韓浩蕾 姜長(zhǎng)嶺 王 晨 王子琪 張相春 劉 新 魯成銀 陳紅平

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，杭州 310008；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，杭州 310008；4.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥 230036)

吡咯里西啶生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要分布于遠(yuǎn)緣相關(guān)的被子植物科，涉及菊科、紫草科和豆科等13個(gè)科，通常集中在植物的種子和開(kāi)花部位，其葉、莖和根中的含量較低[1～2]。目前已經(jīng)在6 000多種植物（可能占所有開(kāi)花植物的3%～5%）中鑒定出660多種PAs及其N(xiāo)－氧化物形式（PANOs）[3～4]。PAs也是一類(lèi)植物毒素，其具有肺毒性、致癌性、遺傳毒性及致畸胎作用等多種毒性。據(jù)報(bào)道，已有超過(guò)15 000例急性人類(lèi)PAs中毒病例[5～7]。因此，研究食品中的PAs類(lèi)物質(zhì)的污染水平及來(lái)源、合理監(jiān)測(cè)以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估對(duì)于保障食品安全具有極其重要的作用。

PAs不屬于茶葉內(nèi)源污染物，但PAs污染茶葉已成為全球性質(zhì)量安全問(wèn)題[8]。歐美國(guó)家已重點(diǎn)監(jiān)測(cè)了花草茶中PAs污染水平，發(fā)現(xiàn)與其他食品和農(nóng)產(chǎn)品相比，茶葉PAs污染范圍廣、污染程度較高且其濃度變化范圍大。MULDER等[9]2018年對(duì)歐洲6個(gè)國(guó)家動(dòng)植物源性食品中吡咯里西啶生物堿的污染水平進(jìn)行調(diào)查，92%的（草藥）茶均檢出PAs，且濃度高，平均濃度可達(dá)460μg/kg（干茶）。歐洲食品安全局（EFSA）調(diào)查結(jié)果已表明，（草藥）茶等物質(zhì)是人體暴露PAs/PANOs的重要來(lái)源之一[10]。2020年已設(shè)定茶葉中PAs最高含量為150μg/kg（成人）與75μg/kg（嬰幼兒）。茶飲料是指以茶葉的萃取液、茶粉、濃縮液為主要原料加工而成的飲料，具有茶葉的獨(dú)特風(fēng)味與特征性成分的多功能飲料。鑒于茶葉受到PAs污染，以茶葉為原料的深加工產(chǎn)品可能成為人體暴露PAs的來(lái)源，對(duì)人體形成健康風(fēng)險(xiǎn)。CHMIT等[11]分析了使用植物和草藥提取物加工制成飲品中PAs的含量，其中24%的利口酒以及67%的草藥汁樣品呈陽(yáng)性。PICRON等[12]發(fā)現(xiàn)在茶葉簡(jiǎn)單浸泡過(guò)程中，16%～28%的PAs/PANOs從干物質(zhì)轉(zhuǎn)移到了浸泡液中，但目前對(duì)茶飲品中PAs的相關(guān)研究與關(guān)注較少。此外，據(jù)陳紅平等[13～14]關(guān)于農(nóng)藥浸出率的研究，推測(cè)不同茶飲料使用的原料與加工工藝會(huì)影響其中PAs的污染水平。PAs的理化性質(zhì)也會(huì)影響其在茶飲料的污染程度。目前茶飲料中PAs污染水平尚不清楚，有待于開(kāi)展茶飲料中PAs污染水平研究。

復(fù)雜基質(zhì)中PAs檢測(cè)技術(shù)隨著常量定性分析向痕量殘留定量分析的方向發(fā)展，對(duì)基質(zhì)中PAs的檢測(cè)經(jīng)歷了分光光度法[15]、核磁共振法[16]、免疫學(xué)方法[17]等定性定量分析方法，逐漸提升到色譜法和色譜質(zhì)譜聯(lián)用精準(zhǔn)分析技術(shù)[4]。色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在PAs分析中選擇性好、靈敏度高，且適用于同時(shí)檢測(cè)多種PAs，因而適用于農(nóng)產(chǎn)品或食品中PAs的定性定量分析[1，3]。與氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（GC－MS/MS）相比，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS/MS）因具有高靈敏度、檢測(cè)限低、適用范圍廣、重復(fù)性好、操作方便、前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前PAs檢測(cè)方法中最主流的檢測(cè)手段。食品中PAs前處理技術(shù)主要包括液液萃取法（LLE）、固相萃取技術(shù)（SPE）[18]、QuEChERS法[19]以及發(fā)展的新型技術(shù)如分散液相微萃取（DLLME）[20]、固相支持液/液萃?。⊿LE）[21]等。其中SPE具有溶劑用量少、高效、快速的特點(diǎn)，是最常用的凈化處理方式[3～4]。本文采用SPE前處理方法，超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC－MS/MS）技術(shù)檢測(cè)茶飲料中PAs；通過(guò)分析市售28款茶飲料中PAs的含量，分析茶飲料中PAs污染水平，以期為保障食品安全提供參考。

一、實(shí)驗(yàn)方法

（一）實(shí)驗(yàn)儀器與材料AB SCIEX TQ 5500型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)SCIEX公司）；LC－30A超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；DMT－2500自動(dòng)振動(dòng)儀（杭州米歐儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

15種PAs/PANOs包括天芥菜堿（He）、天芥菜堿－N－氧化物（HeNO）、倒千里光堿（Re）、倒千里光堿－N－氧化物（ReNO）、千里光寧堿（Sc）、千里光寧堿－N－氧化物（ScNO）、千里光堿（Jb）、千里光堿－N－氧化物（JbNO）、促黑激素（Im）、促黑激素－N－氧化物（ImNO）、千里光菲靈堿（Sp）、千里光菲靈堿－N－氧化物（SpNO）、歐天芥菜堿（Eu）、歐天芥菜堿－N－氧化物（EuNO）和克氏千里光堿（Sk）均購(gòu)自PhytoLab（德國(guó)）。用甲醇（MeOH）制備每種PAs/PANOs的儲(chǔ)備溶液 為1 mg/mL，避 光 于－20℃儲(chǔ) 存。甲醇（MeOH）、氫氧化銨、甲酸（FA）、甲酸銨（色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；硫酸購(gòu)自昆山金城試劑有限公司 （蘇州，中國(guó)）；Bond Elut Plexa PCX色譜柱（200 mg/6 mL）購(gòu)自安捷倫科技（美國(guó)）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（Milli－Q水處理系統(tǒng)制備）。實(shí)驗(yàn)材料使用的28款茶飲料包括紅茶飲料、綠茶飲料、普洱茶飲料、果茶以及奶茶等，均購(gòu)買(mǎi)自浙江省杭州市超市。

（二）樣品前處理采用SPE柱（Bond Elut Plexa PCX，200 mg，6 mL）進(jìn)行固相萃取凈化。先后采用5 mL甲醇與5 mL去離子水活化SPE柱，取10 mL茶飲料分兩次加入到PCX SPE柱；待上樣液的液面與SPE上層齊平時(shí)，分別采用5 mL去離子水（含1%甲酸）與5 mL甲醇進(jìn)行淋洗，再采用4 mL甲醇（含0.5%氨水）洗脫；洗脫液經(jīng)0.22 μm濾膜于自動(dòng)進(jìn)樣瓶，待UHPLC－MS/MS分析。

（三）色譜-質(zhì)譜條件UHPLC－MS/MS色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（2.1mm×100 mm，1.8μm），流動(dòng)相A為1mmol/L甲酸銨的甲醇（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為1mmol/L甲酸銨的水（含0.1%甲酸），洗脫梯度見(jiàn)表1。流速為0.25 mL/min，柱溫40℃。進(jìn)樣量3μL。

表1 UHPLC-MS/MS流動(dòng)相洗脫梯度

UHPLC－MS/MS質(zhì)譜條件：正離子電噴霧電離（ESI+），可編程多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（sMRM）模式監(jiān)測(cè)，MRM參數(shù)見(jiàn)表2。ESI氣體溫度為500℃，離子噴霧電壓（IS）為5 500 V。氣簾氣（CUR）和碰撞氣（CAD）的壓力分別設(shè)置為35 psi和7 psi。霧化氣壓力（GS1）和輔助氣壓力（GS2）均設(shè)置為50.0 psi。

表2 15種PAs保留時(shí)間及MRM參數(shù)

二、結(jié)果與討論

（一）方法線性范圍、檢出限、定量限以15種PAs/PANOs的峰面積為縱坐標(biāo)，目標(biāo)化合物濃度為橫坐標(biāo)，考察目標(biāo)物的線性，結(jié)果如表3所示，可以看出，15種化合物分別在0.1～200μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2＞0.99），檢出限（LOD，S/N＝3）為0.001～0.05μg/L。方法的定量限通過(guò)最低水平加標(biāo)回收率的方式獲取，最終確定15種目標(biāo)物定量限（LOQ）范圍為0.1～0.8μg/L，表明本方法靈敏度高，可滿足對(duì)PAs檢測(cè)方法靈敏度的要求。

（二）方法的回收率與精密度茶飲料樣品中15種化合物分別在1、5、10μg/L的加標(biāo)濃度下，按照上文前處理方法進(jìn)行樣品前處理，方法的回收率與精密度如表3所示。15種目標(biāo)物回收率范圍為68.7%～96.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜11.5%。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性良好，且適用于茶飲料基質(zhì)中15種PAs的定量。

（三）基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effects，ME）采用甲醇溶劑標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和茶飲料基質(zhì)樣品溶液進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)，用ME＝［（kmatrix/kmethanol）－1］×100%（k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率）公式計(jì)算，最終得到茶飲品中PAs的基質(zhì)效應(yīng)范圍為－0.45～0.08。不同PAs在茶飲料中基質(zhì)效應(yīng)有差異，如表3所示，茶飲料對(duì)大多數(shù)PAs有較弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，只有Sc有較弱的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，此外，茶飲料對(duì)SpNO表現(xiàn)出較顯著的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

表3 15種PAs/PANOs在茶飲料基質(zhì)中的準(zhǔn)確度、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、線性方程和相關(guān)系數(shù)等

（四）茶飲料中PAs污染水平采用本文方法監(jiān)測(cè)了從市場(chǎng)中收集的常見(jiàn)茶飲料樣品28份，其中包括花果茶、奶茶以及純茶制品。監(jiān)測(cè)結(jié)果如表4所示，所有茶飲料樣品中均能檢出1種或多種PAs，其中有2個(gè)樣品中的Sk含量大于定量限，其余樣品中檢出PAs含量?jī)H高于檢出限但小于定量限。結(jié)果表明，茶飲料中PAs污染范圍廣，但因其中PAs含量較低，其總體污染程度較低。與歐盟調(diào)查茶葉中的PAs結(jié)果相比[22]，此次監(jiān)測(cè)的茶飲料中PAs污染程度明顯低于歐盟市售茶飲料。

不同種類(lèi)茶飲料PAs污染水平有差異，如表4所示，有1個(gè)樣品（7號(hào)樣品）中可以檢出12種PAs，雖含量均小于定量限，但其中含有多種類(lèi)型PAs。有7.14%的樣品中分別檢出7種PAs，檢出5～6種PAs的樣品共有4個(gè)，大多數(shù)樣品（64.29%）中檢出PAs種類(lèi)為1～2種。不同茶飲料中PAs污染程度差異主要可能與原料以及深加工工藝有關(guān)。此外，監(jiān)測(cè)樣品中檢出PAs含量較高的樣品一般屬于果茶，考慮到這可能與茶飲料所使用茶葉原料等級(jí)有關(guān)。

表4 28款市售茶飲料中PAs/PANOs含量監(jiān)測(cè)結(jié)果

茶飲料中15種PAs檢出率結(jié)果如圖1所示，可以看出，在28款飲品中所有目標(biāo)物均有檢出，不同PAs檢出情況不同。Sk的檢出率最高，可達(dá)92.86%，且有兩個(gè)茶飲品中的Sk含量高于檢出限；其次檢出較高的是JbNO、ImNO、Eu及EuNO，其檢出率均在20%以上，其余PAs檢出率較低。此外，PANOs在茶飲料中的檢出率普遍高于PAs，這可能與PANOs的理化性質(zhì)有關(guān)，推測(cè)其極性大，在加工過(guò)程中易被提取。

圖1 茶飲料中15種PAs/PANOs檢出率

三、結(jié)論

本文建立了UHPLC－MS/MS同時(shí)檢測(cè)茶飲料中15種PAs/PANOs的方法，該方法簡(jiǎn)便、快速，靈敏度高，重現(xiàn)性好，滿足茶飲料中15種PAs/PANOs污染檢測(cè)的要求。本研究應(yīng)用該方法監(jiān)測(cè)了28款市售茶飲料中15種PAs的含量，結(jié)果表明，茶飲料中PAs污染程度較低；不同茶飲料中PAs污染水平存在較大差異，推測(cè)可能與原料與加工工藝有關(guān)。該研究有利于進(jìn)一步查明茶飲料中PAs對(duì)人體的暴露水平，為茶飲料中PAs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。