馬 帥 陳 穎 齊 濤 李世雄 楊文濤 陳 俊**

1.廣西壯族自治區(qū)南寧市廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院（廣西南寧 530200）

2.廣東省廣州市中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院不育與性醫(yī)學(xué)科（廣東廣州 510631）

3.廣西壯族自治區(qū)南寧市廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院男性科（廣西南寧 530012）

糖尿病性勃起功能障礙（diabetic erectile dysfunction,DED）是糖尿病最主要的并發(fā)癥之一，是難治性ED，嚴(yán)重影響著患者及其配偶的生活質(zhì)量和心理健康[1]。盡管目前ED的治療方法有很多，如口服PDE-5抑制劑、陰莖海綿體藥物注射以及假體植入等，但治療DED的效果均欠佳，究其原因在于DED的發(fā)病機(jī)制不清[2,3]。因此，研究DED的發(fā)病機(jī)制，探索新的、有效的DED治療方法迫在眉睫。

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，對基因芯片數(shù)據(jù)的挖掘和利用已成為生物醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)，為DED的基礎(chǔ)研究提供了新的思路[4,5]。研究表明，DED的發(fā)生和發(fā)展與陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞受損密切相關(guān)[6]。本研究擬對模擬血糖紊亂病理狀況下的小鼠陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜RNA-seq測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行GO功能富集分析，篩選核心差異基因，以期為DED治療開發(fā)新的藥物靶點(diǎn)提供思路和理論基礎(chǔ)。

材料方法

一、芯片數(shù)據(jù)的選擇與分析

在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索編號(hào)為GSE146078的芯片表達(dá)譜為研究對象。該芯片是模擬持續(xù)高糖環(huán)境導(dǎo)致陰莖內(nèi)皮細(xì)胞損傷，正常（5 mmol/LD-葡萄糖）對照組和高糖（30 mmol/LD-葡萄糖）處理72小時(shí)組的小鼠陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜RNAseq測序數(shù)據(jù)[7]。采用檢測平臺(tái)GPL17021，使用Illumina HiSeq 2500(Mus musculus)進(jìn)行測序，利用R語言工具包edgeR和DEseq2對表達(dá)矩陣進(jìn)行歸一化分析，并進(jìn)行差異分析，|log FC|＞0.80和P＜0.05。

二、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過STRING（https://string-db.org/）將篩選到的差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證。限制物種為小鼠，所使用的參數(shù)閾值為中度可信數(shù)據(jù)：0.400，使用的相互作用類型包括7種（Textmining，Experiments，Databases，Co-expression，Neighborhood，Gene Fusion，Co-occurrence）。

三、差異基因的GO和KEGG富集分析

使用R軟件的clusterProfiler包和reactome（https://reactome.org/）對篩選的差異基因進(jìn)行GO富集分析和通路富集分析；使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）對差異基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。設(shè)置P<0.05，分析結(jié)果以氣泡圖展示。

四、核心差異基因分析

利用Cytoscape的Hub插件分析核心基因，限定物種為小鼠，獲取蛋白相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用cytoHubba插件分析節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示Degree值的大小，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越紅對應(yīng)的Degree值越大。

結(jié) 果

一、陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞高糖處理損傷芯片分析

GSE146078芯片中初始數(shù)據(jù)共檢測覆蓋了23282個(gè)基因，其中20296個(gè)基因表達(dá)矩陣滿足初篩要求（總計(jì)數(shù)counts>1，即至少在其中一個(gè)樣本有表達(dá)）。經(jīng)過R語言工具包edgeR和DEseq2對表達(dá)矩陣進(jìn)行歸一化分析，并進(jìn)行差異分析，最終得到了17139個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。其中總的差異基因?yàn)?67個(gè)，包含有150個(gè)上調(diào)以及217個(gè)下調(diào)基因（圖1）。

圖1 小鼠陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞高糖處理損傷芯片分析的火山圖（A）和熱圖（B）

二、高糖處理后內(nèi)皮細(xì)胞差異基因通路富集分析

通過STRING在線分析工具對差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證，最終得到的相互作用網(wǎng)中包含結(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)332個(gè)、邊界數(shù)505條、平均結(jié)點(diǎn)度為3.04、平均聚類系數(shù)0.415、期待的邊界數(shù)據(jù)為243（圖2）。

圖2 差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

在此基礎(chǔ)上對差異基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示差異基因的分子功能主要集中在細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體調(diào)控活性等過程（圖3A）。細(xì)胞組分富集分析發(fā)現(xiàn)其主要在細(xì)胞外胞質(zhì)空間、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物（圖3B）。生物學(xué)功能通路富集可以發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在炎癥反應(yīng)通路極顯著的富集，如急性時(shí)相反應(yīng)、急性炎癥應(yīng)答、白細(xì)胞遷移、白細(xì)胞趨化以及促炎癥因子白介素-1的應(yīng)答等。同時(shí)也有一些代謝調(diào)控通路發(fā)生變化，如活性氧的代謝過程、氮氧化物的合成過程等（圖3C）。進(jìn)一步進(jìn)行Reactome相互作用組的富集分析，則發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要富集在DNA損傷過程，如DNA碎片化激活因子、凋亡誘導(dǎo)的DNA碎片化等（圖3D）。

圖3 差異基因的GO富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果如圖4所示，上調(diào)基因主要富集在細(xì)胞色素P450對異生物質(zhì)（xenobiotics）的代謝、類固醇激素的合成、谷胱甘肽代謝、軍團(tuán)菌病、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、血清素能突觸、沙門氏菌感染、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、藥物代謝、IL-17信號(hào)通路以及化學(xué)致癌作用（圖4）。下調(diào)基因富集結(jié)果顯示其與Hippo通路相關(guān)（圖5）。

圖4 上調(diào)表達(dá)差異基因的KEGG通路富集分析

圖5 下調(diào)表達(dá)差異基因的KEGG通路富集分析

三、高糖處理后內(nèi)皮細(xì)胞核心差異基因分析

利用Cytoscape的Hub插件分析發(fā)現(xiàn)，高糖處理小鼠陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞差異基因中有兩個(gè)關(guān)鍵基因群，圖6左側(cè)為炎癥應(yīng)答為代表的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（代表的細(xì)胞因子有上調(diào)表達(dá)基因Ccl19、Cxcl1、IL-6和下調(diào)表達(dá)基因Cxcl12；代表的轉(zhuǎn)錄因子有下調(diào)表達(dá)基因Sox9等），右側(cè)基因群為結(jié)合DNA的組蛋白家族可能在DNA損傷凋亡以及片段化時(shí)期發(fā)生的變化（代表有上調(diào)表達(dá)基因Hist1h4d）（圖6）。我們在差異基因中發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因家族特征性表達(dá)，如鋅指蛋白Zscan4（Zinc finger and SCAN domain containing 4）家族的Zscan4b、Zscan4c、Zscan4d；谷 胱 甘 肽S-轉(zhuǎn) 移 酶GSTA（Glutathione S-Transferase Alpha）家族Gsta1、Gsta3以及Gsta4；細(xì)胞色素P450家族成員CYP2D包括Cyp2d10、Cyp2d11、Cyp2d12、Cyp2d13、Cyp2d34、Cyp2d37-ps、Cyp2d40以及Cyp2d9；血清淀粉樣蛋白A（Serum amyloid A,Saa）家 族Saa1、Saa2、Saa3，且Saa1、Saa2、Saa3均顯著上調(diào)表達(dá)（圖7）。核心差異基因中，Cxcl12、IL-6等已被證明參與ED進(jìn)展[8,9]，Zscan4家族、GSTA家族及P450家族成員在內(nèi)皮細(xì)胞中的功能作用均未見報(bào)道，而Saa家族成員被發(fā)現(xiàn)與內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)等相關(guān)疾病過程密切相關(guān)[10,11]，但其在DED中的作用目前尚未見報(bào)道。因此，本研究將對Saa家族成員與DED的關(guān)聯(lián)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖6 高糖處理后內(nèi)皮細(xì)胞通路核心差異基因分析

圖7 高糖處理后內(nèi)皮細(xì)胞中

四、Saa家族相關(guān)蛋白質(zhì)分析

Saa1-3均定位于細(xì)胞外，屬于分泌型蛋白質(zhì)[12]。我們經(jīng)過STRING（https://string-db.org/）搜索得到Saa家族相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其與多個(gè)載脂蛋白或者脂相關(guān)蛋白有關(guān)聯(lián)。其中包括載脂蛋白Lcn2（Lipocalin-2）、血清類粘蛋白Orm2（Orosomucoid 2）、激素原轉(zhuǎn)化酶1抑制劑Pcsk1n（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 1 inhibitor）、氧磷脂酶1Pon1（Paraoxonase 1）及載脂蛋白（Apolipoprotein）家族多個(gè)成員Apoa1，Apoa2，Apoc3，Apoe（圖8）。

圖8 STRING分析Saa家族相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

五、Saa家族功能富集分析

GO分析結(jié)果顯示Saa家族基因的分子功能主要集中在包括脂酶活性，熱休克蛋白結(jié)合，脂蛋白顆粒結(jié)合，磷脂結(jié)合等過程（9A）。其生物學(xué)功能主要富集于甘油三脂的代謝，膽固醇代謝，膽固醇內(nèi)流，脂解反應(yīng)，脂蛋白代謝等過程（9B）。其細(xì)胞組分主要集中在極低密度脂蛋白，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白，細(xì)胞外胞質(zhì)等（9C）。KEGG分析發(fā)現(xiàn)其主要參與PPAR信號(hào)通路以及膽固醇代謝（9D）。

討 論

ED在糖尿病患者中的發(fā)病率是普通人群的3~4倍，在診斷為糖尿病后的前10年，超過一半的男性確診為DED，為患者和其家庭帶來巨大痛苦[13]。然而，由于DED發(fā)病機(jī)制尚未闡明，臨床上缺乏針對該病的特效藥物以及有效的治療靶點(diǎn)。近年來，隨著微陣列和測序技術(shù)的快速發(fā)展，基因芯片數(shù)據(jù)分析已被廣泛應(yīng)用于研究多種疾病的發(fā)生發(fā)展以及靶基因的篩選等。如，Chen等[14]分析3個(gè)包含子宮內(nèi)膜異位癥組織和正常子宮內(nèi)膜組織的微陣列數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在子宮內(nèi)膜異位癥中具有重要作用；Xue等[15]生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CDC45、GINS2、MCM2和PCNA可能與宮頸癌患者預(yù)后相關(guān)，可作為宮頸癌患者的潛在治療靶點(diǎn)。因此，篩選與DED相關(guān)的靶標(biāo)基因，對于開發(fā)治療DED的靶標(biāo)藥物具有重要意義。

圖9 Saa家族功能富集分析

研究表明，DED的發(fā)生和發(fā)展與陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞受損密切相關(guān)[6]。因此，本研究通過模擬血糖紊亂病理狀況致使陰莖內(nèi)皮細(xì)胞損傷的芯片數(shù)據(jù)，利用GPL17021檢測平臺(tái)篩選出正常組小鼠和高糖條件處理組小鼠之間的差異基因分析，共發(fā)現(xiàn)367個(gè)差異表達(dá)基因，對這些差異基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示這些差異表達(dá)基因主要涉及急性炎癥答應(yīng)、活性氧化的代謝、DNA損傷等生物學(xué)過程，與已報(bào)道的炎癥因子及活性氧參與DED的結(jié)果一致。如炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-1β含量降低可以有效改善糖尿病大鼠勃起功能[16]；血漿IL-8（sIL-8）水平與男性不育和ED有密切聯(lián)系[17]；抑制大鼠海綿體中活性氧（ROS）的產(chǎn)生可以緩解ED進(jìn)展[18]。KEGG分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因富集通路在細(xì)胞色素P450對異生物質(zhì)（xenobiotics）的代謝、類固醇激素的合成、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、藥物代謝和IL-17信號(hào)通路等。其中IL-17信號(hào)通路與內(nèi)皮細(xì)胞病理功能相關(guān)，如IL-17影響肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，血管新生以及細(xì)胞黏附[19]；其它如類固醇激素對內(nèi)皮細(xì)胞功能也有維持作用[20]。下調(diào)基因與Hippo通路相關(guān)，Hippo通路的關(guān)鍵因子如YAP能夠調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞激活并參與血管炎癥反應(yīng)[21]。

在高糖誘導(dǎo)陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)基因分析中發(fā)現(xiàn)，其核心差異網(wǎng)絡(luò)中包括多個(gè)細(xì)胞因子如Ccl19、Cxcl1、Cxcl12、IL-6等；轉(zhuǎn)錄因子Sox9等；及Zscan4家族、GSTA家族、Saa家族成員等。據(jù)報(bào)道，基因工程改造后表達(dá)Cxcl12的間充質(zhì)干細(xì)胞改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠ED癥狀[8]；抑制IL-6可減輕神經(jīng)保留性根治性前列腺切除術(shù)大鼠模型的勃起功能障礙[9]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，Saa家族成員Saa1-3在高糖誘導(dǎo)的小鼠海綿體內(nèi)皮細(xì)胞中均顯著上調(diào)表達(dá)，提示Saa家族可能在DED過程中具有重要作用。

Saa即血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A），是炎癥性載脂蛋白家族，定位于細(xì)胞外，是一種分泌型蛋白質(zhì)，屬于急性期反應(yīng)過程中血清蛋白的降解與調(diào)控基因群，可引起全身系統(tǒng)性炎癥[12,22]。大量研究證明，Saa家族在內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)等相關(guān)疾病過程具有重要作用，如，Saa能夠增強(qiáng)人頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖，并增加內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成[10]；IL-1β可以誘導(dǎo)人類冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中Saa的表達(dá)，最終加速冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[11]等。然而，其與DED的關(guān)聯(lián)尚未見報(bào)道。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其與Lcn2、Orm2、Pcsk1n、Pon1及Apo家族成員等多個(gè)載脂或者脂相關(guān)蛋白質(zhì)有關(guān)聯(lián)。GO和KEGG功能富集分析結(jié)果也顯示其主要集中于低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、細(xì)胞外胞質(zhì)等，參與脂蛋白顆粒結(jié)合、脂解反應(yīng)，膽固醇代謝、脂蛋白代謝等過程。據(jù)報(bào)道，脂質(zhì)代謝的異常與ED存在密切關(guān)聯(lián)，脂質(zhì)代謝混亂和氧化應(yīng)激都是DED的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[23,24]。部分研究表明，Pon1活性的降低可能與ED的致病性有關(guān)，并且由于抗動(dòng)脈粥樣硬化酶Pon1的活性降低，患者的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展可能更快[25]；Apoe缺失會(huì)引起小鼠海綿體鈣化，最終導(dǎo)致小鼠勃起功能障礙的發(fā)生[26]。而本研究分析結(jié)果顯示Saa家族與脂相關(guān)蛋白存在相互作用，提示Saa家族可能通過載脂或者脂相關(guān)蛋白質(zhì)參與DED的發(fā)生和發(fā)展過程。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)正常組小鼠和高糖條件處理組小鼠之間的差異基因基因主要涉及急性炎癥答應(yīng)、活性氧化的代謝過程、DNA損傷過程等生物學(xué)過程。核心差異基因中Saa1-3在高糖處理后小鼠陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞中顯著上調(diào)表達(dá)，可能是DED過程中的重要基因，Saa1-3與多個(gè)載脂蛋白或者脂相關(guān)蛋白有關(guān)聯(lián)，并涉及脂解反應(yīng)，膽固醇代謝、脂蛋白代謝等過程。這對我們揭示DED發(fā)病機(jī)制以及藥物靶點(diǎn)研究提供了重要的理論參考。然而，Saa家族對DED的發(fā)生和發(fā)展過程是否具有重要的作用，有待進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。