張淑華，官學(xué)蘋，阮奇軍，周桂海，鄭銀海，遲宏罡，2

(1. 廣東醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523000；2. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院，廣東 東莞 523000)

結(jié)腸癌的發(fā)生與多種原因有關(guān)，包括結(jié)腸前期病變、家族性遺傳、環(huán)境影響等[1]。目前結(jié)腸癌的治療方式有手術(shù)切除、化療、放療、免疫療法等多種西醫(yī)治療手段，有較好療效，但存在切除不徹底、對正常細(xì)胞損傷大等問題[2]。中醫(yī)藥具有廉價、低毒、種類多等特點(diǎn)，在開發(fā)有效的藥物治療結(jié)腸癌方面具有廣闊的前景。從中醫(yī)角度看，結(jié)腸癌是由正虛感邪、內(nèi)傷飲食及情志失調(diào)引起的，以濕熱、瘀毒蘊(yùn)結(jié)于腸道，傳導(dǎo)失司為基本病機(jī)的一種惡性疾病[3]。在眾多的中醫(yī)方劑當(dāng)中，黃芩湯在治療大腸癌方面具有一定的優(yōu)勢[4]。黃芩湯出自《傷寒論·辨太陽病脈證并治》, 由黃芩、芍藥、炙甘草和大棗組成，為清熱止利、和中止痛常用之方。黃芩湯的君藥為黃芩，含有多種化學(xué)成分，黃芩苷為其主要成分之一，有抗腫瘤作用[5]，但其作用靶點(diǎn)和具體機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用公認(rèn)用于結(jié)腸癌研究的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，基于與細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)的STAT3/Bcl-2通路，研究了黃芩苷對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響，初步探討黃芩苷防治結(jié)腸癌的效應(yīng)機(jī)制，揭示其作用靶點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞株 人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株，來自廣東醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院科研平臺。

1.2主要儀器 超純水系統(tǒng)(德國USF EIGA公司)，電子分析天平(德國Sartorius公司)，高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，可調(diào)式微量移液器(德國Brand公司)，-80 ℃低溫冰箱(德國Thermo公司)，二列機(jī)智能水浴ZKSY-1(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，超凈工作臺(美國Thermo公司)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)，96孔培養(yǎng)板(美國Corning-Coster公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國BioTEK公司)，EVOS FL Auto顯微鏡細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國Life Technologies)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國Bio-RAD公司)，電泳槽(美國Bio-RAD公司)，轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-RAD公司)，搖床(廣州沃德生物有限公司)，Azure C500成像系統(tǒng)(美國Azure Biosystems公司)。

1.3主要試劑 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國Becton Dickinson公司)，PVDF膜(Millipore公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光顯色液(德國Thermo公司)，IP細(xì)胞裂解液(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑(上海貝博生物)，Edu細(xì)胞增殖檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁化學(xué))， 兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、鼠抗人Caspase-3單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體、鼠抗人STAT3單克隆抗體、羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗、蛋白Mark(美國Cell Signaling Technology公司)，10% SDS-PAGE凝膠(Solarbio公司)，胎牛血清(Gibco公司)，Gibco RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(美國賽默飛世爾科技)，PBS緩沖溶液(武漢博士德生物工程公司)，Tween-20(上海華順公司)，脫脂牛奶(碧迪醫(yī)療器械有限公司)，黃芩苷(純度98%，分子量446.36，購自中國食品藥品檢定研究所，批號：Y0001273，產(chǎn)地：歐洲藥典EP)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及分組

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞用含10%胎牛血清的Gibco RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)，適時更換培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。

1.4.2藥物配制 稱取10.2 mg黃芩苷粉末于1.5 mL EP管內(nèi)，用100 μL的DMSO使其溶解成105 μg/mL的母液。取母液用Gibco RPMI 1640培養(yǎng)基分別配制成25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 5個濃度的工作液。

1.4.3實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為6組，空白組用不含黃芩苷Gibco RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，黃芩苷25，50，100，200，400 μg/mL組采用相應(yīng)濃度黃芩苷培養(yǎng)。

1.5CCK-8法測SW480細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，以每孔3×103細(xì)胞接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)至正常生長階段，依1.4.3分組處理。在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，向每孔加入含10% CCK-8液的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h后，用多功能酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度并進(jìn)行分析。

1.6Edu檢測細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，以每孔5×103細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段，依1.4.3分組處理。培養(yǎng)24 h后向每孔加入100 μL的 50 μmol/L Edu培養(yǎng)基(細(xì)胞培養(yǎng)基與Edu溶液試劑A比例為1 000∶1)置于培養(yǎng)箱中孵育2 h進(jìn)行Edu標(biāo)記。標(biāo)記后用PBS洗2次(5 min/次)。棄PBS， 加細(xì)胞固定液,室溫孵育30 min后加入2 mg/mL甘氨酸50 μL搖床孵育5 min，PBS清洗1次，每孔加入100 μL滲透劑(0.5%TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10 min，PBS清洗1次，棄PBS。進(jìn)行Apollo染色，向每孔加入100 μL的1×Apollo染色反應(yīng)液，避光，室溫，脫色搖床孵育30 min。棄染色反應(yīng)液，加入100 μL滲透劑(0.5%TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10 min。PBS清洗細(xì)胞2次后，進(jìn)行DNA染色，每孔加入100 μL 1×Hoechst33342反應(yīng)液(去離子水與Edu溶液試劑F比例為100∶1)，避光，室溫，脫色搖床孵育30 min。棄染色反應(yīng)液，PBS清洗3次，每孔加入100 μL PBS保存。用EVOS FL Auto顯微鏡細(xì)胞成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.7Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡情況取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞,以每孔3×105細(xì)胞接種于6孔板中，于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)至正常生長階段，依1.4.3分組處理。作用24 h后收集細(xì)胞與培養(yǎng)基，1 500 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞2次，1 500 r/min離心5 min，棄PBS。向離心后的細(xì)胞中加入500 μL的Binding Buffer使細(xì)胞呈懸浮態(tài)，依次往其中加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI混合均勻，避光，室溫反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.8Western blot法檢測增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，以每孔3×105細(xì)胞接種于6孔板中，于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)至正常生長階段，依1.4.3分組處理，作用24 h后提取總蛋白。棄去培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖溶液清洗細(xì)胞后，加入100 μL的細(xì)胞快速裂解液(細(xì)胞PI裂解液、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑比例為100∶1∶1)反應(yīng)15 min。刮取細(xì)胞移至1.5 mL離心管中，于4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清，往其中加入1/5體積的6×蛋白上樣緩沖溶液，沸水中煮5 min后，1 200 r/min離心15 min，置于-20 ℃冰箱中備用。依照BCA試劑盒說明書制備標(biāo)準(zhǔn)品試劑，使用多功能酶標(biāo)儀于562 nm處測量吸光值，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)制備BSA蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蛋白濃度計算方程。取制備好的蛋白樣品，根據(jù)測得濃度計算蛋白上樣體積，使用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白。250 mA恒流120 min條件下，濕法蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中室溫慢搖封閉2 h。用1×PBST置于搖床上快搖洗3次/10 min后，將膜浸泡于兔抗人Bcl-2、Bax多克隆抗體及鼠抗人Caspase-3、β-actin、STAT-3單克隆抗體中(抗體與一抗稀釋劑比例為1∶10 000)，在4 ℃慢搖孵育過夜。取出用1×PBST洗3次/10 min，放入對應(yīng)的二抗(二抗抗體與二抗稀釋劑比例為1∶100 000)中避光4 ℃慢搖孵育2 h，PBST洗3次/10 min。避光條件下配置適量發(fā)光工作液(A液與B液比例為1∶1)，發(fā)光顯影，使用Azure C600成像儀拍照成像。運(yùn)用Image J分析條帶灰度值。目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白(β-actin)灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖情況 空白組和黃芩苷25，50，100，200，400 μg/mL組細(xì)胞增殖率分別為(97.00±0.02)%、(95.68±0.02)%、(93.30±0.01)%、(92.70±0.02)%、(91.35±0.01)%、(64.85±0.02)%。黃芩苷各組的細(xì)胞增殖率均明顯低于空白組(P均<0.05)，且隨著黃芩苷濃度的增高而緩慢下降，當(dāng)濃度達(dá)400 μg/mL時，細(xì)胞增殖率顯著下降1/4。Edu染色表現(xiàn)見圖1。

2.2各組人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡情況 空白組早期細(xì)胞凋亡率為7.2%，中期凋亡率為14.1%；黃芩苷25，50，100，200，400 μg/mL組早期細(xì)胞凋亡率分別為0.6%，2.0%，1.5%，5.1%，5.1%；中期細(xì)胞凋亡率分別為2.0%，2.4%，2.3%，8.2%，6.4%。人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡率有隨著黃芩苷濃度增高而逐漸升高的趨勢。

圖1 各組人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞Edu染色表現(xiàn)(×400)

2.3各組人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 隨著黃芩苷濃度的增高，Bax蛋白表達(dá)量逐漸增加，黃芩苷100，200，400 μg/mL組明顯高于空白組(P均<0.05)，黃芩苷200 μg/mL和400 μg/mL組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Bcl-2和STAT-3蛋白表達(dá)量逐漸降低,黃芩苷50，100，200，400 μg/mL組均明顯低于空白組(P均<0.05)；黃芩苷50，100，200，400 μg/mL組Caspase-3蛋白表達(dá)量呈下降趨勢，但與空白組比較及各濃度組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2及圖3。

3 討 論

黃芩苷是一種黃酮苷類化合物，主要來源于黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的根。前期研究表明，黃芩苷具有抗腫瘤、抗炎、保護(hù)腦損傷及肝肺功能、抗病毒等作用[6]，其可促進(jìn)小鼠結(jié)腸癌CT26.WT細(xì)胞凋亡,可使RIP3基因和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)[7]。

1為空白組；2為黃芩苷25 μg/mL組；3為黃芩苷50 μg/mL組；4為黃芩苷100 μg/mL組；5為黃芩苷200 μg/mL組；6為黃芩苷400 μg/mL組圖2 各組人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、STAT-3蛋白表達(dá)條帶圖

本實(shí)驗(yàn)觀察了不同濃度黃芩苷對人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，CCK-8結(jié)果顯示黃芩苷對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖有抑制作用，其抑制作用隨著濃度的增高而增強(qiáng)，與文獻(xiàn)[8-9]研究報道相同。但是本實(shí)驗(yàn)中黃芩苷濃度為25,50,100,200 μg/mL時對細(xì)胞增殖的抑制作用隨著濃度的增高而緩慢下降，當(dāng)黃芩苷濃度達(dá)400 μg/mL時對細(xì)胞增殖的抑制作用顯著下降1/4,不排除實(shí)驗(yàn)誤差對本實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。Edu染色結(jié)果顯示黃芩苷濃度達(dá)400 μg/mL時細(xì)胞增殖顯著減少，進(jìn)一步證實(shí)黃芩苷對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖有抑制作用。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，黃芩苷有促進(jìn)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的作用，但各濃度組未顯示有差異，可能是因?yàn)橛糜诹魇郊?xì)胞儀檢測的細(xì)胞數(shù)量過少而造成，也可能與藥物本身藥理效應(yīng)較弱有關(guān)。

1為空白組；2為黃芩苷25 μg/mL組；3為黃芩苷50 μg/mL組；4為黃芩苷100 μg/mL組；5為黃芩苷200 μg/mL組；6為黃芩苷400 μg/mL組圖3 各組人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、STAT-3蛋白表達(dá)情況

STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)家族成員之一，由許多細(xì)胞因子、生長因子和癌基因下游的YP標(biāo)準(zhǔn)化激活[10-11]，其是細(xì)胞核中幾種凋亡相關(guān)基因的主要轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，是公認(rèn)的致癌基因及抗癌療法的良好靶標(biāo)[12-13]。Bcl-2家族蛋白(包含Bcl-2和Bax)是STAT3下游靶蛋白，活化的STAT3可調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)而抑制細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[14-15]。Bcl-2家族蛋白是目前研究較為清楚的凋亡相關(guān)蛋白，其中Bcl-2蛋白具有抑制凋亡的作用；Bax是促凋亡蛋白，其是內(nèi)在凋亡信號傳導(dǎo)途徑的必需組分[16]。Edlich[17]發(fā)現(xiàn)Bax的活性由Bcl-2家族內(nèi)外的復(fù)雜蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)精確控制，Bcl-2可與Bax形成同源的蛋白二聚體，當(dāng)Bax的表達(dá)量相對高于Bcl-2的表達(dá)量時，形成促進(jìn)凋亡的同二聚體，而當(dāng)Bcl-2的表達(dá)量高于Bax的表達(dá)量時，則形成抑制凋亡的異二聚體。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，是CTL細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分[18]。相關(guān)研究表明，Bcl-2家族蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放，繼而激活Caspase[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 隨著黃芩苷濃度的增高，Bcl-2和STAT-3蛋白表達(dá)量逐漸降低,黃芩苷50，100，200，400 μg/mL組均明顯低于空白組；Bax蛋白表達(dá)量逐漸增加，黃芩苷100，200，400 μg/mL組明顯高于空白組；且Bax蛋白表達(dá)量相對高于Bcl-2蛋白表達(dá)量；Caspase-3蛋白表達(dá)量與黃芩苷濃度的關(guān)系不明顯，但其總體表達(dá)量高于內(nèi)參蛋白。上述結(jié)果說明黃芩苷可明顯抑制STAT3表達(dá)，經(jīng)由STAT3所在信號通路而下調(diào)Bcl-2表達(dá)，間接導(dǎo)致Bax表達(dá)的上調(diào)并因此誘導(dǎo)凋亡；黃芩苷可促進(jìn)Caspase-3所在信號通路的激活，但其與濃度的相關(guān)性尚不明了，其是否是通過促進(jìn)Bax、Bcl-2基因表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放，繼而激活Caspase還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，黃芩苷可能通過下調(diào)STAT-3表達(dá)而抑制Bcl-2表達(dá)并促進(jìn)Bax表達(dá)來誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，且呈一定的量效關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)提示黃芩苷可能具有治療結(jié)腸癌的作用，為闡明中藥復(fù)方黃芩湯治療結(jié)腸癌的藥效作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)和新認(rèn)識，為開發(fā)黃芩苷作為新型防治結(jié)腸癌或輔助手術(shù)、放化療以減輕毒副作用的藥物提供了理論支持。但因時間及相關(guān)技術(shù)條件等限制，未進(jìn)行動物或人體相關(guān)實(shí)驗(yàn)，還有待進(jìn)一步深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。