包峻州，佟碩秋，蒲 靜，孟淑真，宮沛文，楊瀟垚，吳擁軍*

（貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽 550025）

腐乳是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，不同的發(fā)酵方法、不同的地域生產(chǎn)出來的腐乳風(fēng)味都有較大差異[1-3]。腐乳發(fā)酵過程中伴隨著復(fù)雜的物理化學(xué)變化和生物化學(xué)變化，理化性質(zhì)及化學(xué)組成的變化直接影響其功能特性[4-5]。腐乳白坯的制作為物理化學(xué)變化，前發(fā)酵是培養(yǎng)菌系和積累酶系的過程，后發(fā)酵是酶系作用于腐乳毛坯的過程[6-7]。腐乳白點(diǎn)是指存在于腐乳表面的白色顆粒狀晶體，懸浮于腐乳湯汁中或沉淀于容器底部，從而影響腐乳產(chǎn)品的外觀品質(zhì)，因腐乳白點(diǎn)為晶體，口感上呈砂石感，進(jìn)而影響產(chǎn)品銷售[8-10]。在發(fā)酵豆制品生產(chǎn)過程中，尤其是發(fā)酵階段的后期及貨架期，白點(diǎn)數(shù)量隨著時(shí)間的延長而呈現(xiàn)增多的趨勢[11-12]。目前對腐乳白點(diǎn)的研究主要集中在檢測腐乳白點(diǎn)的化學(xué)成分及影響白點(diǎn)產(chǎn)生因素等方面。孫軍勇等[13]利用凝膠電泳及質(zhì)譜鑒定證實(shí)腐乳白點(diǎn)的主要物質(zhì)為酪氨酸及少量蛋白質(zhì)。周熒等[14]對不同食鹽含量的腐乳游離氨基酸進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著食鹽含量的降低，游離氨基酸含量逐漸上升。代來鑫等[15]通過對腐乳結(jié)晶物組分來源進(jìn)行分析，證明以大豆為主要原料的腐乳其有機(jī)質(zhì)在微生物和酶的作用下逐漸降解產(chǎn)生大量的NH4+。黃永濤等[16]通過對腐乳結(jié)晶物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該結(jié)晶物的主要成分為磷酸銨鎂。李理等[17]通過分離腐乳后酵階段的微生物，得到大豆蛋白在這些微生物的作用下水解釋放大量的酪氨酸，從而導(dǎo)致腐乳產(chǎn)生白點(diǎn)。代來鑫等[18]通過分析對比不同發(fā)酵時(shí)間的腐乳樣品，發(fā)現(xiàn)隨著后酵時(shí)間的延長，青方腐乳鹵湯中的氨氮含量顯著增加。許家威等[19]通過對腐乳前酵坯體氨基酸態(tài)氮含量的檢測，發(fā)現(xiàn)前酵過程中毛霉的不斷生長繁衍，產(chǎn)生了大量蛋白酶等酶系物質(zhì)，蛋白質(zhì)不斷的降解，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升。朱洪康等[20]通過研究紹興腐乳發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)水解與酪氨酸含量變化的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)腐乳中白點(diǎn)的形成是由蛋白質(zhì)過度水解造成的；江景泉[21]利用微波加熱使酶鈍化甚至失去活性，可以實(shí)現(xiàn)減少腐乳白點(diǎn)的產(chǎn)生。盡管目前對白點(diǎn)的研究較多，但尚無根本的解決方案。

因此，本研究以白腐乳為研究材料，考察腐乳生產(chǎn)加工過程中發(fā)花溫度、相對濕度、發(fā)花時(shí)間、擺胚間距、毛霉接種量對腐乳白點(diǎn)及氨基酸態(tài)氮含量的影響。對所選的工藝條件設(shè)置不同參數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，優(yōu)化腐乳生產(chǎn)工藝，以期減少腐乳白點(diǎn)的產(chǎn)生，獲得外觀、口感優(yōu)良的腐乳產(chǎn)品，從而為白腐乳生產(chǎn)提供一定幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

雅致放射性毛霉（Actinomucor elegans）CICC3118：中國菌種保藏中心；冰醋酸（分析純）：開封市百川匯寶香料有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

氫氧化鈉（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純）：新光化學(xué)試劑廠；酚酞、甲酸（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；37%甲醛溶液（分析純）：重慶江川化工（集團(tuán)）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：上海錦昱科學(xué)儀器有限公司；DH6000Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；UB102i光學(xué)顯微鏡：重慶澳浦光電技術(shù)有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；DGL-50B立式蒸汽高壓滅菌鍋：江蘇登冠器械有限公司；CSB-06Z超聲波霧化工業(yè)加濕器：上海仙緣環(huán)保設(shè)備工程有限公司；FA2004N分析天平：杭州萬特衡器有限公司；FSM-225型分離式磨漿機(jī)：沈陽第三機(jī)械制造有限公司；Biochrom30＋全自動(dòng)氨基酸分析儀：大昌華嘉科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腐乳制作工藝流程及操作要點(diǎn)[22]

選豆→泡豆→磨豆→煮漿→篩漿→冷卻→點(diǎn)漿→養(yǎng)花→蹲腦→壓榨→劃坯→擺坯→接種→培菌→涼花→搓毛→腌制→裹料→后酵→腐乳

操作要點(diǎn)：

精選東北非轉(zhuǎn)基因大豆按照料液比1∶3.5（g∶mL）加水浸泡，按大豆質(zhì)量4‰添加食用堿，水溫22 ℃浸泡12 h，泡豆前pH 10～12，泡豆后pH（7.0±0.1）。濕豆與水按照料液比1∶2.3（g∶mL）進(jìn)行磨漿，將豆?jié){濃度調(diào)整為9.5°Bé，煮漿30 min，然后悶漿10 min，經(jīng)過濾網(wǎng)過濾去除豆渣，按照豆?jié){體積0.96‰加入冰醋酸點(diǎn)漿，82～83 ℃保溫養(yǎng)花15 min，80 ℃保溫蹲腦15 min，豆腐凝聚后去除黃漿水，將適量豆腐盛于壓榨機(jī)上壓榨23 min，對壓榨后豆腐進(jìn)行分割得到白坯，按白坯間距2.0 cm進(jìn)行擺坯，利用400倍光學(xué)顯微鏡下單視野孢子數(shù)4～5個(gè)的孢子懸浮液進(jìn)行噴菌。毛霉生長階段俗稱發(fā)花，在發(fā)花溫度28 ℃，發(fā)花濕度88%條件下發(fā)花38 h，涼花1 h散去霉味，21%飽和食鹽水進(jìn)行腌制14 h，加入4%的60%vol高粱酒，各種香料混勻后裝瓶，常溫下后酵3個(gè)月，即得白腐乳成品。

1.3.2 腐乳白點(diǎn)定性檢測

溶解性[23]：取腐乳表面的白點(diǎn)，置于清水、沸水、0.01mol/L鹽酸溶液、0.01 mol/L氫氧化鈉溶液、甲酸溶液中，觀察其溶解情況。

燃燒性[23]：挑取腐乳白點(diǎn)置于酒精燈火焰上燃燒，觀察其燃燒情況。

氨基酸定性檢測[24]：挑取腐乳白點(diǎn)置于2%茚三酮溶液（pH 6），加熱觀察顯色情況。

1.3.3 發(fā)花工藝參數(shù)優(yōu)化單因素試驗(yàn)

發(fā)花溫度31 ℃，發(fā)花相對濕度80%，孢子懸浮液400倍光學(xué)顯微鏡單視野下孢子數(shù)為（14±1）個(gè)，發(fā)花時(shí)間42 h條件下，豆腐擺坯間距設(shè)置0.5cm、1.0cm、1.5cm、2.0cm四個(gè)梯度；

豆腐擺坯間距2.0 cm，發(fā)花溫度31 ℃，發(fā)花相對濕度80%，發(fā)花時(shí)間42 h條件下，毛霉接種量（孢子懸浮液400倍光學(xué)顯微鏡單視野下孢子數(shù)）設(shè)置（5±1）個(gè)、（8±1）個(gè)、（11±1）個(gè)、（14±1）個(gè)四個(gè)梯度；

豆腐擺坯間距2.0 cm，孢子懸浮液400倍光學(xué)顯微鏡單視野下孢子數(shù)（8±1）個(gè)，發(fā)花相對濕度80%，發(fā)花時(shí)間42 h條件下，發(fā)花溫度設(shè)置22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃；

豆腐擺坯間距2.0 cm，孢子懸浮液400倍光學(xué)顯微鏡單視野下孢子數(shù)（8±1）個(gè)，發(fā)花相對濕度80%，發(fā)花溫度28 ℃，發(fā)花時(shí)間設(shè)置38 h、40 h、42 h、44 h；

豆腐擺坯間距2.0 cm，孢子懸浮液400倍光學(xué)顯微鏡單視野下孢子數(shù)（8±1）個(gè)，發(fā)花溫度28 ℃，發(fā)花時(shí)間設(shè)置38 h，發(fā)花相對濕度設(shè)置75%、80%、85%、90%。

分別考察豆腐擺胚間距、毛霉接種量、發(fā)花相對濕度、發(fā)花時(shí)間及發(fā)花溫度對白點(diǎn)產(chǎn)生率及腐乳氨基酸態(tài)氮含量的影響。

每個(gè)工藝參數(shù)制作300瓶腐乳，隨機(jī)分成三組，每組100瓶。將腐乳置于相同環(huán)境下發(fā)酵，3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)各參數(shù)下產(chǎn)生白點(diǎn)的數(shù)量，并計(jì)算白點(diǎn)產(chǎn)生率。

1.3.4 工藝參數(shù)優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇豆腐擺胚間距（1.5cm、2.0cm）、毛霉接種量（顯微鏡單視野下孢子數(shù)）（5±1個(gè)、8±1個(gè)）、發(fā)花溫度（25 ℃、28 ℃）、相對濕度（85%、90%）、時(shí)間（38 h、40 h）進(jìn)行5因素2水平正交試驗(yàn)，以白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化工藝參數(shù)。

1.3.5 腐乳品質(zhì)分析

每個(gè)控制因素設(shè)100瓶樣品，后酵3個(gè)月后對腐乳進(jìn)行白點(diǎn)觀察和氨基酸態(tài)氮含量檢測。每類樣品隨機(jī)挑選3瓶進(jìn)行氨基酸態(tài)氮含量檢測，計(jì)算平均值。腐乳感官指標(biāo)、理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)參照商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10170—2007《腐乳》[25]中的方法。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理利用SPSS 23.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正交試驗(yàn)參考食品試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐乳白點(diǎn)定性檢測

腐乳白點(diǎn)在蒸餾水、沸水、0.01mol/L鹽酸溶液、0.01mol/L氫氧化鈉溶液中溶解不明顯，但迅速溶解于88%甲酸溶液。

腐乳白點(diǎn)迅速燃燒，有焦味，燃燒后殘留物少，表明殘留物主要為有機(jī)物。

腐乳白點(diǎn)與茚三酮溶液反應(yīng)呈藍(lán)紫色，氨基酸呈色反應(yīng)說明腐乳白點(diǎn)含有氨基酸，可能為文獻(xiàn)中報(bào)道的酪氨酸結(jié)晶[24]。

2.2 腐乳生產(chǎn)工藝參數(shù)優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 擺坯間距對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響

豆腐擺坯間距對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響見表1。

表1 豆腐間距對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響Table 1 Effect of tofu spacing on production rate of sufu white points and amino nitrogen contents

由表1可知，隨著豆腐擺胚間距的增加，氨基酸態(tài)氮的含量逐漸降低。間距0.5 cm與1.0 cm處理組、間距1.5 cm與2.0 cm處理組的腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率均無顯著性差異（P＞0.05），間距0.5 cm與2.0 cm處理組白點(diǎn)產(chǎn)生率有顯著性差異（P＜0.05），表明擺胚間距影響腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率，且在0.5～2.0 cm范圍內(nèi)，增加擺胚間距，可減少白點(diǎn)產(chǎn)生率；間距0.5 cm、1.0 cm、1.5 cm處理組的氨基酸態(tài)氮含量呈顯著性差異（P＜0.05），表明增加豆腐擺胚間距氨基酸態(tài)氮的含量隨之下降。擺胚間距過小，白點(diǎn)易生成，影響擺胚皮膜完整性；間距過大又增加空間成本，易造成浪費(fèi)。擺坯間距＞2.5 cm時(shí)，發(fā)花過程中豆腐側(cè)面毛霉生長到0.5 cm時(shí)出現(xiàn)提前倒毛的現(xiàn)象。

不同擺胚間距的腐乳成品見圖1。擺胚間距0.5 cm、1.0 cm（見圖1A和1B）腐乳成品白點(diǎn)產(chǎn)生率高且白點(diǎn)析出密集，擺胚間距1.5 cm、2.0 cm（見圖1C和1D）腐乳成品白點(diǎn)產(chǎn)生率高但白點(diǎn)析出較少。因此，選用擺胚間距1.5 cm與2.0 cm進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 不同胚間距腐乳成品Fig.1 Sufu products of with different tofu spacing

2.2.2 毛霉接種量對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響

由表2可知，孢子數(shù)≤8個(gè)時(shí)，腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率≤10%，腐乳氨基酸態(tài)氮含量≤1.15 g/100 g。當(dāng)孢子數(shù)≥11個(gè)時(shí)，白點(diǎn)產(chǎn)生率急劇增加，白點(diǎn)產(chǎn)生率≥61%，氨基酸態(tài)氮含量≥1.26 g/100 g。接種孢子數(shù)越多，氨基酸態(tài)氮含量越高，腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率越高；接種孢子數(shù)越少，氨基酸態(tài)氮含量越低，腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率越低。因此減少接種量可有效減少腐乳白點(diǎn)的產(chǎn)生。盡管發(fā)酵時(shí)使用的是純種菌種，但是發(fā)酵前酵過程是半開放式的，發(fā)酵過程容易污染雜菌[27]，因此腐乳發(fā)酵是多菌混合發(fā)酵。單視野下孢子數(shù)5個(gè)、8個(gè)、11個(gè)、14個(gè)處理組間的白點(diǎn)產(chǎn)生率有顯著差異（P＜0.05），表明接種量影響腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率，單視野下5～14個(gè)范圍內(nèi)，隨著孢子數(shù)的減少，腐乳白點(diǎn)產(chǎn)率逐漸較少；孢子數(shù)5個(gè)與8個(gè)處理組間、孢子數(shù)11個(gè)與14個(gè)處理組間氨基酸態(tài)氮含量差異不顯著（P＞0.05），孢子數(shù)5個(gè)與14個(gè)處理組間氨基酸態(tài)氮含量有顯著差異（P＜0.05），表明減少接種量可減少氨基酸態(tài)氮含量。毛霉孢子接種量＜4個(gè)時(shí)，豆腐表面毛霉生長狀況不佳，無法形成完整的菌膜，腐乳后酵無法形成塊狀腐乳，影響成品合格率。接種量＞10個(gè)時(shí)，腐乳成品大量析出白點(diǎn)，影響產(chǎn)品銷售。

表2 接種量對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響Table 2 Effect of inoculum on production rate of white points and amino acid nitrogen contents

不同接種量腐乳成品白點(diǎn)產(chǎn)生情況見圖2。接種孢子數(shù)14個(gè)的腐乳成品（見圖2A）白點(diǎn)產(chǎn)生率高，且白點(diǎn)析出密集；接種孢子數(shù)11個(gè)的腐乳成品（見圖2B）白點(diǎn)產(chǎn)生率高，但白點(diǎn)析出少；接種孢子數(shù)8個(gè)的腐乳成品（見圖2C）腐乳成品少有白點(diǎn)產(chǎn)生；接種孢子數(shù)5個(gè)的腐乳成品（見圖2D）無白點(diǎn)產(chǎn)生。減少接種量可有效減少腐乳白點(diǎn)的產(chǎn)生。因此，選用毛霉接種量（單視野下5個(gè)、8個(gè)）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 不同毛霉接種量腐乳成品Fig.2 Manufactured products of sufu with different Mucor inoculum

2.2.3 發(fā)花溫度對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響

由表3可知，發(fā)花溫度不高于28 ℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量≤1.22 g/100 g，白點(diǎn)率≤59%；在發(fā)花溫度不低于31 ℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量≥1.31 g/100 g，白點(diǎn)產(chǎn)生率≥81%。發(fā)花溫度25 ℃、28 ℃、31 ℃處理組間，白點(diǎn)產(chǎn)生率有顯著差異（P＜0.05），發(fā)花溫度22 ℃與25 ℃處理組間白點(diǎn)產(chǎn)生率無顯著差異（P＞0.05），表明降低發(fā)花溫度可減少腐乳白點(diǎn)的產(chǎn)生；發(fā)花溫度25 ℃、28 ℃、31 ℃處理組間，氨基酸態(tài)氮含量有顯著差異（P＜0.05），發(fā)花溫度22 ℃與25 ℃處理組間氨基酸態(tài)氮含量無顯著差異（P＞0.05），表明降低溫度可降低氨基酸態(tài)氮含量。當(dāng)發(fā)花溫度不高于22 ℃時(shí)，出現(xiàn)部分豆坯不生長毛霉，或毛霉長勢較差現(xiàn)象，易造成腐乳后酵豆腐腐敗現(xiàn)象，無法形成塊狀腐乳，影響成品合格率。發(fā)花溫度不低于28 ℃時(shí)腐乳的氨基酸態(tài)氮含量迅速增加，腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率大幅度增加。將發(fā)花環(huán)境溫度控制在28 ℃時(shí)，可有效降低腐乳成品白點(diǎn)的產(chǎn)生。

表3 發(fā)花溫度對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響Table 3 Effect of Mucor growth temperature on production rate of white points and amino acid nitrogen contents

不同發(fā)花溫度腐乳成品白點(diǎn)產(chǎn)生情況見圖3。發(fā)花溫度31 ℃，白點(diǎn)產(chǎn)生率高且較密集；發(fā)花溫度25 ℃，無白點(diǎn)的產(chǎn)生。降低發(fā)花溫度可有效控制腐乳成品白點(diǎn)的產(chǎn)生。因此，選用溫度（25 ℃、28 ℃）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 不同發(fā)花溫度腐乳成品Fig.3 Manufactured products of sufu with different Mucor growth temperature

2.2.4 相對濕度對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響

由表4可知，相對濕度≥85%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量≤1.05 g/100 g，腐乳成品無白點(diǎn)產(chǎn)生；相對濕度≤80%時(shí)氨基酸態(tài)氮含量≥1.21 g/100 g，且腐乳成品白點(diǎn)產(chǎn)生率≥60%。相對濕度越高，氨基酸態(tài)氮的含量越低，白點(diǎn)產(chǎn)生率越低；相對濕度越低，氨基酸態(tài)氮的含量越高，白點(diǎn)率越高。相對濕度≥85%，可降低腐乳氨基酸態(tài)氮的含量，有利于腐乳白點(diǎn)的控制。相對濕度75%、80%與85%處理組間白點(diǎn)產(chǎn)生率有顯著差異（P＜0.05），相對濕度85%與90%處理組間白點(diǎn)產(chǎn)生率無顯著差異（P＞0.05），相對濕度75%～85%范圍內(nèi)，表面增加相對濕度可降低腐乳白點(diǎn)的產(chǎn)生；相對濕度75%、80%與85%處理組間氨基酸態(tài)氮含量呈顯著差異（P＜0.05），相對濕度85%與90%處理組間氨基酸態(tài)氮含量無顯著差異（P＞0.05），表面增加相對濕度可降低氨基酸態(tài)氮含量。相對濕度＜80%時(shí)，擺坯框四周的豆塊失水變干，但中心處豆塊氨基酸態(tài)氮含量較高。相對濕度＞90%時(shí)，因相對濕度過高導(dǎo)致毛霉生長過程中含水率過高，壓制毛霉長勢。

表4 相對濕度對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響Table 4 Effect of relative humidity on production rate of white points and amino nitrogen contents of Mucor

不同相對濕度腐乳成品白點(diǎn)產(chǎn)生情況見圖4。發(fā)花濕度＜80%（見圖4A）腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率高，但不密集；發(fā)花濕度80%～85%（見圖4B）白點(diǎn)產(chǎn)生率稍高，白點(diǎn)析出少；發(fā)花濕度85%～90%（見圖4C和圖4D）腐乳未見白點(diǎn)生成。適宜的發(fā)花濕度可以減少白點(diǎn)的產(chǎn)生。因此，選擇相對濕度（85%～88%、88%～90%）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 不同發(fā)花濕度腐乳成品Fig.4 Manufactured products of sufu with different Mucor growth humidity

2.2.5 發(fā)花時(shí)間對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響

由表5可知，發(fā)花時(shí)間≤40 h，氨基酸態(tài)氮含量≤1.14 g/100 g，腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率≤10%。發(fā)花時(shí)間≥42 h，氨基酸態(tài)氮含量≥1.28 g/100 g，腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率≥58%。發(fā)花時(shí)間38 h、40 h、42 h與44 h處理組間白點(diǎn)產(chǎn)生率有顯著差異（P＜0.05），表明減少發(fā)花時(shí)間可降低腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率；發(fā)花時(shí)間38 h、40 h與42 h處理組間氨基酸態(tài)氮含量呈顯著差異（P＜0.05），發(fā)花時(shí)間42 h與44 h處理組間氨基酸態(tài)氮含量差異不顯著（P＞0.05），表明減少發(fā)花時(shí)間可降低腐乳氨基酸態(tài)氮含量。發(fā)花時(shí)間低于30 h時(shí)毛霉生長不佳，豆坯未形成完整的皮膜，腐乳后酵后易出現(xiàn)腐乳融化現(xiàn)象，無法形成塊狀腐乳。發(fā)花時(shí)間≥45 h，腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率顯著增加，同時(shí)部分豆坯毛霉生長孢子，出現(xiàn)發(fā)黑現(xiàn)象。

表5 發(fā)花時(shí)間對腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量的影響Table 5 Effect of Mucor growth time on production rate of white points and amino nitrogen contents

不同發(fā)花時(shí)間腐乳成品白點(diǎn)產(chǎn)生情況見圖5。發(fā)花45 h（見圖5A）腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率高且稍密集；發(fā)花42 h（見圖5B）腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率高且稍密集；發(fā)花40 h（見圖5C）腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率低且白點(diǎn)析出少；發(fā)花38 h（見圖5D）未見腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生。因此，選用發(fā)花時(shí)間（38 h、40 h）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 不同發(fā)花時(shí)間腐乳成品Fig.5 Manufactured products of sufu with different Mucor growth time

2.3 工藝參數(shù)優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以白點(diǎn)產(chǎn)生率及氨基酸態(tài)氮含量為評價(jià)指標(biāo)，分別選擇豆腐擺胚間距（1.5 cm、2.0 cm）、毛霉接種量（5個(gè)、8個(gè)）、發(fā)花溫度（25 ℃、28 ℃）、相對濕度（85%、90%）、發(fā)花時(shí)間（38 h、40 h）進(jìn)行5因素2水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表6。

表6 腐乳工藝參數(shù)優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments for process parameter optimization of sufu

續(xù)表

由表6可知，以白點(diǎn)產(chǎn)生率為評價(jià)指標(biāo)，影響白點(diǎn)產(chǎn)生率的主次因素順序?yàn)镃＞A＞E＞D＞B，最佳生產(chǎn)工藝組合為A2B2C2D1E1，即擺坯間距2.0 cm、發(fā)花溫度28 ℃、發(fā)花相對濕度90%、發(fā)花時(shí)間38 h、400倍光學(xué)顯微單視野下孢子數(shù)5個(gè)，此時(shí)無腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生；以氨基酸態(tài)氮含量為評價(jià)指標(biāo)，影響氨基酸態(tài)氮含量的主次因素順序?yàn)镃＞A＞D＞B=E，最佳生產(chǎn)工藝組合為A2B1C2D1E1，即擺坯間距2.0 cm、發(fā)花溫度25 ℃、發(fā)花相對濕度90%、發(fā)花時(shí)間38 h、400倍光學(xué)顯微單視野下孢子數(shù)5個(gè)。由正交試驗(yàn)可得氨基酸態(tài)氮含量1.09 g/100 g是腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生的臨界點(diǎn)，氨基酸含量＜1.09 g/100 g時(shí)不產(chǎn)生白點(diǎn)，此時(shí)腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生率低，同時(shí)擁有較高的氨基酸態(tài)氮含量。因此，最佳生產(chǎn)工藝組合為A1B2C2D2E2，即擺坯間距1.5 cm、接種量孢子數(shù)控制8個(gè)、發(fā)花溫度28 ℃、發(fā)花濕度90%、發(fā)花時(shí)間40 h。在此工藝參數(shù)條件下，成品腐乳氨基酸態(tài)氮含量為1.09 g/100 g，未見腐乳白點(diǎn)產(chǎn)生。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)得出隨著擺坯間距的增大，氨基酸態(tài)氮的含量逐漸降低，最佳擺坯間距為2 cm；隨著接種量的減少，腐乳氨基酸態(tài)氮的含量逐漸減少，最佳毛霉接種量（400倍光學(xué)顯微鏡單視野下孢子數(shù)）為5個(gè)；隨著發(fā)花溫度的降低，氨基酸態(tài)氮含量逐漸降低，最佳發(fā)花溫度為25 ℃；隨著發(fā)花濕度的增加，氨基酸態(tài)氮的含量逐漸減少，發(fā)花相對濕度最佳為90%；隨著發(fā)花時(shí)間的延長，氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，最佳發(fā)花時(shí)間為38 h。結(jié)果表明，氨基酸態(tài)氮＜1.09 g/100 g時(shí)，未觀察到腐乳白點(diǎn)。因此降低腐乳白點(diǎn)的產(chǎn)生率，可通過減少腐乳氨基酸態(tài)氮的含量實(shí)現(xiàn)。