劉 文，戴秋芳，吳 雁

(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004)

變應(yīng)性鼻炎又稱過(guò)敏性鼻炎，指暴露在吸入性變應(yīng)原下，由免疫球蛋白E (IgE)介導(dǎo)的鼻黏膜炎癥反應(yīng)，癥狀包括噴嚏、鼻黏膜充血、流涕(鼻前或后滴流)及鼻癢[1]。目前全球有9%～42%的成人及兒童患有變應(yīng)性鼻炎，13～14歲的兒童中變應(yīng)性鼻炎的患病率為1.4%～39.7%，并且患病率有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[2]。肌醇需求酶1α(IRElα)是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白反應(yīng)(URP)分支中進(jìn)化最保守的一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感應(yīng)器[3]，在支氣管哮喘、癌癥等多種疾病中處于激活狀態(tài)，但該蛋白與變應(yīng)性鼻炎的相關(guān)性研究較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)醒鼻凝膠滴鼻劑能下調(diào)變應(yīng)性鼻炎豚鼠鼻黏膜及血清中IRElα mRNA的表達(dá)[4]，本研究進(jìn)一步觀察了醒鼻凝膠滴鼻劑對(duì)變應(yīng)性鼻炎豚鼠呼吸區(qū)鼻黏膜形態(tài)及IRE1α表達(dá)的影響，探討其治療變應(yīng)性鼻炎的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1藥物 中藥醒鼻凝膠滴鼻劑(福建省人民醫(yī)院提供，批號(hào)：170703)；布地奈德鼻噴霧劑(雷諾考特，阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)：1703005，規(guī)格：1.28 mg/mL)。

1.2主要試劑 卵清白蛋白、氫氧化鋁(Sigma公司)；兔抗鼠IRE1α多克隆抗體(Santa Ctuz 公司)。

1.3動(dòng)物 60只鼠齡為2～3 個(gè)月的健康普通級(jí)Hartley品系豚鼠，體重350～400 g，雌雄各半，購(gòu)于重慶市璧山區(qū)騰鑫養(yǎng)殖場(chǎng)，合格證號(hào):SCXK(渝) 2017-0010，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》處置實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.4分組、造模及干預(yù)方法 豚鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用簡(jiǎn)單數(shù)字隨機(jī)及性別、體重的分層隨機(jī)法分為空白組、模型組、醒鼻凝膠滴鼻劑低劑量組、醒鼻凝膠滴鼻劑中劑量組、醒鼻凝膠滴鼻劑高劑量組、雷諾考特組，每組10只。 根據(jù)課題前期卵清白蛋白致敏變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型[4]方法造模。于造模第16天開(kāi)始，醒鼻凝膠滴鼻劑低、中、高劑量組給予6.88 mg/kg、13.76 mg/kg、27.52 mg/kg的醒鼻凝膠滴鼻劑滴鼻，雷諾考特組給予20 μg/kg的雷諾考特滴鼻，模型組給予等量生理鹽水滴鼻，均采用微量加樣器雙側(cè)鼻腔滴入，2次/d，連續(xù)11 d。

1.5取材方法

1.5.1鼻黏膜取材 先腹主動(dòng)脈放血，后分離鼻骨前的皮膚，再剖開(kāi)豚鼠雙側(cè)鼻腔，最后取下其鼻中隔，并將分離的兩側(cè)鼻黏膜剪至1 mm3大小，后立即投入液氮，保存在-80 ℃的超低溫冰箱中。

1.5.2肺組織取材 剖開(kāi)處死的豚鼠胸腔，分離其左、右肺下葉，在20 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)壓力下對(duì)肺組織灌注4%的多聚甲醛-PBS液，然后將其切割成2 mm3大小的組織塊，將組織塊經(jīng)浸泡、石蠟包埋固定和冰凍后切片。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1呼吸區(qū)鼻腔黏膜掃描電鏡檢查 采集的豚鼠鼻腔呼吸區(qū)黏膜先經(jīng)戊二醛固定后，再經(jīng)四氧化鋨固定、脫水及環(huán)氧樹(shù)脂包埋，然后進(jìn)行切片、染色等，制成鼻腔呼吸區(qū)黏膜掃描電鏡切片，主要對(duì)呼吸區(qū)鼻黏膜纖毛、黏液腺等情況進(jìn)行觀察。

1.6.2鼻黏膜及肺組織中IRE1α蛋白表達(dá)Western blot法檢測(cè) 采用相應(yīng)試劑盒提取細(xì)胞總蛋白和核蛋白，并對(duì)蛋白定量，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳濃縮分離蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)膜、染色、封閉、一抗二抗依次孵育、顯色、曝光。按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，以凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，將鼻黏膜及肺組織的IRE1α蛋白與同一樣本內(nèi)參 β-actin 的比值作為鼻黏膜及肺組織的IRE1α蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組豚鼠呼吸區(qū)鼻黏膜形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 空白組呼吸區(qū)纖毛柱狀上皮細(xì)胞和無(wú)纖毛柱狀上皮細(xì)胞皆清晰可見(jiàn)，細(xì)胞表面均有微絨毛,纖毛排列整齊、方向一致，中間有數(shù)目不等的黏液腺；模型組呼吸區(qū)纖毛柱狀上皮表面結(jié)構(gòu)有少部分脫落,微絨毛、纖毛缺失，排列混亂，方向不一致，柱狀上皮細(xì)胞之間的間隙增寬,彼此粘集成束狀；醒鼻凝膠滴鼻劑低劑量組柱狀上皮細(xì)胞表面有部分纖毛結(jié)構(gòu),排列較混亂，無(wú)明顯的方向性，部分區(qū)域上皮脫落現(xiàn)象有減輕；醒鼻凝膠滴鼻劑中劑量組柱狀上皮細(xì)胞排列明顯好轉(zhuǎn),較前整齊,細(xì)胞表面可見(jiàn)明顯的再生纖毛,纖毛有明顯的方向性；醒鼻凝膠滴鼻劑高劑量組和雷諾考特組柱狀上皮細(xì)胞排列較整齊,纖毛生長(zhǎng)較好,排列有明顯的方向性,并可見(jiàn)腺體分泌細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 各組豚鼠呼吸區(qū)鼻腔黏膜掃描電鏡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2.2各組豚鼠鼻黏膜和肺組織中IRE1α蛋白表達(dá)情況 模型組豚鼠鼻黏膜和肺組織中IRE1α蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，各給藥組豚鼠鼻黏膜和肺組織中IRE1α蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；鼻黏膜中的IRE1α蛋白表達(dá)水平降低與醒鼻凝膠滴鼻劑給藥濃度呈負(fù)相關(guān)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。 見(jiàn)表1及圖2。

表1 各組豚鼠鼻黏膜和肺組織中IRE1α蛋白表達(dá)水平比較

A為空白組；B為模型組；C為醒鼻凝膠滴鼻劑低劑量組；D為醒鼻凝膠滴鼻劑中劑量組；E為醒鼻凝膠滴鼻劑高劑量組；F為雷諾考特組圖2 Western blot檢測(cè)各組豚鼠鼻黏膜和肺組織中IRE1α蛋白表達(dá)情況

3 討 論

變應(yīng)性鼻炎是常見(jiàn)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，患病率最高的是兒童[5]，且目前很多治療方法效果不甚理想，給患兒健康、生活質(zhì)量及患兒家庭帶來(lái)了嚴(yán)重影響。中醫(yī)藥在治療變應(yīng)性鼻炎方面積累了很多的經(jīng)驗(yàn)，在辨證的基礎(chǔ)上，除了能以口服內(nèi)治法恢復(fù)臟腑功能外，還有外治法調(diào)理氣血或直達(dá)病所[6]，如通過(guò)經(jīng)鼻腔黏膜吸收而發(fā)揮全身或局部作用的鼻腔給藥制劑[7-9]。醒鼻凝膠滴鼻劑為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院治療變應(yīng)性鼻炎的新型溫敏凝膠型院內(nèi)制劑，主要由徐長(zhǎng)卿、蟬蛻、冰片組成，其中徐長(zhǎng)卿祛風(fēng)化濕、消腫止癢；蟬蛻疏散風(fēng)熱、祛風(fēng)鎮(zhèn)痙，作用于鼻腔起到止嚏之用；冰片為佐，取其辛散清熱止痛、通竅止癢之用[10]。陳婧婧等[11]研究證實(shí)，醒鼻溫敏凝膠劑可以通過(guò)糾正血清Th1/Th2細(xì)胞因子的失衡，抑制鼻黏膜局部炎癥免疫反應(yīng)。

鼻黏膜纖毛傳輸系統(tǒng)在呼吸道防御系統(tǒng)中的作用舉足輕重，其主要由纖毛柱狀上皮及其上方的黏液毯構(gòu)成[12]，健康人鼻黏膜柱狀上皮細(xì)胞之間的連接是緊密的，其頂部纖毛分布密集，排列整齊，擺動(dòng)方向一致。本實(shí)驗(yàn)掃描電鏡下觀察健康豚鼠呼吸區(qū)鼻黏膜纖毛整齊，方向一致；變應(yīng)性鼻炎豚鼠呼吸區(qū)纖毛柱狀上皮表面結(jié)構(gòu)有少部分脫落,微絨毛、纖毛缺失，排列混亂，方向不一致，柱狀上皮細(xì)胞之間的間隙增寬,彼此粘集成束狀；醒鼻凝膠滴鼻劑各組豚鼠損傷的纖毛傳輸系統(tǒng)得以一定程度的修復(fù)，醒鼻凝膠滴鼻劑高劑量組纖毛生長(zhǎng)較好，排列有明顯的方向性，并可見(jiàn)腺體分泌細(xì)胞。說(shuō)明醒鼻凝膠滴鼻劑可以改善呼吸區(qū)鼻黏膜的纖毛結(jié)構(gòu)。

氣道炎性反應(yīng)是公認(rèn)的變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制，其炎癥信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過(guò)多種機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中UPR耦聯(lián)[13]，而哺乳動(dòng)物中UPR主要由分子伴侶蛋白和包括肌醇需求酶1(IRE1)的3個(gè)傳感器介導(dǎo)[14]，IRE1是Ⅰ型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，具有絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶活性，也具有核酸內(nèi)切酶的活性。IRE1包括IRE1α和IRE1β，IRE1α表達(dá)于大多數(shù)的組織細(xì)胞，而IRE1β主要存在于腸道的上皮細(xì)胞[15]。IRE1在高等生物中以IRE1α的形式存在，是3個(gè)感受器中最保守的一個(gè)，同時(shí)也具有激酶和核酸內(nèi)切酶雙重酶活性[16]。本實(shí)驗(yàn)中變應(yīng)性鼻炎豚鼠鼻黏膜和肺組織中IRE1α蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白組，證實(shí)模型復(fù)制成功，存在氣道炎性反應(yīng)狀態(tài)；醒鼻凝膠滴鼻劑各劑量組鼻黏膜和肺組織中IRE1α蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組，說(shuō)明醒鼻凝膠滴鼻劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)IRE1α的表達(dá)減輕變應(yīng)性鼻炎氣道炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮治療變應(yīng)性鼻炎的作用。綜上，醒鼻凝膠滴鼻劑可能通過(guò)改善豚鼠呼吸區(qū)鼻黏膜纖毛結(jié)構(gòu)、降低氣道炎性反應(yīng)相關(guān)的鼻黏膜和肺組織中IRE1α蛋白表達(dá)水平發(fā)揮治療變應(yīng)性鼻炎的作用，但其更進(jìn)一步的機(jī)制仍需更多的研究去證實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。