翟新宇 談鳴岳 葛旻垚 萬 眾 徐東亮

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院泌尿中心（上海 201203）

糖尿病性勃起功能障礙（diabetic erectile dysfunction,DED）是糖尿?。╠iabetes mellitus,DM）常見的慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為陰莖不能達到或維持足夠的勃起以完成滿意的性生活，病程在3個月以上。中國是DM第一大國，70%的DM男性患者都會引發(fā)不同程度的勃起功能障礙（erectile dysfunction,ED）[1]。正常人群的ED發(fā)病率僅為18%，而DM人群的ED發(fā)病率是正常人群的4倍，發(fā)病時間較正常人群要早10年，并隨著年齡的增長和DM病程的延長發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[2-3]。DED的發(fā)生嚴重影響患者的生活質(zhì)量、心理健康及夫妻感情，甚至影響社會的和諧穩(wěn)定。因此，積極治療DED具有重要的臨床意義。

幾千年來，中醫(yī)藥一直被用來治療一系列疾病。由于中醫(yī)藥療效顯著，副作用小，已被世界各地越來越多的人所認可[4]。右歸丸是由明代著名醫(yī)學家、溫補學派創(chuàng)始者張仲景所創(chuàng)，由附子、肉桂、鹿角膠、熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、當歸、杜仲、菟絲子10種中草藥組成。該方劑具有“滋陰補腎、填精止遺”的功效，先前的臨床研究證實，右歸丸具有良好的改善糖尿病性勃起功能障礙的作用[5]。然而，對于右歸丸治療糖尿病性勃起功能障礙的作用機制尚不清楚，其主要成分和關(guān)鍵靶點的藥效學性質(zhì)尚待確定。

網(wǎng)絡(luò)藥理學可以通過不同層次的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建系統(tǒng)地揭示藥物作用靶點與疾病靶點之間的關(guān)系，從微觀層面觀察復雜藥物對多靶點疾病的干預和影響[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學研究策略的整體性、系統(tǒng)性與中醫(yī)的整體理念和辨證論治理論不謀而合，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代醫(yī)學解讀提供了一條新穎的路徑[7]。鑒于臨床獲得右歸丸治療DED患者海綿體樣本的倫理局限性，我們采用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法篩選右歸丸中各單味藥的活性成分及作用靶點，檢索已知的DED相關(guān)靶點，對右歸丸干預DED的潛在關(guān)鍵作用靶點的生物功能進行預測，并分析其作用通路，為揭示右歸丸的科學內(nèi)涵和進一步挖掘右歸丸其他臨床應用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、右歸丸活性成分篩選及潛在作用靶點預測

本研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和TCMID數(shù)據(jù)庫(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)收集右歸丸中各味中藥相關(guān)的活性成分,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為篩選標準[7]，得到符合條件的活性成分靶點信息。

二、疾病靶點的預測

登錄GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和OMIM數(shù) 據(jù) 庫（https://omim.org/），以“糖 尿 病性勃起功能障礙”為關(guān)鍵詞，檢索篩選出疾病相關(guān)基因，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）進行確認并轉(zhuǎn)換后，剔除重復靶標，整理成DED疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

三、中藥活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將中藥活性成分相關(guān)靶點與疾病相關(guān)靶點取交集，通過韋恩圖將其可視化，并利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

四、PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心靶點的篩選

將得到交集基因的信息導入在線數(shù)據(jù)庫STRING（http://string-db.org/），篩選最小相關(guān)分數(shù)大于0.4的節(jié)點，去除無關(guān)聯(lián)的單個節(jié)點，獲得的剩余節(jié)點及關(guān)系導入Cytoscape3.7.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過計算每個節(jié)點的degree值篩選出核心靶點。

五、靶點基因生物信息富集分析

將右歸丸作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://DAVID.ncifcrf.gov），限定物種為人，進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，篩選P<0.05的生物過程及信號通路，取排名前20條信號通路用R包（ggplot2）繪圖將其可視化。

六、基因-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為進一步篩選出明顯富集在通路中的核心作用靶基因，利用Cytoscape3.7.2構(gòu)建基因-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

圖1 右歸丸治療DED的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析流程圖

結(jié) 果

一、右歸丸活性成分及作用靶點信息收集

通過TCMSP、TCMID平臺檢索符合標準的右歸丸活性成分，剔除重復值后共86個。其中附子有效成分6個，作用靶點20個，當歸有效成分2個，作用靶點53個，杜仲有效成分23個，作用靶點216個，枸杞子有效成分35個，作用靶點208個，鹿茸膠有效成分1個，作用靶點4個，肉桂有效成分1個，作用靶點19個，山藥有效成分12個，作用靶點80個，山茱萸有效成分14個，作用靶點70個，熟地黃有效成分2個，作用靶點31個，菟絲子有效成分10個，作用靶點222個，將所獲得的活性成分預測靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫進行基因標準化，去除重復值，共得到作用靶點基因227個。

二、糖尿病性勃起功能障礙靶點的收集

使用GenCards數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)靶點784個，OMIM數(shù)據(jù)庫獲得295個，刪除重復值，合并后共收集到DED潛在靶基因1061個。

三、中藥-疾病交集基因韋恩圖

計算得到右歸丸與DED交集靶點78個，說明右歸丸可能通過以上78個靶點作用于DED，并用R包繪圖將其可視化，見圖2。

圖2 藥物-疾病交集基因韋恩圖

四、中藥-活性成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)分析

將78個作用靶點所對應的中藥活性成分，運用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建中藥-活性成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)（見圖3），網(wǎng)絡(luò)中共有152個節(jié)點和365條邊，包含74種活性成分，78個作用靶點，每條邊表示化合物和靶點之間的相互作用關(guān)系。經(jīng)過和核心靶基因?qū)Ρ群Y選，獲得degree值排名前五的核心中藥活性成分信息及對應靶點數(shù)目，見表1。

圖3 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

表1 核心中藥活性成分信息及對應靶點數(shù)目

五、PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將得到交集基因的信息導入在線數(shù)據(jù)庫STRING，篩選minimum required interaction score大于0.4的節(jié)點，去除無關(guān)聯(lián)的單個節(jié)點，獲得的剩余節(jié)點及關(guān)系導入Cytoscape3.7.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。得到的網(wǎng)絡(luò)圖由77個節(jié)點和737條邊組成；進一步按degree值進行篩選，根據(jù)“右歸丸-活性化合物-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)與PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵作用靶點相互映射，推測右歸丸的有效成分可能通過VEGFA（degree值51）、IL-6（degree值50）、CASP3（degree值44）、NOS3(degree值39)、IL-1β(degree值38)這5個核心靶點發(fā)揮改善糖尿病性勃起功能障礙的作用，見圖4。

圖4 右歸丸核心蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖

六、GO功能富集與KEGG通路富集分析

將得到78個作用靶點通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO與KEGG富集分析，共有1509條生物功能顯著富集（P＜0.05），見圖5。1332個在生物過程（BP）中富集，75個在細胞成分（CC）中富集，100個在分子功能（MF）中富集。選擇排名前20的GO中條目繪制柱狀圖，主要涉及抗菌反應、脂多糖反應、細菌分子反應、活性氧水平反應、第二信使介導信號轉(zhuǎn)導、乙醇反應、G蛋白-偶聯(lián)第二信使環(huán)核苷酸受體信號通路等生物過程。細胞成分（CC）主要有：膜筏、膜微域、膜區(qū)、神經(jīng)元胞體等。分子功能（MF）為：G蛋白-偶聯(lián)胺受體活性、細胞因子受體結(jié)合、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、銨離子結(jié)合、核受體活性等。KEGG通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，富集靶基因數(shù)目較多，且具有較大意義的通路為：神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物-受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化信號通路、鈣信號通路等，見圖6。

圖5 GO分析得出的排名前二十條目的BP、CC、MF氣泡圖

圖6 KEGG富集分析前二十條信號通路

七、基因-通路網(wǎng)絡(luò)分析

將排名前20的KEGG通路信息和相應富集在這些信號通路上的基因?qū)隒ytocape3.7.2軟件構(gòu)建基因-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖7。網(wǎng)絡(luò)包含70個節(jié)點，203條邊，其中富集基因50個，信號通路20條。將這些節(jié)點進行分析，degree值越大，圖形面積越大，代表目標基因或通路在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用越大。

圖7 富集基因-KEGG信號通路圖

討 論

糖尿病性勃起功能障礙是在糖尿病進展過程中出現(xiàn)的一種慢性并發(fā)癥，并隨著病程的延長，發(fā)病率呈上升趨勢。DED的發(fā)病機制復雜，涉及多基因、多靶點的病理機制，目前主要學說涉及神經(jīng)病變、血管內(nèi)皮細胞病變、雄激素水平改變等[8]。一線治療主要為口服西地那非，但有增加心腦血管意外的風險。近年來，中醫(yī)藥治療DED的研究逐漸增多，因其安全性高、不良反應小、患者接受度好，在臨床應用上逐漸被認可。

中醫(yī)雖沒有DED的病名，但糖尿病屬中醫(yī)“消渴病”范疇，勃起功能障礙屬“陽痿”范疇，DED可認為是消渴所致陽痿。陽痿病機主要是腎陽虧虛，命門火衰，陰器冷縮，痿而不起。而腎陽不足是源于消渴日久，耗傷真陰，導致腎精虧損。由于陰陽互根互用，病程日久，必陰損及陽，導致腎陰陽兩虛。消渴所致陽痿是以腎陽虛為主要矛盾的陰陽兩虛之證，治療當以溫腎填精、壯陽起痿為主，同時兼顧補腎滋陰。右歸丸是明代著名醫(yī)學家、溫補學派創(chuàng)始者張景岳所創(chuàng)制的陰中求陽代表方。方中用滋陰藥“熟地黃、枸杞子、酒萸肉、山藥、當歸”補養(yǎng)精血以培其本，再配合補陽藥“炮附子、肉桂、鹿角膠、菟絲子、鹽杜仲”溫腎壯陽，諸藥陰陽雙補，陰中求陽，使陽氣得陰生化無窮，可以溫腎填精、壯陽起痿，主治命門火衰之證。右歸丸方證與消渴所致陽痿病機吻合，故中醫(yī)用藥常選用右歸丸治療DED，并佐以臨證加減。

網(wǎng)絡(luò)藥理學從藥物、疾病之間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，采用復雜網(wǎng)絡(luò)模型表達和分析研究對象的藥理學性質(zhì)，為中藥多成分、多途徑和多靶點的作用機制進行整合及闡明，為基礎(chǔ)實驗研究提供方向。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素、Cinchonan-9-al,6'-methoxy-,(9R)-、(-)-Tabernemontanine（丹參堿）、山奈酚、β-谷甾醇可能是右歸丸治療的DED的主要活性成分。其中槲皮素與山奈酚均屬黃酮類化合物，已有多項研究證實[9-10]，黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗心腦血管疾病等藥理活性，有效抑制炎癥及纖維化的進展，在治療糖尿病相關(guān)并發(fā)癥中起到重要作用。其中，槲皮素可以有效降低醛糖還原酶的活性，降低AGE的生成，抑制AGERAGE信號通路引起的糖尿病組織（如糖尿病腎臟、糖尿病心臟）相應的氧化應激、細胞凋亡等病理過程[11]，同時能改善DM-ED模型大鼠的血管內(nèi)皮功能，增加陰莖海綿體血管平滑肌竇壓(ICP)，增強一氧化氮合酶的活性和亞型的表達[12]。山奈酚屬于過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑，具有增強脂肪組織及骨骼肌葡萄糖儲運的作用，能夠提高胰島素敏感性，被廣泛地應用于糖尿病及相應并發(fā)癥的治療。山奈酚可通過調(diào)節(jié)血管活性相關(guān)因子的動態(tài)平衡，從而發(fā)揮對微血管病變的保護作用[13]。β-谷甾醇是動植物細胞膜重要的組成之一，具有抗氧化、抗炎、降血糖等藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)[14]，β-谷甾醇可以有效清除氧自由基，降低細胞內(nèi)過氧化物酶的水平，發(fā)揮抗氧化作用；通過抑制巨噬細胞IL-6活性，減少IL-1、TNF等炎性因子的分泌，起到抗炎的作用。因此，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇可能是右歸丸改善DED的關(guān)鍵成分。

通過對活性成分-疾病靶點分析，根據(jù)度值的大小得出右歸丸與DED相互作用的關(guān)鍵節(jié)點有VEGFA、IL6、CASP3、NOS3、IL1β。VEGF家族是一類多功能的細胞因子，在血管生成中具有重要的調(diào)控作用。在大鼠和人陰莖組織的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中都發(fā)現(xiàn)了VEGF信號傳導途徑[15-16]，在大鼠陰莖海綿體內(nèi)注射VEGF，可以有效改善ED[17-18]。IL-6、IL-1β為兩種炎癥因子，隨著糖尿病病程的延長，組織分泌大量的炎癥介質(zhì)及細胞因子，降低炎癥介質(zhì)及細胞因子對于糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的治療至關(guān)重要。NOS3是內(nèi)皮型一氧化氮合酶，NOS3催化左旋精氨酸產(chǎn)生NO是陰莖勃起的關(guān)鍵物質(zhì)，糖尿病大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)的NOS活性顯著降低且隨糖尿病病程的延長而下降，引起陰莖海綿體局部NO水平降低，導致ED[19-20]。CASP3是細胞凋亡的標志性蛋白，隨著糖尿病病程的進展，患者糖、脂代謝紊亂使全身大動脈發(fā)生粥樣硬化，血管、微血管病變，導致海綿體缺血、缺氧，海綿體平滑肌數(shù)量減少，纖維化程度增加及海綿體細胞凋亡增加，同時發(fā)生陰莖海綿體白膜纖維減少，最終促使DED發(fā)生，眾多研究均已證實細胞凋亡在DED的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演一定角色[21-22]。右歸丸中篩選出的核心成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇均對炎癥因子有不同程度的控制。本研究篩選出來的關(guān)鍵活性成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇可以有效控制氧化應激反應、減輕糖尿病的炎癥反應、降低血管內(nèi)皮細胞凋亡蛋白表達、保護血管內(nèi)皮等功能[23-25]，臨床上可能通過調(diào)控這些關(guān)鍵靶點從而發(fā)揮改善DED的作用。

從GO分析可知，右歸丸可通過對多種生物學過程和和分子功能的調(diào)控來改善DED的發(fā)生發(fā)展，核心靶點主要富集在生物過程（BP）環(huán)節(jié)，其關(guān)聯(lián)的生物過程主要有調(diào)節(jié)參與抗菌反應、脂多糖反應、細菌分子反應、活性氧水平反應等。糖尿病是一種慢性炎癥反應，可以啟動多條信號通路，導致機體氧化應激反應從而引起全身血管炎癥因子釋放增加，進而引起血管平滑肌增生、血管粥樣硬化，血管內(nèi)NO釋放降低，促發(fā)DED的發(fā)生[26-27]。根據(jù)KEGG的富集結(jié)果可知，右歸丸作用于DED的核心靶點主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路。糖尿病引起的神經(jīng)病變是發(fā)生ED的重要原因[28]。自主神經(jīng)病變可以引起陰莖靜脈漏的形成,而周圍神經(jīng)病變可引起神經(jīng)反射傳導障礙,支配陰莖的舒血管腸肽能、膽堿能腎上腺素能神經(jīng)損壞,導致與陰莖勃起有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)濃度改變,最終導致ED。AGE-RAGE信號通路激活可直接滅活NO或間接減少NO生成，增加縮血管因子水平，同時還能引起海綿體組織內(nèi)氧化應激反應，導致血管炎癥因子產(chǎn)生增多、血管內(nèi)皮細胞凋亡，從而引發(fā)ED，抑制該信號通路可有效改善DED[29]。PI3K-AKT信號通路為細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導通路之一，是細胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。該信號通路激活，可有效增加陰莖海綿體平滑肌細胞內(nèi)NO含量，進而改善DED[30-31]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學明確了右歸丸主要通過VEGFA、IL-6、CASP3、NOS3、IL-1β等靶點調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路進而改善DED，但本研究結(jié)果有待于后期進一步實驗驗證。