申大年 咸文娟

1.青海省第五人民醫(yī)院（青海省腫瘤醫(yī)院）泌尿外科（青海西寧 810007）

2.青海省人民醫(yī)院 遺傳研究室（青海西寧810007）

前列腺癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，近年來，我國前列腺癌發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重威脅人類生命安全，臨床常采用手術(shù)、放化療等方式進(jìn)行治療，但大部分患者確診時(shí)已處于中晚期，目前前列腺癌發(fā)病機(jī)制尚未闡明，因而積極探尋新型基因?qū)η傲邢侔┰\斷及治療均具有重要意義[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展過程可發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，并可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程[2-4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA PCAT19（LncRNA PCAT19）在喉癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高，并可通過調(diào)節(jié)miR-182/PDK4分子軸從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]。但PCAT19在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未闡明。靶基因預(yù)測(cè)顯示為微小RNA-137（miR-137）與PCAT19存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明miR-137在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，并可通過靶向突觸細(xì)胞黏附分子（DUSP4）抑制乳腺癌發(fā)展進(jìn)程[6]。但PCAT19是否可通過調(diào)控miR-137表達(dá)影響前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)過程尚未可知。因此，本研究主要探討PCAT19對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移及侵襲的影響，探究其對(duì)miR-137的調(diào)控作用。

材料與方法

一、材料與試劑

（一）一般資料

前列腺癌組織與癌旁組織：選取2018年3月至2019年2月本院收治的29例前列腺癌患者為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)病理診斷為前列腺癌，年齡50~70歲，平均年齡（65.32±10.63）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；繼發(fā)性前列腺癌患者；術(shù)前1月內(nèi)接受放療或化療患者。術(shù)中切除前列腺癌組織與癌旁組織，置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。

（二）細(xì)胞與試劑

人前列腺癌細(xì)胞DU145購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清、Lipofectamine2000、Trizol、反轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR試劑均購自美國Thermo Fisher公 司；si-NC、si-PCAT19、miR-NC、miR-137 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-137購自廣州銳博生物科技有限公司；MTT試劑購自上海信帆生物科技有限公司；Transwell小室與Mgtrigel基質(zhì)膠均購自美國Corning公司；兔抗人E-cadherin、N-cadherin抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

二、方法

（一）實(shí)驗(yàn)分組

DU145細(xì)胞中加入0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液（2.5×105個(gè)/mL）接種于6孔板（200 μL/孔），待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將si-NC、si-PCAT19、si-PCAT19與anti-miR-NC、si-PCAT19與anti-miR-137轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞，分別記作si-NC組、si-PCAT19組、si-PCAT19+anti-miR-NC組、si-PCAT 19+anti-miR-137組。

（二）qRT-PCR檢測(cè)PCAT19、miR-137的表達(dá)水平

采用Trizol法提取前列腺癌組織、癌旁組織及各組DU145細(xì)胞中的總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5μL，MgSO4 2.5μL，dNTPs 2.5μL，正反向引物各0.5μL，cDNA 2μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60 s，95℃變性60 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共36次循環(huán)。PCAT19以GAPDH為內(nèi)參，miR-137以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算PCAT19、miR-137相對(duì)表達(dá)量。

（三）MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

取各組DU145細(xì)胞（2.5×105個(gè)/mL）接種于96孔板（100μL/孔），加入MTT溶液（20μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO（150μL/孔），避光振蕩孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔光密度值（OD值），以O(shè)D值大小表示細(xì)胞活力大小。。

（四）檢測(cè)細(xì)胞周期

取各組DU145細(xì)胞（1×106個(gè)/mL）接種于96孔板（100μL/孔），離心后（3000 r/min轉(zhuǎn)速，5 min）加入預(yù)冷PBS，再次離心（3000 r/min轉(zhuǎn)速，5 min），加入預(yù)冷PBS（500μL）重懸細(xì)胞，加入預(yù)冷70%乙醇（3.5 mL），充分混勻后置于4℃冰箱內(nèi)孵育24 h，3000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入RNaseA（50μL），水浴30 min，加入PI染色液（450μL）染色30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期。

（五）Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲

取各組DU145細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶消化，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液（5×104個(gè)/mL），將細(xì)胞懸液加入上室（200μL/孔），下室加入培養(yǎng)液（600μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用多聚甲醛固定（20 min），采用0.1%結(jié)晶紫染液染色（15 min），觀察遷移細(xì)胞數(shù)。使用培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠后加入上室（40μL/孔），培養(yǎng)箱孵育5 h后加入DU145細(xì)胞懸液，后續(xù)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

（六）雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)PCAT19和miR-137的靶向關(guān)系

LncBase v.2預(yù)測(cè)顯示PCAT19和miR-137存在結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建野生型載體WT-PCAT19與突變型載體MUT-PCAT19，分別將miR-NC、miR-137 mimics與WT-PCAT19、MUT-PCAT19共轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測(cè)各組熒光素酶活性。

（七）Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

DU145細(xì)胞加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取50μg變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h后分別孵育一抗稀釋液（1:1000）與二抗稀釋液（1:5000），室溫孵育1 h，曝光，顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、PCAT19和miR-137在前列腺癌組織中的表達(dá)

與癌旁組織比較，前列腺癌組織PCAT19的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-137的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 PCAT19和miR-137的表達(dá)

二、干擾PCAT19對(duì)DU145增殖的影響

與si-NC組比較，si-PCAT19組OD值顯著降低（P＜0.05），G0-G1期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），G2-M期細(xì)胞比例相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1、表2。

圖1 干擾PCAT19對(duì)DU145周期的影響

表2 干擾PCAT19對(duì)DU145細(xì)胞活性及周期的影響（±s，n=3）

表2 干擾PCAT19對(duì)DU145細(xì)胞活性及周期的影響（±s，n=3）

注：與si-NC組相比，*P<0.05（t=27.175、37.821、18.976、15.662、18.342、0.253，P＜0.05）。

分組 PCAT19 miR-137 OD值 G0-G1（%） S（%） G2-M（%）si-NC 0.94±0.05 0.99±0.05 1.10±0.05 33.13±0.51 33.70±0.54 33.17±0.41 si-PCAT19 0.14±0.01* 3.05±0.08* 0.51±0.02* 40.53±0.64* 26.39±0.43* 33.08±0.46

三、干擾PCAT19對(duì)DU145遷移侵襲的影響

與si-NC組比較，si-PCAT19組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少 （P＜0.05），E-cadherin蛋白水平顯著升高（P＜0.05）見表3，N-cadherin蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖2。

表3 干擾PCAT19對(duì)DU145遷移侵襲的影響（±s，n=3）

表3 干擾PCAT19對(duì)DU145遷移侵襲的影響（±s，n=3）

注：與si-NC組相比，*P<0.05（t=31.855、30.084、21.004、18.904，P＜0.05）。

分組 遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)） E-cadherin N-cadherin si-NC 189.67±4.64 125.33±3.30 0.12±0.01 0.60±0.04 si-PCAT19 89.33±2.87*63.00±1.41*0.62±0.04* 0.15±0.01*

圖2 干擾PCAT19對(duì)DU145中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

四、PCAT19和miR-137靶向關(guān)系

LncBase v.2預(yù)測(cè)顯示PCAT19與miR-137存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。miR-137過表達(dá)可明顯降低野生型載體WT-PCAT19的熒光素酶活性（P＜0.05），而對(duì)突變型載體MUT-PCAT19的熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05），見表4。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=3）

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=3）

注：與miR-NC組 相 比，*P<0.05（t=28.273，P＜0.05；t=0.665，P=0.542）。

分組 WT-PCAT19 MUT-PCAT19 miR-NC 0.96±0.04 0.97±0.06 miR-137 0.23±0.02* 1.00±0.05

圖3 PCAT19靶向miR-137

五、干擾miR-137和PCAT19對(duì)DU145增殖、遷移、侵襲的影響

與si-PCAT19+anti-miR-NC組比較，si-PCAT19+anti-miR-137組OD值顯著升高（P＜0.05），G0-G1期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），G2-M期細(xì)胞比例相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.05），見表6，E-cadherin蛋白水平顯著降低（P＜0.05），N-cadherin蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖5、表5。

圖4 干擾miR-137和PCAT19對(duì)DU145周期的影響

表5 干擾miR-137和PCAT19對(duì)DU145細(xì)胞活性及周期的影響（±s，n=3）

表5 干擾miR-137和PCAT19對(duì)DU145細(xì)胞活性及周期的影響（±s，n=3）

注：與si-PCAT19+anti-miR-NC組相比，*P<0.05（t=17.041、12.581、15.151，P＜0.05；t=0.251，P=0.814）。

分組 OD值 G0-G1（%） S（%） G2-M（%）si-PCAT19+anti-miR-NC 0.52±0.02 40.66±0.52 26.38±0.38 32.96±0.40 si-PCAT19+anti-miR-137 0.96±0.04*35.47±0.49*31.49±0.41*33.04±0.38

圖5 干擾miR-137和PCAT19對(duì)DU145中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

表6 干擾miR-137和PCAT19對(duì)DU145遷移侵襲的影響（±s，n=3）

表6 干擾miR-137和PCAT19對(duì)DU145遷移侵襲的影響（±s，n=3）

注：與si-PCAT19+anti-miR-NC組 相 比，*P<0.05（t=31.647、21.118、11.579、18.075，P＜0.05）。

分組 遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)） E-cadherin N-cadherin si-PCAT19+anti-miR-NC 90.33±2.49 63.67±1.70 0.62±0.05 0.16±0.01 si-PCAT19+anti-miR-137 167.33±3.40*106.67±3.09*0.26±0.02*0.49±0.03*

討 論

前列腺癌發(fā)病原因尚未闡明，目前尚缺乏特異性治療靶點(diǎn)，因而探究前列腺癌發(fā)病機(jī)制對(duì)提高前列腺癌治療效果及改善患者預(yù)后均具有重要意義，近年來，LncRNA可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA從而調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程，并可能作為前列腺癌分子治療的潛在靶點(diǎn)[7-10]。

非小細(xì)胞肺癌組織中PCAT19的表達(dá)水平升高，PCAT19負(fù)調(diào)節(jié)p53而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖[11]。PCAT19在前列腺癌中呈高表達(dá)，并可能參與前列腺癌發(fā)生及發(fā)展過程[12]。但PCAT19在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌組織PCAT19的表達(dá)水平明顯升高，干擾PCAT19表達(dá)可明顯降低OD值及S期細(xì)胞比例，并可提高G0-G1期細(xì)胞比例，提示干擾PCAT19表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0-G1期細(xì)胞比例。E-cadherin表達(dá)上調(diào)可抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）從而抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，N-cadherin表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)EMT從而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[13-14]。本研究結(jié)果顯示，干擾PCAT19表達(dá)可明顯減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，促進(jìn)E-cadherin表達(dá)及抑制N-cadherin表達(dá)，提示干擾PCAT19表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲。

本研究結(jié)果證實(shí)PCAT19可靶向結(jié)合miR-137。研究表明miR-137可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖[15]。miR-137通過靶向調(diào)控TCF4而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[16]。miR-137通過靶向調(diào)控SRC3而抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖[17]。本研究結(jié)果顯示前列腺癌組織中miR-137的表達(dá)水平降低，提示miR-137在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮抑癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染si-PCAT19與anti-miR-137可明顯提高細(xì)胞增殖能力，降低G0-G1期細(xì)胞比例，降低S期細(xì)胞比例，并可促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲，還可降低E-cadherin的表達(dá)水平及提高N-cadherin的表達(dá)水平，提示干擾miR-137可明顯逆轉(zhuǎn)干擾PCAT19表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移及侵襲的作用。

綜上所述，PCAT19在前列腺癌中表達(dá)水平升高，而miR-137的表達(dá)水平降低，干擾PCAT19表達(dá)可通過上調(diào)miR-137的表達(dá)從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0-G1期，其可能作為前列腺癌分子治療的潛在靶點(diǎn)。