邱世婷 侯 雪 韓 梅 李 瑩 賀光云 覃蜀迪 沈 璐

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（成都），成都 610066）

在茶園管理中，除草是一項貫穿整個生產(chǎn)過程的農(nóng)事活動，草甘膦（glyphosate，GLY）和草銨膦（glufosinate，GLU）是我國登記允許在茶園使用的除草劑[1]，但近年來，濫用草甘膦等引發(fā)的茶葉質(zhì)量安全事故引起消費者越來越多的關(guān)注。草甘膦具有與有機磷化合物相似的作用毒理，主要通過抑制膽堿脂酶的活性而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)機能失調(diào)[2]。草銨膦的主要代謝產(chǎn)物為3－（甲基膦基）丙酸（3－methylphosphinico propionic acid，MPP）和N－乙酰草銨膦（N－acetyl glufosinate sodium，NAG）。草銨膦對人體的生殖系統(tǒng)會產(chǎn)生毒性，其代謝產(chǎn)物也具有相似毒性[3]，存在一定風(fēng)險，因此同時檢測草銨膦及其代謝物十分必要。許多國家和組織已制定草銨膦及其代謝物的最大殘留限量，國際食品法典委員會（CAC）、歐盟、日本和韓國規(guī)定草銨膦的殘留定義為草銨膦、MPP和NAG之和[4～6]，我國GB 2763－2019《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定草銨膦的殘留僅為草銨膦。歐盟、美國、日本和中國對茶葉中草甘膦的最大殘留限量分別為2.0、1.0、1.0和1.0 mg/kg，歐盟、日本和中國對茶葉中草銨膦的最大殘留限量分別為0.1、0.3和0.5 mg/kg。

草甘膦、草銨膦及其代謝物結(jié)構(gòu)類似，含有膦酸基、羥基、氨基，為強極性的兩性化合物，不溶于大部分有機試劑，無發(fā)色團或熒光基團，難氣化，在反相液相柱上無保留，采用常規(guī)手段對其進行定性定量極困難[8～10]。目前國內(nèi)外測定綠茶中草甘膦、草銨膦及其代謝物通常采用以9－芴基甲基氯仿（9－fluorenylmethyl chlorocarbonate，F(xiàn)MOCCl）為衍生化試劑，通過衍生改善其色譜保留行為，從而可被儀器檢測的方法，但衍生化法操作復(fù)雜、耗時長，同時衍生副產(chǎn)物易污染儀器，干擾測定，重現(xiàn)性差[11～13]。近年來，不經(jīng)衍生直接采用液質(zhì)聯(lián)用測定食品中草甘膦和草銨膦的方法也有報道[14～15]，如YASUSHI等[16]采用InertSep SAX柱凈化，對啤酒、大麥茶中的草甘膦和草銨膦及其代謝物進行了測定；BOTERO－COY等[14]采用HLB柱對大豆、玉米樣品中的草甘膦和氨甲基膦酸進行了測定；孫文閃等[17]采用MWCNTs為凈化劑，對茶葉中草甘膦、氨甲基膦酸、草銨膦進行了測定。但大部分研究集中在草甘膦、草銨膦原藥，少見涉及代謝產(chǎn)物NAG和MPP檢測的報道，也未見采用非衍生化法同時檢測綠茶中草甘膦、草銨膦及其代謝物殘留的報道。

基于草甘膦和草銨膦的強極性和陰離子特性，本研究采用親水作用色譜－串聯(lián)質(zhì)譜，結(jié)合HLB柱凈化，建立了一種無需衍生，凈化步驟簡單，能同時測定綠茶中草甘膦、草銨膦及其代謝物MPP和NAG殘留量的方法，以期為綠茶中的草甘膦、草銨膦及其代謝物的快速測定提供參考。

一、材料與方法

（一）儀器與試劑LC－30A超高效液相色譜8060三重四極桿質(zhì)譜儀（日本島津公司）；Multi Reax多管渦旋振蕩器（Heidolph公司）；AUY220電子天平（日本島津公司）；Neofuge 18R臺式高速冷凍離心機（上海力康儀器有限公司）；MilliQ超純水器（美國Millipore公司）。

GLY、GLU、MPP、NAG標 準 品（純 度>98%，天津阿爾塔科技有限公司）；PRiME HLB小柱（200 mg/6 mL，美國沃特世公司）；實驗用水為超純水；乙腈、甲酸（色譜純，美國Fisher Scientific公司）。

（二）實驗方法

1.標準溶液的配制。準確稱取10 mg的各農(nóng)藥標準品，分別用超純水溶解并配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的單個標準儲備液，于4℃冰箱保存，有效期3個月。分別吸取0.2 mL單個標準儲備液于10 mL容量瓶中，用水定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/L的混合標準儲備液，放置于4℃冰箱，有效期1個月。使用時，根據(jù)需要用超純水或空白基質(zhì)配制成適合濃度的上機工作溶液。

2.樣品前處理。稱取粉碎的綠茶樣品1.0 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL超純水提取，渦旋振蕩20 min，8 000 r/min離心5 min，取2 mL通過PRiME HLB小柱，收集流出液，過0.22μm濾膜，供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC－MS/MS）測定。

3.液相和質(zhì)譜條件。（1）液相色譜條件：色譜柱為Waters陰離子極性農(nóng)藥（anionic polar pesticide）色譜柱（100 mm×2.1 mm，5μm）；柱溫為50℃；流速為0.5 mL/min；進樣量為10μL；流動相A為0.9%甲酸水溶液，流動相B為0.9%甲酸－乙腈。梯度洗脫程序：0～4 min，0%B～15%B；4～7 min，15%B；7～8 min，15%～90%B；8～12 min，90%B。（2）質(zhì)譜條件：質(zhì)譜離子源為電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）源；接口電壓為4 000 V；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；霧化氣流速為3 L/min；干燥氣流速為10 L/min；加熱氣流速為10 L/min；接口溫度為300℃；脫溶劑管溫度為250℃；加熱模塊溫度為400℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

二、結(jié)果與分析

（一）質(zhì)譜條件的優(yōu)化單獨配制質(zhì)量濃度為1 mg/L的4種化合物的標準溶液，進行Q1全掃描，經(jīng)掃描發(fā)現(xiàn)，目標化合物在負離子模式下響應(yīng)強度高、穩(wěn)定性好，在負離子模式下確定4種化合物的母離子峰均為[M－H]－峰，將其作為母離子，利用儀器自帶自動優(yōu)化程序，對子離子、碰撞電壓、Q1電壓、Q3電壓進行優(yōu)化，獲得二級質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)，最終形成的MRM掃描參數(shù)見表1。

（二）色譜條件的優(yōu)化草甘膦、草銨膦及其2種代謝物在傳統(tǒng)的反相柱中基本無保留，根據(jù)其高親水性和強極性特點，本實驗研究選擇親水作用色譜柱進行色譜分離，共評估了4種色譜柱：Asahipak－NH2P－50柱、Dikma polyamino氨基柱、Waters DEA柱、Waters anionic polar pesticide柱。4種色譜柱液相分離條件見表2，0.05 mg/L草甘膦、草銨膦及其代謝物在不同色譜柱上色譜分離圖見圖1?？梢娛褂肁sahipak－NH2P－50柱、Dikma polyamino氨基柱時，4種化合物分離效果差，基本在同一時間出峰，不能達到基線分離，且基質(zhì)干擾嚴重，靈敏度低。使用Waters DEA柱時，草甘膦色譜峰拖尾。使用Waters anionic polar pesticide柱時，4種化合物分離效果好，峰型尖銳對稱且靈敏度高。Waters anionic polar pesticide柱固定相由具有三鍵鍵合二乙胺（diethylamine，DEA）鍵合相的亞乙基橋雜化（bridge ethylidene hybrid，BEH）顆粒組成。這種鍵合相兼具親水性表面和陰離子交換特性，適合用于保留和分離極性陰離子化合物。4種化合物均有強陰離子膦酸鹽基團，在弱酸性溶液中為強電離狀態(tài)帶負電，通過陰離子交換保留在柱上，用0.9%甲酸的酸性流動相洗脫陰離子，4種目標化合物分離效果和峰形均較好，加入鹽（如甲酸銨）后反而對峰分離效率和峰形狀產(chǎn)生了不利影響，并導(dǎo)致分析物的靈敏度降低，故本研究選取Waters anionic polar pesticide柱作為分析色譜柱，含0.9%甲酸的水和乙腈為流動相。

表2 4種色譜柱液相分離條件

（三）前處理條件的優(yōu)化考慮綠茶基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的氨基酸、茶多酚、咖啡因、色素等干擾物質(zhì)，本研究參照文獻[17］前處理方法比較了50 mg MWCNTs、50 mg GCB作為吸附劑，和本文PRiME HLB小柱方法，得出空白基質(zhì)凈化后的負離子模式下全掃描圖（見圖2），結(jié)果可見HLB小柱凈化基質(zhì)干擾較少。PRiME HLB小柱填料為親水親脂反相吸附劑，能較好吸附綠茶中茶多酚、咖啡因、氨基酸等雜質(zhì)[19］。采取過濾式凈化模式，SPE柱無需活化、淋洗和洗脫步驟，綠茶樣品經(jīng)純水提取后，取上清液直接過小柱，收集洗脫液即可上機測定，4種目標化合物回收率為78.8%～101.5%。該法操作簡單，且能有效去除綠茶中的基質(zhì)干擾，無需用到有機試劑，綠色環(huán)保，因此本研究選擇PRiME HLB小柱作為凈化方式。

圖2 不同前處理方式凈化后質(zhì)譜全掃描色譜圖

（四）方法分析性能

1.線性關(guān)系、檢出限和定量限。采用空白綠茶基質(zhì)配制一系列標準上機溶液，以目標化合物峰面積（Y）為縱坐標，相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標計算線性關(guān)系，以3倍信噪比（S/N）計算檢出限（limit of detection，LOD），以10倍信噪比（S/N）計算定量限（limit of quantitation，LOQ），結(jié)果見表3。在各自的相應(yīng)范圍內(nèi)，4種化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.999，方法檢出限為0.01～0.05 mg/kg；定量限為0.05～0.10 mg/kg，方法靈敏度高。

表3 4種化合物在綠茶中的線性關(guān)系、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

2.回收率與精密度。分別在LOQ、2LOQ、10LOQ 3個濃度水平下對空白綠茶進行添加回收實驗，每個濃度水平平行6次。4種化合物的加標回收率和相對標準偏差結(jié)果見表4。由表4可見，4種化合物回收率在78.8%～101.5%，相對標準偏差（RSD）為4.3%～11.1%，該方法的回收率和相對標準偏差滿足農(nóng)藥殘留檢測中對準確度和精密度的要求。草甘膦、草銨膦及其代謝物在綠茶樣品中加標回收（添加量0.2 mg/kg）及綠茶空白樣品圖譜見圖3。

圖3 草甘膦、草銨膦及其代謝物在綠茶樣品中加標回收（添加量0.2 mg/kg）及綠茶空白樣品圖譜

表4 4種化合物的加標回收率和相對標準偏差（n＝6）

3.基質(zhì)效應(yīng)。取綠茶空白基質(zhì)溶液和試劑配制4種化合物的標準溶液，分別測定溶劑中目標農(nóng)藥的響應(yīng)值（A）與空白基質(zhì)中添加相同濃度的目標農(nóng)藥的響應(yīng)值（B），基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）=（B/A－1）×100%，ME值為負數(shù)，說明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME值為正，說明存在基質(zhì)增強效應(yīng)。實驗結(jié)果表明，4種化合物在綠茶均存在不同程度基質(zhì)抑制效應(yīng)，其中草銨膦為強抑制效應(yīng)（見表3），因此本研究采用基質(zhì)匹配標準溶液外標法定量。

4.與其他方法的比較。本研究將本方法與文獻報道[1，18，20～22］的 前處理 方 法在 消 耗時間、 有機 試劑消耗體積、定量限等方面進行了比較（見表5）。可知本方法在時間成本、有機試劑消耗量和定量限等方面有明顯的優(yōu)勢，且操作簡單，可滿足實際樣品的檢測要求。

5.實際樣品的檢測。應(yīng)用該方法對四川省市場上的67個綠茶樣品進行了檢測，結(jié)果顯示，67批次綠茶中草銨膦及其代謝物均未檢出，但40個樣品檢出草甘膦（>LOD），檢出率超過50%，定量檢出（>LOQ）范圍為0.050 0～0.585 0 mg/kg，均未超過GB 2763－2019《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中的規(guī)定限量值，說明茶園中使用草甘膦情況較為普遍，應(yīng)當(dāng)加以管控，避免綠茶中草甘膦殘留對人體造成危害。

三、結(jié) 論

本研究建立了PRiME HLB小柱凈化，結(jié)合親水作用色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時測定綠茶中草甘膦、草銨膦、3－（甲基膦基）丙酸，N－乙酰草銨膦殘留的方法。本方法前處理簡單，無需衍生，對環(huán)境友好，干擾少，重現(xiàn)性好，可作為大批量綠茶中草甘膦、草銨膦及其代謝物的分析檢測方法。