諾生物科技有限公司；硫酸亞鐵、抗壞血酸、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、鹽酸、雙氧水、磷酸等（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BS110S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、752N紫外-可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；HHS-6電熱恒溫水浴鍋：上海躍進醫(yī)療器械廠；XH-A旋渦混合器：無錫杰瑞安儀器設備有限公司；TDL-40B臺式高速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紅小米黃酒釀造工藝流程及操作要點

采用攤飯法釀造紅小米黃酒，具體工藝流程如下：

浸米→蒸煮→攤涼→拌曲（釀酒曲、麥曲）→裝罐→前發(fā)酵及開耙→后發(fā)酵→過濾→煎酒（滅菌）→裝壇→陳釀→成品

操作要點：

稱取經(jīng)預處理的紅小米適量，置于不銹鋼鍋內，加自來水浸泡，水面超過米層3 cm左右，室溫下浸泡24 h，早晚各換水1次，瀝干水分，蒸煮2 h，攤涼冷卻至35 ℃；按比例加入粉碎后的麥曲、釀酒曲，拌合均勻；裝入已滅菌的玻璃發(fā)酵罐，加適量煮沸后冷卻至室溫的蒸餾水，攪拌均勻，封口，進行前發(fā)酵；醪液品溫升至37 ℃，開頭耙，頭耙后，間隔4～5 h開耙1次，開耙4次后，每日搗耙2次；前發(fā)酵結束后，密封罐口，進行后發(fā)酵；后發(fā)酵結束，使用濾布對醪液進行粗濾，濾液再用砂芯漏斗進行精濾，所得澄清酒液煮沸后，趁熱裝入已滅菌陶壇內，密閉陳釀，得到紅小米黃酒。

1.3.2 紅小米黃酒釀造前發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

選擇麥曲接種量（5.5%、7.0%、8.5%、10.0%、11.5%、13.0%）、釀酒曲接種量（0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%）、前發(fā)酵溫度（19.0 ℃、22.0 ℃、25.0 ℃、28.0 ℃、31.0 ℃、34.0 ℃）、前發(fā)酵時間（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d）作為考查因素，選擇料液比1∶1.3（g∶mL）進行前發(fā)酵，釀造紅小米黃酒。單因素試驗時，每次固定其中3個因素，考查其他因素對紅小米黃酒醪液酒精度的影響。

（2）Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇麥曲用量（X1）、釀酒曲用量（X2）、前發(fā)酵溫度（X3）、前發(fā)酵時間（X4）為自變量，以醪液酒精度（Y）為響應值，進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設計[13-14]，具體因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 紅小米黃酒釀造后發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻設計試驗

在前發(fā)酵基礎上，選擇后發(fā)酵溫度X5（9.0 ℃、12.0 ℃、15.0 ℃、18.0 ℃、21.0 ℃、24.0 ℃）、后發(fā)酵時間X6（25 d、35 d、45 d、55 d、65 d、75 d）為考察因素，進行均勻設計試驗[15-16]，具體因素與水平見表2。根據(jù)均勻設計試驗因素水平，按不同后發(fā)酵條件組合進行后發(fā)酵試驗，以感官鑒評得分為指標，確定較優(yōu)后發(fā)酵工藝條件。

表2 均勻設計試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of uniform design experiments

1.3.4 指標測定方法

（1）紅小米黃酒前發(fā)酵階段酒精含量測定

食品安全國家標準GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》。

（2）紅小米黃酒后發(fā)酵階段感官鑒評方法

從南陽本地多家黃酒生產(chǎn)企業(yè)，邀請10位從事黃酒生產(chǎn)15年以上的專家，根據(jù)GB/T 13662—2018《黃酒》國家標準，從外觀（15分）、香氣（25分）、口味（40分）、風格（20分）等方面對后發(fā)酵結束經(jīng)壓榨、澄清處理的紅小米黃酒原酒樣液，進行感官鑒評打分，滿分100分，感官鑒評標準見表3。

表3 紅小米黃酒感官鑒評標準Table 3 Sensory evaluation standards of red-millet Huangjiu

續(xù)表

1.3.5 紅小米黃酒體外抗氧化活性評價方法（1）清除DPPH·活性測定

采用文獻[17-18]的方法稍微修改，分別向10支具塞刻度試管中加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL待測黃酒樣液，加蒸餾水補至2.0 mL，加入2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，振蕩均勻，常溫條件下避光靜置20 min，作為待測樣品；用等體積的無水乙醇代替DPPH溶液作為對照組；用等體積的蒸餾水代替黃酒樣液作為空白組；用等體積同濃度維生素C（vitamin C，VC）溶液作為陽性對照；以無水乙醇調零，分別在517 nm波長下測定待測樣品、對照組、空白組及陽性對照組的吸光度值，通過下式計算黃酒樣液及與黃酒樣液等體積同濃度VC溶液對DPPH·的清除率，計算黃酒樣液、VC溶液的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。

（2）清除·OH活性測定

采用文獻[19-20]的方法稍微修改，分別向10支具塞刻度試管中加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL待測黃酒樣液，加蒸餾水補至2.0 mL，加入6.0 mmol/L 的FeSO4溶液、6.0 mmol/L的水楊酸乙醇溶液各2.0 mL，再加入8.8 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL，振蕩均勻，37 ℃水浴下反應20 min，作為待測樣品；用等體積的蒸餾水替代H2O2溶液作為對照組；用等體積的蒸餾水代替黃酒樣液作為空白組；用等體積同濃度VC溶液作為陽性對照；以蒸餾水調零，分別在波長510 nm處測定待測樣品、對照組、空白組及陽性對照組的吸光度值，通過下式計算黃酒樣液及與黃酒樣液等體積同濃度VC溶液對·OH的清除率，計算黃酒樣液、VC溶液的IC50值。

（3）還原力測定

采用文獻[21-22]的方法稍微修改，分別向5支具塞刻度試管中加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的待測黃酒樣液，加蒸餾水補至1.0 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L的H3PO4緩沖液（pH6.6）、2.5 mL 30.0 mmol/L的K3[Fe（CN）6]溶液，漩渦振蕩器混勻；50 ℃水浴條件下反應20 min，迅速冷卻，加入2.5 mL 0.6 mol/L的C2HCl3O2溶液，高速臺式離心機4 500 r/min離心5 min。取離心后上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水及0.5 mL 6 mmol/L的FeCl3溶液，波長700 nm下測吸光度值。用等體積同濃度VC溶液代替黃酒樣液作為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 紅小米黃酒釀造前發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗結果及分析

（1）麥曲用量對醪液酒精度的影響

由圖1可知，麥曲用量為5.5%～10%時，隨著麥曲用量增加，醪液中糖化酶量逐漸增多，紅小米所含淀粉水解程度增大，為釀酒曲中的微生物菌群（根霉菌、釀酒酵母）提供充足碳源，釀酒酵母迅速繁殖，達到一定程度時，不斷通過自身代謝活動產(chǎn)生酒精，使醪液酒精度逐漸增大；當麥曲用量增加至10%時，紅小米所含淀粉水解基本達到飽和，釀酒酵母將淀粉水解產(chǎn)物轉化為酒精度為最大值，此時醪液酒精度最高；繼續(xù)增加麥曲用量，對淀粉的水解程度影響不大，但是添加麥曲量多，帶入產(chǎn)酸細菌增加，反而抑制釀酒酵母代謝產(chǎn)酒精，醪液酒精度有所下降[23]。因此，最佳麥曲用量為10%。

圖1 麥曲用量對醪液酒精度的影響Fig.1 Effect of wheat koji addition on alcohol content of mash

（2）釀酒曲用量對醪液酒精度的影響

由圖2可知，釀酒曲用量為0.30%～0.45%時，隨釀酒曲用量增大，α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶隨之增多，將紅小米所含淀粉水解為單糖，為釀造體系中的微生物菌群提供充足碳源，釀造體系發(fā)酵速度加快，醪液中酒精含量迅速增加；當釀酒曲用量為0.45%時，酒精度達到最大值；當釀酒曲用量＞0.45%時，釀酒酵母大量繁殖，呼吸代謝旺盛，醪液中糖分被快速消耗，使得釀造體系營養(yǎng)供給不足，黃酒醪液酒精度降低[24]。因此，最佳釀酒曲用量為0.45%。

圖2 釀酒曲用量對醪液酒精度的影響Fig.2 Effect of brewing koji addition on alcohol content of mash

（3）前發(fā)酵溫度對醪液酒精度的影響

由圖3可知，前發(fā)酵溫度為19～25 ℃時，醪液酒精度隨前發(fā)酵溫度升高逐漸增大，可能是低溫條件下，釀酒酵母代謝緩慢，酒精度較低，隨著前發(fā)酵溫度增加，釀酒酵母代謝活動加速，產(chǎn)生較多酒精，醪液酒精度逐漸增大；前發(fā)酵溫度為25 ℃，酒精度達到最大值；前發(fā)酵溫度＞25 ℃時，由于發(fā)酵過程比較劇烈，菌體繁殖過程中產(chǎn)生大量生物熱，醪液迅速升溫，高溫條件下釀酒酵母易發(fā)生早衰，導致發(fā)酵不徹底，醪液酒精度呈下降趨勢[25]。因此，最佳前發(fā)酵溫度為25 ℃。

圖3 前發(fā)酵溫度對醪液酒精度的影響Fig.3 Effect of pre-fermentation temperature on alcohol content of mash

（4）前發(fā)酵時間對醪液酒精度的影響

由圖4可知，前發(fā)酵時間為3～7 d，隨前發(fā)酵時間延長，釀造體系中的釀酒酵母利用原料水解提供的營養(yǎng)成分，快速繁殖，醪液酒精度迅速上升；前發(fā)酵時間為7 d，酒精度達到最大值；前發(fā)酵時間＞7 d時，原料水解所產(chǎn)生的營養(yǎng)成分大部分被消耗，不能為釀酒酵母產(chǎn)酒精代謝提供充足底物，同時釀酒酵母在高酒精度條件下其代謝活性被抑制，菌體發(fā)生衰亡，隨前發(fā)酵時間延長，部分酒精被轉化為有機酸和酯類，醪液中酒精度稍有下降[26]。因此，最佳前發(fā)酵時間為7 d。

圖4 前發(fā)酵時間對醪液酒精度的影響Fig.4 Effect of pre-fermentation time on alcohol content of mash

2.1.2 Box-Behnken試驗結果

為優(yōu)化紅小米黃酒釀造前發(fā)酵工藝條件，在單因素試驗基礎上，以麥曲用量（X1）、釀酒曲用量（X2）、前發(fā)酵溫度（X3）、前發(fā)酵時間（X4）為評價因素，以醪液酒精度（Y）為評價指標進行Box-Behnken試驗，具體試驗設計及結果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設計與結果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

利用SAS數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對Box-Behnken試驗數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，建立麥曲用量（X1）、釀酒曲用量（X2）、前發(fā)酵溫度（X3）、前發(fā)酵時間（X4）與醪液酒精度（Y）之間關系的二次多元回歸方程如下：

對上述數(shù)學模型進行方差分析，結果見表5。主要因素交互作用對酒精度影響的響應面圖見圖5。

圖5 主要因素交互作用對醪液酒精度影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots of the effects of interaction between main factors on alcohol content of mash

由表5可知，回歸方程的F值為10.264 9，大于F值的概率（Pr＞F）為0.000 129，表明所建立的回歸方程達到極顯著水平（P＜0.01），模型可信度極高?；貧w方程的R2=98.23%，說明響應值有98.23%的變化源自對應變量，回歸方程擬合良好。由P值可知，方程的X4、X1X4、X2X3、X2X4、X32、X42對醪液酒精度Y值的影響極顯著（P＜0.01），X3、X22對醪液酒精度Y值的影響顯著（P＜0.05），說明麥曲用量（X1）、釀酒曲用量（X2）、前發(fā)酵溫度（X3）、前發(fā)酵時間（X4）與醪液酒精度Y之間并非簡單的線性關系，因素間的交互作用對醪液酒精度Y影響較大。由F值確定各因素對醪液酒精度Y影響的主次順序為：前發(fā)酵時間＞前發(fā)酵溫度＞釀酒曲用量＞麥曲用量。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

2.1.3 紅小米黃酒前發(fā)酵最佳工藝條件的預測及驗證

利用SAS數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對建立的數(shù)學模型進行分析求解，得出紅小米黃酒前最佳發(fā)酵工藝條件為：麥曲用量9.048 6%，釀酒曲用量0.483 6%，前發(fā)酵溫度25.910 6 ℃，前發(fā)酵時間7.009 d。

為便于實踐操作，將最佳前發(fā)酵工藝條件修正為：麥曲用量9%，釀酒曲用量0.48%，前發(fā)酵溫度26 ℃，前發(fā)酵時間7 d。在上述條件下進行3次平行發(fā)酵試驗，測得醪液酒精度為16.15%vol，與預測值偏差為0.24%，說明經(jīng)優(yōu)化后的前發(fā)酵工藝條件切實可行。

2.2 紅小米黃酒釀造后發(fā)酵階段工藝優(yōu)化均勻設計試驗結果

對12組在不同后發(fā)酵溫度及時間組合條件下釀造的紅小米黃酒，從外觀、香氣、口味、風格等方面進行品評的得分情況見圖6。由圖6可知，第1、5、12號黃酒樣液感官得分較高，對應的后發(fā)酵溫度及時間組合分別為：12 ℃、75d；9℃、55 d；9 ℃、65 d。通過對專家鑒評得分情況進行分析可知，后發(fā)酵溫度和時間對紅小米黃酒品質有重要影響，低溫、長時后發(fā)酵有助于提升紅小米黃酒品質，高溫、短時后發(fā)酵不利于紅小米黃酒品質提升。結合黃酒釀造實際，溫度過低，不易進行工程實踐操作，故確定紅小米黃酒后發(fā)酵釀造較優(yōu)工藝條件為：后發(fā)酵溫度12 ℃、后發(fā)酵時間75 d。

圖6 不同后發(fā)酵條件組合試驗結果Fig.6 Experiment results of different combination of post-fermentation conditions

2.3 紅小米黃酒樣液體外抗氧化活性評價結果

2.3.1 清除DPPH·活性測定結果

由圖7可知，隨黃酒樣液及VC溶液濃度增加，兩者對DPPH·的清除率迅速增大，當黃酒樣液濃度＞0.6 mL/mL，VC溶液質量濃度＞0.6 mg/mL時，兩者對DPPH·的清除率趨于平緩。黃酒樣液清除DPPH·的IC50值為0.45 mL/mL，VC溶液清除DPPH·的IC50值為0.31 mg/mL，說明兩者均具有較強的DPPH·清除能力，黃酒樣液清除DPPH·能力弱于同等濃度的VC溶液。

圖7 紅小米黃酒樣液對DPPH·的清除效果Fig.7 Scavenging effect of red-millet Huangjiu samples on DPPH·

2.3.2 清除·OH活性測定結果

由圖8可知，黃酒樣液和VC溶液對·OH的清除率與濃度有明顯的量效關系，黃酒樣液清除·OH的IC50值為0.48 mL/mL，VC溶液清除·OH的IC50值為0.27 mg/mL，就兩者對·OH的清除能力而言，同等濃度的VC溶液強于黃酒樣液，但兩者均具有較強的·OH清除活性。

圖8 紅小米黃酒樣液對·OH的清除效果Fig.8 Scavenging effect of red-millet Huangjiu samples on·OH

2.3.3 還原力測定結果

由圖9可知，黃酒樣液和VC溶液對K3[Fe（CN）6]的還原力與濃度呈線性關系，隨著黃酒樣液和VC溶液濃度的增加，其對K3[Fe（CN）6]的還原力逐漸增強。同等濃度情況下，黃酒樣液對K3[Fe（CN）6]的還原力明顯低于VC溶液。

圖9 紅小米黃酒樣液還原力測定結果Fig.9 Determination results of reduction ability of red-millet Huangjiu samples

通過綜合分析黃酒樣液對DPPH·和·OH清除率能力及對K3[Fe（CN）6]的還原力測定試驗結果，發(fā)現(xiàn)黃酒樣液對K3[Fe（CN）6]的還原力與清除DPPH·和·OH的能力存在一定相關性，黃酒樣液對DPPH·和·OH的清除活性越強，其對K3[Fe（CN）6]的還原力也越強。

3 結論

研究對影響紅小米黃酒前發(fā)酵階段醪液酒精度的麥曲用量、釀酒曲用量、前發(fā)酵溫度、前發(fā)酵時間等因素，在單因素試驗基礎上，進行Box-Behnken試驗，利用SAS軟件對Box-Behnken試驗數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，建立了反映麥曲用量、釀酒曲用量、前發(fā)酵溫度、前發(fā)酵時間與醪液酒精度之間關系的二次多元回歸方程。利用SAS軟件對建立的數(shù)學模型進行分析求解，并結合工程實際，確定紅小米黃酒前發(fā)酵階段較優(yōu)工藝條件為：麥曲用量9%，釀酒曲用量0.48%，前發(fā)酵溫度26 ℃，前發(fā)酵時間7 d。在上述條件下，紅小米黃酒前發(fā)酵階段醪液酒精度可達16.15%vol。后發(fā)酵試驗結果顯示，紅小米黃酒后發(fā)酵最佳工藝條件為溫度12 ℃、時間75 d。

綜合分析紅小米黃酒樣液對DPPH·和·OH清除能力及還原力測定試驗結果，發(fā)現(xiàn)黃酒樣液對K3[Fe（CN）6]的還原力與清除DPPH·和·OH的能力存在相關性，黃酒樣液對DPPH·和·OH的清除活性越強，其對K3[Fe（CN）6]的還原力也越強。