廖春潔 葉美萍 顧 昕 石 梅 周平玉,*

1.安徽醫(yī)科大學(xué)上海皮膚病臨床學(xué)院（上海 200050）；2.上海市皮膚病醫(yī)院（上海 200050）

淋球菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）、沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，CT）和解脲支原體（Ureaplasma urelyticum，UU）是世界范圍內(nèi)引起性傳播感染的常見病原體[1-2]。沙眼衣原體、解脲支原體和淋球菌感染泌尿生殖系統(tǒng)時(shí)會導(dǎo)致多種癥狀，男性患者出現(xiàn)尿道炎、附睪炎、前列腺炎、不孕癥，女性患者表現(xiàn)為陰道炎、宮頸炎、輸卵管炎、子宮內(nèi)膜炎、異位妊娠、不孕等，而且女性患者癥狀常隱匿，若不治療或治療不當(dāng)可通過垂直傳播導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、早產(chǎn)、新生兒結(jié)膜炎、新生兒肺炎等后果，嚴(yán)重危害孕產(chǎn)婦及新生兒的健康[3-5]。臨床上能夠采用快速、敏感、特異性高的檢測技術(shù)對沙眼衣原體、解脲支原體和淋球菌感染進(jìn)行診斷十分重要。

性病病原體常見的檢測方法有病原體培養(yǎng)、特異性抗原抗體檢測、涂片鏡檢、血清學(xué)試驗(yàn)及分子檢測等，各種方法各有其利弊，某些檢測方法存在結(jié)果判讀主觀性強(qiáng)（解脲支原體培養(yǎng)），靈敏度低（乳膠法檢測沙眼衣原體），一些病原體（如沙眼衣原體）存在培養(yǎng)困難、培養(yǎng)操作復(fù)雜、臨床不易實(shí)現(xiàn)等問題[6]，影響臨床的及時(shí)診斷和治療。熒光定量PCR技術(shù)是近30年來具有革命性的檢測技術(shù)，有研究顯示該方法對生殖道分泌物樣本檢測具有高靈敏度，并且檢測周期短、特異性強(qiáng)、可以進(jìn)行定量分析，但無法判斷病原菌的耐藥是其缺陷[7-8]。為了探究不同檢測方法對沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體檢測的優(yōu)劣性，本研究采用PCR熒光探針法對本院2018年8月-2020年8月性病門診采集的生殖道分泌物中的沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體進(jìn)行檢測，并與相應(yīng)的乳膠法及培養(yǎng)法的結(jié)果進(jìn)行比較，探究不同檢測方法對分泌物中沙眼衣原體、淋球菌及解脲支原體的檢出率差異，并分析其對于臨床的意義。

材料和方法

一、研究對象

選取2018年8月到2020年8月就診于上海市皮膚病醫(yī)院性病科門診疑似泌尿生殖道感染的患者。

二、泌尿生殖道分泌物樣本采集

（一）男性樣本采集：使用無菌拭子輕柔伸入尿道2~3 cm處輕輕轉(zhuǎn)動拭子取出分泌物；（二）女性樣本采集：使用無菌拭子插入宮頸口1~2 cm內(nèi)旋轉(zhuǎn)數(shù)次并停留數(shù)秒后取出。將取樣后的拭子按檢測要求浸入無菌生理鹽水和置入培養(yǎng)基中保存。（所有患者均在抗生素治療前進(jìn)行采樣）

三、主要試劑及儀器

沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體的PCR熒光探針試劑盒購自上?？迫A生物工程有限公司；解脲支原體檢測（培養(yǎng)法）試劑盒購自珠海迪爾生物工程有限公司；衣原體抗原檢測（乳膠法）試劑盒購自杭州艾博生物醫(yī)藥有限公司；Thayer-Martin選擇性瓊脂基礎(chǔ)（MTM瓊脂基礎(chǔ)）培養(yǎng)基購自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司。PCR儀器：ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀器。

四、樣本的檢測

（一）PCR熒光探針法

嚴(yán)格按照PCR熒光探針試劑盒說明書進(jìn)行操作，先通過熱裂解法提取分泌物樣本中病原微生物的DNA，以其作為模板，進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：50℃UNG酶處理2 min，93℃預(yù)變性2 min；93℃變性10 s，60℃退火、延伸及檢測熒光30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)完成后，讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陽性結(jié)果為樣本循環(huán)域值(cycle threshold，Ct)≤37，而Ct無數(shù)值或>40為陰性結(jié)果，若樣本閾值37

（二）沙眼衣原體抗原檢測法（乳膠法）

沙眼衣原體采用抗原檢測法（乳膠法）試劑盒進(jìn)行檢測。按照說明書進(jìn)行操作，在分泌物樣本中加入標(biāo)本處理液A 8滴，混勻后再滴加標(biāo)本處理液B 8滴，待混勻樣本充分裂解后滴入反應(yīng)板加樣孔內(nèi)，10~20min后觀察結(jié)果。陽性結(jié)果為質(zhì)控區(qū)和反應(yīng)區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶；僅在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)紅色條帶則為陰性結(jié)果。

（三）淋球菌檢測（培養(yǎng)法）

將采集的分泌物標(biāo)本立即分區(qū)接種至MTM瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，將平皿置于35℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48~72小時(shí)，觀察細(xì)菌的生長。挑取圓形、稍凸、濕潤光滑、直徑為0.5~1mm、半透明或灰白色菌落，分別進(jìn)行涂片革蘭氏染色和氧化酶試驗(yàn)。陽性結(jié)果為：革蘭氏染色后鏡下可見革蘭氏染色陰性腎形雙球菌以及氧化酶試驗(yàn)為陽性。

（四）解脲支原體檢測（培養(yǎng)法）

解脲支原體檢測（培養(yǎng)法）試劑盒進(jìn)行檢測。試劑盒使用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法，接種生殖器分泌物樣本后，置37℃培養(yǎng)24~48 h。當(dāng)酚紅指示劑由黃轉(zhuǎn)紅，表示有解脲支原體生長，判為陽性；若指示劑仍為黃色則判為陰性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每種病原菌不同檢測方法檢出率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PCR熒光探針法與乳膠法檢測生殖道分泌物中沙眼衣原體的結(jié)果比較

共采集587例患者的生殖道分泌物同時(shí)用于沙眼衣原體的PCR熒光探針法和乳膠法檢測，其中男性289名，女性298名?；颊咂骄挲g為36.4±10.7歲。PCR熒光探針法對沙眼衣原體的陽性檢出率為11.9%（70/587），顯著高于乳膠法2.9%(17/587)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。對性別和不同年齡組的檢出結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示男性和女性中PCR熒光探針法對沙眼衣原體的陽性檢出率均明顯高于乳膠法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；各年齡組PCR熒光探針法的檢出率也均高于乳膠法，除>40歲年齡組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，其他年齡組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。其中＜20歲組樣本較少，因此未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見表1。

表1 PCR熒光探針法與乳膠法檢測沙眼衣原體結(jié)果的比較

二、PCR熒光探針法與培養(yǎng)法檢測生殖道分泌物中淋球菌的結(jié)果比較

共采集609例患者的生殖道分泌物用于淋球菌的PCR熒光探針法和培養(yǎng)法檢測，其中男性308名，女性301名。609例患者的平均年齡為36.4±10.8歲，范圍16~74歲。PCR熒光探針法對淋球菌的陽性檢出率9.0%(55/609)略高于培養(yǎng)法7.4%(45/609)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。同時(shí)在性別及各年齡段分組中PCR熒光探針法的檢出率都略高于培養(yǎng)法，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。其中<20歲組樣本較少，未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見表2。

表2 PCR熒光探針法與培養(yǎng)法檢測淋球菌結(jié)果的比較

三、PCR熒光探針法與培養(yǎng)法檢測生殖道分泌物中解脲支原體的結(jié)果比較

共采集1022例患者的生殖道分泌物用于解脲支原體的PCR熒光探針法和培養(yǎng)法檢測，其中男性503名，女性519名。1022例患者的平均年齡為36.4±10.8歲，范圍14~75歲。PCR熒光探針法對解脲支原體的陽性檢出率為44.9%（459/1022）高于培養(yǎng)法40.0%（409/1022）,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同性別及各年齡段分組中PCR熒光探針法的檢出率都略高于培養(yǎng)法，但差異只在男性組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在其他組中差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。其中＜20歲組樣本較少，因此未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，見表3。

表3 PCR熒光探針法與培養(yǎng)法檢測解脲支原體結(jié)果的比較

討 論

淋球菌、沙眼衣原體和解脲支原體是引起泌尿生殖道感染的主要病原體，其感染生殖道后可引起多種生殖道癥狀，在男性患者中可引起尿道炎和附睪炎，女性患者可出現(xiàn)盆腔炎和宮頸炎等，但大部分女性患者感染后，其臨床過程常隱匿、癥狀輕微，不易引起重視，耽誤治療，致使病情遷延，可能會發(fā)展為不孕癥、異位妊娠和慢性盆腔疼痛等嚴(yán)重后果[9-11]。因此，臨床上采用適合的檢測方法對性病病原體進(jìn)行準(zhǔn)確診斷并指導(dǎo)臨床合理用藥，對阻止病情遷延十分重要。

臨床上對于沙眼衣原體的檢測主要包括乳膠法和PCR熒光探針法，乳膠法檢測沙眼衣原體操作簡單、快捷，但敏感性不足，實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果顯示PCR探針法對沙眼衣原體的陽性檢出率明顯高于乳膠法（9.95%vs4.21%）[12]，我們的研究結(jié)果也顯示,PCR熒光探針法對于沙眼衣原體的檢出率顯著高于乳膠法（11.9%vs2,9%），PCR探針法可以很大程度上提高沙眼衣原體的陽性檢出率，避免患者漏診，所以在臨床上建議采用PCR熒光探針法對沙眼衣原體進(jìn)行檢測；淋球菌和解脲支原體的檢測主要采用培養(yǎng)法和PCR熒光探針法，培養(yǎng)法是病原體檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，培養(yǎng)法檢測淋球菌及解脲支原體具有高度的特異性，同時(shí)可以進(jìn)行病原菌耐藥性分析，但培養(yǎng)法也存在培養(yǎng)時(shí)間長，培養(yǎng)結(jié)果受到標(biāo)本采集、運(yùn)送、保存等因素的影響，出現(xiàn)假陰性[13]，有研究顯示PCR熒光探針法對淋球菌的陽性檢出率高于培養(yǎng)法（6.64%vs4.16%），對解脲支原體的檢出率與培養(yǎng)法相近(37.6%vs36.8%)[14]，本研究結(jié)果顯示PCR熒光探針法對淋球菌的陽性檢出率略高于培養(yǎng)法(9.0%vs7.4%)，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但我們的結(jié)果出現(xiàn)10例PCR熒光探針法結(jié)果陽性而培養(yǎng)法陰性的病人，PCR探針法在檢測隱匿感染和癥狀不明顯的淋病患者時(shí)優(yōu)于培養(yǎng)法[12]；PCR熒光探針法對解脲支原體的陽性檢出率高于培養(yǎng)法（44.9%vs40.0%），有研究顯示解脲支原體可以引起女性不孕[15],但也有研究顯示解脲支原體可能是條件致病菌，因此盡管解脲支原體培養(yǎng)法有結(jié)果判讀主觀性強(qiáng)的缺點(diǎn)，但依據(jù)核酸陽性（PCR探針法檢測）來治療解脲支原體感染可能存在過度治療和抗菌素濫用[16]。目前臨床已經(jīng)廣泛應(yīng)用PCR熒光探針法檢測沙眼衣原體、解脲支原體和淋球菌，PCR熒光探針法檢測病原體具有特異性高、敏感性強(qiáng)、檢測周期短和污染概率小等優(yōu)勢[17-18]，但該方法無法對病原菌進(jìn)行藥物敏感性分析，不能指導(dǎo)臨床合理用藥，無法完全替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，淋球菌對于抗菌藥物的耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，多重耐藥菌的出現(xiàn)已經(jīng)引起公共衛(wèi)生的重視[19]，解脲支原體耐藥也同樣受到臨床關(guān)注[20],故采用能夠進(jìn)行耐藥分析的培養(yǎng)法對淋球菌和解脲支原體進(jìn)行檢測對臨床選擇正確的治療方法具有十分重要的意義。

值得注意的是，我們對不同年齡段性病病原體感染情況進(jìn)行分析，不考慮性別因素，結(jié)果顯示患者主要集中在20~40歲年齡段，該年齡層的人群正處于性活躍期，不及時(shí)治療會增加性病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)該年齡的人群正處于生育階段，沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體的感染都可能會導(dǎo)致患者不孕不育及增加不良妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，所以能夠早期準(zhǔn)確診斷、及時(shí)有效治療、避免并發(fā)癥尤為重要。PCR探針法檢測生殖道分泌物中的沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體時(shí)，不僅可以提高病原菌的陽性檢出率，同時(shí)可以做到一支采樣拭子同時(shí)檢測多種病原體，減少了男性患者多次采樣的痛苦,對隱匿感染的女性也具有重要的篩查意義，是一種值得推薦的性病病原體檢測方法，對于考慮淋球菌或解脲支原體感染的患者時(shí)，需增加培養(yǎng)法同時(shí)檢測，根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，指導(dǎo)臨床準(zhǔn)確用藥，提高治療效果，避免不孕不育、不良妊娠等嚴(yán)重結(jié)局的發(fā)生。