劉 婷，肖仲久，李小霞 *，王雙雙

（1.遵義師范學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，貴州 遵義 563006；2.遵義師范學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，貴州 遵義 563006）

高粱（Sorghum bicolorL.）是禾本科、高粱屬植物，是我國(guó)白酒釀造的主要原料[1]，紅纓子高粱是國(guó)酒茅臺(tái)釀造用的唯一有機(jī)高粱品種，具有淀粉含量高、纖維層粗厚、耐蒸煮等特性，非常適用于茅臺(tái)酒的釀造[2]。然而，紅纓子是茅臺(tái)鎮(zhèn)特產(chǎn)的一種有機(jī)糯高粱，異地生長(zhǎng)的紅纓子其品質(zhì)和特性與茅臺(tái)鎮(zhèn)相比有一定差距。土壤是植物賴以生存的根本，健康的土壤是保證糧食安全的關(guān)鍵[3]，土壤健康一般通過(guò)物理、化學(xué)和生物學(xué)指標(biāo)來(lái)衡量[4]，其中微生物的組成、結(jié)構(gòu)、功能就是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)[5-6]。土壤中存在著地球上種類最為豐富的細(xì)菌、古菌、真菌、病毒等微生物群落[7]，土壤微生物的存在影響土壤有機(jī)質(zhì)的合成以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，直接影響植物的生長(zhǎng)[8-9]。

土壤微生物與植物有著協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系，一方面植物為微生物提供生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另一方面土壤微生物將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)物供植物生長(zhǎng)吸收[10]。同時(shí)，根際土壤微生物可作為抵御病原菌侵入植物根系的第一道防線[11]，提升土傳病害的根際免疫[12-13]。土壤細(xì)菌占土壤微生物的70%～90%，是土壤中分布最廣、含量最多，豐富度最高的一類，能夠有效促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的分解及營(yíng)養(yǎng)元素的釋放[14]。根際是植物-土壤-微生物相互作用的中心[15]，根際微生物具有分解植物根際有機(jī)質(zhì)、固定氮元素、進(jìn)行養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等功能，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的作用[16]。因此，推測(cè)茅臺(tái)鎮(zhèn)特產(chǎn)的有機(jī)高粱紅纓子，其特有的品質(zhì)離不開其根際細(xì)菌的分布和組成。目前，針對(duì)釀酒高粱根際微生態(tài)特征的研究相對(duì)較少，且研究技術(shù)不夠先進(jìn)，深度不夠，特別是針對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)優(yōu)質(zhì)釀酒高粱根際細(xì)菌群落特征的研究幾乎空白。

高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序的一次革命性改變，能夠一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子進(jìn)行序列測(cè)定，具有自動(dòng)化、通量高、成本低等特點(diǎn)，該技術(shù)的出現(xiàn)加速了微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展，它能在整體水平上破譯原位復(fù)雜環(huán)境中土壤微生物群落多樣性[10，17]。因此，本研究旨在通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析茅臺(tái)鎮(zhèn)及其周邊地區(qū)所種植的紅纓子高粱根際細(xì)菌群落特征，這樣能夠全面獲得高粱根際微生物類群信息，分析茅臺(tái)鎮(zhèn)特有的微生物特征，對(duì)深入分析優(yōu)質(zhì)高粱的生長(zhǎng)環(huán)境，從而擴(kuò)大其生產(chǎn)面積有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅纓子高粱根際土壤：采集于貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)、壇廠鎮(zhèn)、鴨溪鎮(zhèn)大面積種植的高粱根際土；E.Z.N.A.Soil DNA Kit（D5625-01）：美國(guó)OMEGA公司；Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒（Q10212）：美國(guó)Life公司；TaqDNA Polymerase（Ep0406）：美國(guó)Thermo公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（SK8192）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽：北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)UVP公司；T100TM Thermal Cyeler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

本研究選取的三個(gè)樣地分別位于貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)、壇廠鎮(zhèn)、鴨溪鎮(zhèn)，茅臺(tái)鎮(zhèn)是國(guó)酒茅臺(tái)的原產(chǎn)地，位于仁懷市西13 km，海拔575 m，北緯27°51'13.03"，東經(jīng)106°23'3.76"；壇廠鎮(zhèn)位于仁懷市南部，距茅臺(tái)鎮(zhèn)大約12 km，海拔772 m，北緯27°46'23.10"，東經(jīng)106°21'55.52"；鴨溪鎮(zhèn)位于遵義市播州區(qū)西部，距茅臺(tái)鎮(zhèn)70 km，海拔772 m，北緯27°35'17.12"，東經(jīng)106°41'41.82"。采樣時(shí)間為2017年7月3日。每個(gè)樣地設(shè)置3塊100×100 m 固定實(shí)驗(yàn)樣地，在每塊實(shí)驗(yàn)樣地中設(shè)置5×5 m樣方3個(gè)，每個(gè)樣方內(nèi)隨機(jī)選取5株高粱，除去高粱根部2 cm表層土，取2～20 cm深的土壤剖面，剪取帶有細(xì)根的根系，輕輕抖落附在根上的土壤，將剩下的土壤用小刷子刷至無(wú)菌自封袋中，貼好標(biāo)簽置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃箱中用于土壤微生物高通量測(cè)序。

1.3.2 土壤微生物的高通量測(cè)序

土壤微生物總DNA采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit提取，以其為模板PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)基因序列，所用引物為V3-V4通用引物341F（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'），引物添加特異Barcode序列標(biāo)記用于區(qū)分不同樣品。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（10 mmol/L）0.5 μL，模板DNA 10 ng，正、反向引物（50 μmol/L）各0.5 μL，聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，補(bǔ)充雙蒸水（ddH2O）至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)barcode區(qū)分樣品序列，并對(duì)各樣本序列進(jìn)行質(zhì)量控制（quality control，QC），去除非靶區(qū)域序列及嵌合體?；诓僮鞣诸悊卧╫perational taxonomic unit，OTU）聚類分析，首先將多條序列根據(jù)其序列之間的距離進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU）。利用Mothur軟件以及R語(yǔ)言程序包“VennDiagram”分析并繪制韋恩（Venn）圖分析統(tǒng)計(jì)樣本中共有和獨(dú)有的OTU的數(shù)目，直觀的展現(xiàn)出環(huán)境中樣品之間的異同。對(duì)處理后序列進(jìn)行物種分類分析，采用RDP classifier軟件，基于伯杰氏細(xì)菌分類方法將序列進(jìn)行域（domain）、門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）水平物種分類，對(duì)每個(gè)樣本和每個(gè)物種單元分類進(jìn)行序列豐度計(jì)算構(gòu)建樣本和物種分類單元序列豐度矩陣，利用SPSS 22.0對(duì)不同樣地間同一菌群的相對(duì)豐度進(jìn)行方差分析。通過(guò)加權(quán)Unifrac計(jì)算進(jìn)化樹中不同環(huán)境樣本間Unique branch長(zhǎng)度總和，來(lái)衡量樣本間物種組成的相似度，利用R語(yǔ)言程序包“pheatmap”繪制樣本距離熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣地間高粱根際共有和獨(dú)有的OTU的數(shù)目

通過(guò)分析樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目繪制Venn圖，結(jié)果見圖1。由圖1可知，高粱根際共發(fā)現(xiàn)了17 687個(gè)細(xì)菌OTU，不同樣地之間表現(xiàn)為茅臺(tái)鎮(zhèn)（8 241）＞壇廠鎮(zhèn)（7 482）＞鴨溪鎮(zhèn)（7 457）；三個(gè)樣地共有OTU為1 352個(gè)；茅臺(tái)鎮(zhèn)和壇廠鎮(zhèn)共有OTU為2 510個(gè)；茅臺(tái)鎮(zhèn)和鴨溪鎮(zhèn)共有OTU為2 340個(gè)，壇廠鎮(zhèn)和鴨溪鎮(zhèn)共有OTU為1 995個(gè)。結(jié)果可以看出不同樣地高粱根際細(xì)菌物種數(shù)量有明顯差別，茅臺(tái)鎮(zhèn)細(xì)菌OTU數(shù)量最多，且獨(dú)有的OTU最多，說(shuō)明茅臺(tái)鎮(zhèn)高粱根際細(xì)菌物種數(shù)最多，且特有細(xì)菌種類最多；茅臺(tái)鎮(zhèn)與壇廠鎮(zhèn)、茅臺(tái)鎮(zhèn)與鴨溪鎮(zhèn)所共有的OTU較壇廠鎮(zhèn)與鴨溪鎮(zhèn)多，說(shuō)明茅臺(tái)鎮(zhèn)高粱根際細(xì)菌種類在其他樣地分布較多。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物多樣性越高，其生態(tài)功能、抗環(huán)境脅迫和作物生產(chǎn)能力都明顯增高[18]，可以推測(cè)茅臺(tái)鎮(zhèn)高粱根際土壤相較其他樣地更健康，更利于植物的生長(zhǎng)。

圖1 不同樣地共有和獨(dú)有的細(xì)菌OTU數(shù)量Fig.1 Numbers of mutual and unique bacterial OTU among different sample plots

2.2 不同樣地高粱根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

為解析不同樣地高粱根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征，對(duì)聚類后的OTU代表序列進(jìn)行物種注釋。三個(gè)樣地高粱根際細(xì)菌OUT隸屬于25門、55綱、118目、214科、674屬。將相對(duì)豐度＜1%的細(xì)菌歸于other?；贠TU聚類的結(jié)果繪制門水平下細(xì)菌菌群分布條形圖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在門水平上，三個(gè)樣地高粱根際細(xì)菌群落組成相似，但相對(duì)豐度在不同樣地間存在較大差異。變形菌門（Proteobacteria）細(xì)菌在三個(gè)樣地高粱根際分布最多，且不同樣地間相對(duì)豐度差異并不顯著，擬桿菌門（Bacteroidetes）細(xì)菌在三個(gè)樣地間分布較多，也未表現(xiàn)出顯著差異，說(shuō)明變形菌門和擬桿菌門細(xì)菌在高粱根際土壤中的生態(tài)幅較寬，可能在生態(tài)環(huán)境構(gòu)建和物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中起重要作用。綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）細(xì)菌在三個(gè)樣地間也有較高的分布，且差異顯著（P＜0.05）。其中茅臺(tái)鎮(zhèn)綠彎菌門的相對(duì)豐度最高為16.19%，壇廠鎮(zhèn)和鴨溪鎮(zhèn)較低僅為8.01%和3.84%；壇廠鎮(zhèn)的浮霉菌門相對(duì)豐度最高為10.84%，茅臺(tái)鎮(zhèn)和鴨溪鎮(zhèn)分別為8.96%和8.02%。綠彎菌門在生物圈分布較廣，參與了碳（C）、氮（N）、硫（S）等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)，可以吸收同化環(huán)境中生物和非生物來(lái)源的多種有機(jī)酸物質(zhì)，用于解決日益嚴(yán)重的環(huán)境污染問題[19]。茅臺(tái)鎮(zhèn)和壇廠鎮(zhèn)釀酒高粱根際細(xì)菌中的硝化螺旋菌門（Nitrospirae）細(xì)菌相對(duì)豐度顯著高于鴨溪鎮(zhèn)（P＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，硝化螺旋菌門對(duì)處理高強(qiáng)度有機(jī)廢水具有關(guān)鍵作用[20]。從結(jié)果可以看出，茅臺(tái)鎮(zhèn)高粱根際能夠分解污染有機(jī)物的細(xì)菌分布較廣，這在很大程度上能夠減少污染物對(duì)高粱生長(zhǎng)的影響，提高高粱的品質(zhì)。

圖2 基于門水平不同樣地釀酒高粱根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure of liquor-making sorghum rhizosphere in different plots based on phylum level

基于OTU聚類的結(jié)果繪制屬水平下細(xì)菌菌群分布條形圖，結(jié)果見圖3。

圖3 基于屬水平不同樣地釀酒高粱根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community structure of liquor-making sorghum rhizosphere in different plots based on genus level

由圖3可知，在屬水平上，未能分類的厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）細(xì)菌在茅臺(tái)鎮(zhèn)和壇廠鎮(zhèn)分布最多，未能分類的噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae）細(xì)菌在鴨溪鎮(zhèn)分布最廣。未能分類的厭氧繩菌科細(xì)菌在茅臺(tái)鎮(zhèn)占比最高達(dá)14.2%，顯著高于壇廠鎮(zhèn)和鴨溪鎮(zhèn)（P＜0.05）。研究證明厭氧繩菌是沙漠演變?yōu)榫G洲過(guò)程中出現(xiàn)的重要性指示生物[21]，多適合生活在高水砂、高氨、相對(duì)低鹽、高pH值的環(huán)境中[22]?？梢钥闯觯┡_(tái)鎮(zhèn)高粱品質(zhì)與其長(zhǎng)期生長(zhǎng)環(huán)境土壤理化性質(zhì)有明顯的關(guān)系，且與厭氧繩菌的生長(zhǎng)環(huán)境相關(guān)。未能分類的噬幾丁質(zhì)菌科、埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）細(xì)菌在三個(gè)樣地間差異不顯著；壇廠鎮(zhèn)和鴨溪鎮(zhèn)的固氮螺菌屬（Azospira）細(xì)菌相對(duì)豐度顯著高于茅臺(tái)鎮(zhèn)（P＜0.05），茅臺(tái)鎮(zhèn)和壇廠鎮(zhèn)的未能分類的浮霉菌科（Planctomycetaceae）細(xì)菌相對(duì)豐度顯著高于鴨溪鎮(zhèn)（P＜0.05）。浮霉菌是目前發(fā)現(xiàn)的具有厭氧氨氧化功能的細(xì)菌來(lái)源[23]，在過(guò)量施用氮肥的農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)氮移除[24-26]方面有重要作用，屬于生態(tài)友好型微生物，對(duì)全球氮循環(huán)具有重要意義。可以推測(cè)此類細(xì)菌可以改善茅臺(tái)鎮(zhèn)高粱根際土壤過(guò)量施氮肥情況，從而保證高粱品質(zhì)。

采用樣本間加權(quán)Unifrac距離矩陣?yán)L制距離熱圖，結(jié)果見圖4。由圖4可知，茅臺(tái)鎮(zhèn)和壇廠鎮(zhèn)高粱根際細(xì)菌組成和分布相似度最高，其次為壇廠鎮(zhèn)和鴨溪鎮(zhèn)，茅臺(tái)鎮(zhèn)和鴨溪鎮(zhèn)的距離最遠(yuǎn)。說(shuō)明距離對(duì)高粱根際細(xì)菌組成和分布有一定的影響，距離越近其相似度越高。

圖4 不同樣地釀酒高粱根際間細(xì)菌群落相似度距離熱圖Fig.4 Distance heap map of bacterial community similarity of liquor-making sorghum rhizosphere among different plots

3 結(jié)論

茅臺(tái)鎮(zhèn)高粱根際細(xì)菌物種數(shù)、特有細(xì)菌種類最多，且茅臺(tái)鎮(zhèn)高粱根際細(xì)菌種類在其他樣地分布較多。三個(gè)樣地細(xì)菌群落組成相似，但相對(duì)豐度存在較大差異。在門水平上，變形菌門細(xì)菌在三個(gè)樣地分布最多，且相對(duì)豐度差異不顯著。綠彎菌門、浮霉菌門在三個(gè)樣地間有較高的分布，不同樣地間差異顯著，且綠彎菌門在茅臺(tái)鎮(zhèn)的相對(duì)豐度最高。在屬水平上，茅臺(tái)鎮(zhèn)未能分類的厭氧繩菌科細(xì)菌豐富度顯著高于壇廠鎮(zhèn)和鴨溪鎮(zhèn)。聚類分析結(jié)果顯示茅臺(tái)鎮(zhèn)和壇廠鎮(zhèn)的細(xì)菌分布和組成相似度最高。