崔雅楠 喬 璐 徐錦華 韓 剛 程 波 穆迎春

（1.中國水產(chǎn)科學研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100141；2.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧錦州 121000）

漁藥在降低水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)病率和死亡率、提高餌料利用率、促進生長等方面發(fā)揮著重要作用，科學合理使用漁藥是保證水產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要措施[1～2]。近年來漁用抗菌藥的使用及其種類多樣化發(fā)展，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來較大風險隱患[3～6]。2019年水產(chǎn)養(yǎng)殖“非藥品”專項風險排查發(fā)現(xiàn)，替米考星（tilmicosin）檢出率較高。替米考星是泰樂菌素衍生物，屬于大環(huán)類抗生素，被廣泛用于治療牛、羊、雞、豬等動物感染性疾病[7～9]，且對畜禽呼吸道感染具有較好療效[10～11]。替米考星對革蘭氏陽性菌、某些革蘭氏陰性菌、支原體、螺旋體等均有抑制作用，對胸膜肺炎放線菌、巴氏桿菌具有比泰樂菌素更強的抗菌活性[12～13]。此外，替米考星及其衍生物也被用于治療和預防畜禽水產(chǎn)動物疾病，亞臨床治療劑量則用于促生長。但替米考星具有肝、腎毒性，可損害人體前庭和耳蝸神經(jīng)，長期使用會引起耐藥性的產(chǎn)生[14～17]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用替米考星，藥物在達到治療或促生長目標的同時，也會直接被水產(chǎn)養(yǎng)殖動物吸收而影響水產(chǎn)品安全。日本明確規(guī)定在有鰭魚類自然比例帶皮肌肉中替米考星的最大殘留限量為50μg/kg[18]。我國尚未明確規(guī)定替米考星在水產(chǎn)品中的殘留限量值，但我國GB 31650－2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定，替米考星每日允許攝入量（Acceptable Daily Intake，ADI）為0～40μg/kg bw。目前，對替米考星在肉品中的研究多集中在禽肉檢測，在水產(chǎn)品中的研究相對較少，其在水產(chǎn)動物體內(nèi)的代謝消減規(guī)律研究缺乏。

彭澤鯽（Carassius auratusvar.Pengze），隸屬于鯉形目鯉科鯽屬，是一種廣泛分布于淡水環(huán)境中的硬骨魚類[19]。鯽魚是以植物為食的雜食性魚類，對養(yǎng)殖環(huán)境的適應能力強，主要分布在歐亞地區(qū)和我國的淡水地區(qū)[20]。本研究以彭澤鯽為實驗對象，建立了替米考星在養(yǎng)殖水體及鯽魚組織中殘留量的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測法，檢測不同暴露時間和暴露濃度下替米考星殘留水平，進而分析替米考星在鯽魚組織中的代謝消減規(guī)律及藥代動力學特征。

一、材料與方法

（一）藥物與試劑替米考星（含量≥85%，上海源葉生物科技有限公司）；替米考星標準品（純度≥80.71%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；羅紅霉素內(nèi)標物（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、乙酸乙酯、甲醇、正己烷（均為色譜級，F(xiàn)isher Chemicals公司）；氯化鈉、甲酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫銨、EDTA鈉鹽（Na2EDTA）（均為分析純，Biotopped公司）；超純水（600 L，中國屈臣氏）。

（二）儀器與設備電子天平（RL2002，瑞士Mettler Toledo）；濾膜（0.45μm，中國津騰）；針筒式濾膜過濾器（0.22μm，中國津騰）；移液槍（10μL、20μL、1 000μL、5 000μL，德國Transferpette）；固相萃取柱Oasis HLB（60 mg/3 mL，美國Waters公司）；多試管渦旋混合器（Multi-Tube Vortexer MS200，杭州瑞誠儀器有限公司）；渦旋混合器（IKA MS3 basic，德國IKA）；自動高速冷凍離心機（Xiang Yi H－2050R，中國恒諾儀器）；高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜儀，配有數(shù)據(jù)采集處理軟件（TQS Quantum Access Max，美國Thermo Fisher Scientific）；色譜柱：Intersil C18柱（150 mm×2.1 mm，3μm，美國Waters公司）；1.5 mL棕色進樣小瓶（1109－0520，美國安捷倫）；試管（25 mL、50 mL，REF 430828，美國CORNING）；無菌注射器（1 mL，中國KDL）；氮吹儀（N-EVAPTM111，美國Organomation）；超聲波清洗機（SB－5200 DTN，寧波新芝SCIENTZ）；醫(yī)用低溫保存箱（中國Haier）。

（三）實驗動物從本地養(yǎng)殖場購進魚體質(zhì)量為（65±10）g的鯽魚后，運輸至中國水產(chǎn)科學研究院良鄉(xiāng)實驗基地，以2%氯化鈉溶液消毒10 min，然后將其放置于已清洗并用高錳酸鉀消毒處理的玻璃缸（300 L）中暫養(yǎng)1周。暫養(yǎng)期間養(yǎng)殖水體為持續(xù)供氧的淡水，水溫24～26℃。每日8:00－9:00和16:00－l7:00各投喂1次鯽魚飼料，日投喂總量為魚體總質(zhì)量的6%，且每天換水1次。暫養(yǎng)結(jié)束后，選擇規(guī)格整齊、反應活躍、無明顯病傷的個體魚分別于0.15 mg/L和1.50 mg/L替米考星暴露濃度下養(yǎng)殖。

（四）實驗方法

1.標準溶液配置。標準儲備溶液：準確稱取10 mg替米考星標準品溶于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混勻，配制成1 mg/mL的標準儲備溶液，4℃保存。內(nèi)標儲備溶液：準確稱取10 mg羅紅霉素標準品溶于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，配制成1 mg/mL的內(nèi)標儲備溶液，4℃保存。內(nèi)標工作溶液：吸取10 μL內(nèi)標儲備溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制成1.0μg/mL的內(nèi)標工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.樣本采集。水樣：水浴給藥后，分別于0、6、24、48、96、144和192 h從各處理組采集水樣，并于－80℃冷凍保存待測。魚樣：分別于4、6、8、9、10、12、15、18、23、28和33 d隨機捕撈3條暴露養(yǎng)殖鯽魚，并采集血液、鰓、肝臟、腎臟及肌肉樣本，置于－80℃保存待測。

3.樣品提取與凈化。對比甲醇和乙腈提取劑，甲醇基質(zhì)干擾大，峰形對稱性差；乙腈可以沉淀蛋白，去除一部分雜質(zhì)，因此選擇乙腈進行提取。水樣前處理：分別準確量取500 mL空白組和2組對照組，用抽濾裝置過0.45μm濾膜，向過濾后的水樣中加入10μL羅紅霉素內(nèi)標工作液和0.5 g Na2EDTA。用自動固相萃取儀過HLB小柱（甲醇3 mL、純水3 mL活化）進行富集，樣品上樣流速15 mL/min（2滴/s），10 mL超純水淋洗，抽干2 h以上，確保HLB柱填料完全干燥。然后用10 mL甲醇溶液洗脫，抽干，洗脫液置于玻璃試管中。洗脫液經(jīng)氮吹儀40℃吹干，以1 mL甲醇定容，過0.22μm有機濾膜至進樣小瓶中，待HPLCMS/MS檢測。魚樣前處理：稱取（2.00±0.01）g樣品，置于25 mL離心管中，加入10μL內(nèi)標工作液和15 mL乙腈，渦旋1 min，超聲20 min，以4 200 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取8 mL上層有機液過Oasis HLB固相萃取柱，并用10 mL水和10 mL甲醇溶液洗柱，經(jīng)真空泵抽干1 h，再用10 mL甲醇洗脫于15 mL氮吹管中，43℃下氮吹近干，用1 mL初始流動相復溶，過0.22μm濾膜至進樣小瓶中，待HPLC－MS/MS檢測。

（五）檢測條件

1.色譜條件。色譜柱為Intersil C18柱（150 mm×2.1 mm，3μm），進樣量為20μL，流速為0.5 mL/min，柱溫為20℃，流動相A為0.1 mmol/L甲酸銨溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫參數(shù)見表1。

表1 梯度洗脫表

2.質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子（ESI）源、正離子模式，掃描方式為選擇反應監(jiān)測模式（SRM），電噴霧電壓5 500 V，霧化氣壓力為0.069 MPa，氣簾氣壓力為0.69 MPa，輔助氣流速為0.414 L/min，離子源溫度350℃，碰撞室出口電壓為2.0 V，定性離子對（m/z） 為869.4/174.2和869.4/132.1，碰撞氣能量為62 V和70 V，去簇電壓90 V；定量離子對（m/z）為869.4/174.2，碰撞氣能量為62 V，去簇電壓90 V。替米考星標準物質(zhì)的總離子圖及定性離子和定量離子圖見圖1。

圖1 替米考星標準物質(zhì)的總離子圖及定性離子和定量離子圖

（六）標準曲線及回收率實驗

1.標準曲線。配制1、2、5、10、20、50和100 ng/mL系列濃度基質(zhì)標準工作溶液，進行HPLC－MS/MS檢測，并以替米考星峰面積（A）為橫坐標，濃度（C）為縱坐標，進行線性回歸分析，得到標準曲線。

2.回收率實驗。采用加標回收法，分別取鯽魚空白血漿1.0 mL，空白組織鰓、肝臟、腎臟、肌肉各1.0 g，加入濃度為5、10、50 ng/mL的標準工作液，按照上述樣品前處理方法處理樣品，進樣檢測，獲取不同濃度條件下的回收率。回收率＝（基質(zhì)添加峰面積／空白基質(zhì)加標樣品峰面積）×100%。

二、結(jié)果與分析

（一）標準曲線及回收率水樣和魚樣中替米考星標準曲線如圖2所示，水樣標準曲線的回歸方程為Y＝14 659X+43 722（R2＝0.996 9），魚樣標準曲線的回歸方程為Y＝25 539X+69 954（R2＝0.996 2），養(yǎng)殖水體及鯽魚中替米考星檢出限為2.0 μg/kg。替米考星標準溶液在鯽魚各個組織中的線性關(guān)系良好，鯽魚各組織中替米考星標準曲線回歸方程及回收率見表2，相關(guān)系數(shù) （R2）范圍為0.991 2～0.995 8，均＞0.99，回收率為80.64%～89.41%。

圖2 水樣和魚樣中替米考星標準曲線

表2 鯽魚各組織中替米考星標準曲線回歸方程及回收率

（二）替米考星在養(yǎng)殖水體中的殘留變化規(guī)律依據(jù)上文所建方法，對實驗組0、6、12、24、48、96、144和192 h時間點采集的水樣進行上機檢測。替米考星的殘留濃度測定結(jié)果見圖3，可以看出，在0.15 mg/L和1.50 mg/L 2種暴露濃度下的替米考星殘留變化曲線基本一致，均出現(xiàn)2個峰值。養(yǎng)殖水體中替米考星殘留量迅速下降，說明養(yǎng)殖水體中的替米考星被魚體吸收富集；至96 h養(yǎng)殖水體中殘留量呈現(xiàn)上升趨勢是由于魚體吸收的替米考星經(jīng)胃腸排空和魚體自身生物作用，部分替米考星以原藥形式排出到養(yǎng)殖水體中。

由圖3可見，0.15 mg/L替米考星暴露濃度下，自0～6 h，養(yǎng)殖水體中濃度下降至0.02 mg/L；6～12 h，替米考星濃度上升至0.07 mg/L，出現(xiàn)第1個峰值；至24 h濃度下降至0.02 mg/L，48 h時下降至0.01 mg/L；至96 h時養(yǎng)殖水體濃度再次上升至0.03 mg/L，出現(xiàn)第2個峰值；隨后持續(xù)下降，144 h和192 h養(yǎng)殖水體中替米考星濃度分別為0.02和0.01 mg/L。0、12、24、48、96和192 h差異顯著，其他時間差異不顯著。

由圖3可見，1.50 mg/L暴露濃度下養(yǎng)殖水體中替米考星的殘留變化規(guī)律與0.15 mg/L暴露濃度下的規(guī)律一致。自0～6 h，養(yǎng)殖水體中替米考星濃度下降至0.74 mg/L；6～12 h上升至1.08 mg/L，出現(xiàn)第1個峰值；至24 h下降至0.51 mg/L，48 h時下降至0.40 mg/L；至96 h時養(yǎng)殖水體中替米考星殘留濃度再次上升至0.95 mg/L，出現(xiàn)第2個峰值；至144 h和192 h養(yǎng)殖水體濃度持續(xù)下降至0.43 mg/L和0.38 mg/L。48 h、144 h和192 h差異不顯著，其他時間差異顯著。

圖3 不同暴露濃度下養(yǎng)殖水體中替米考星的藥物濃度－時間曲線

（三）替米考星在鯽魚組織中的代謝消減規(guī)律依據(jù)上文所建方法，對實驗組第4、6、8、9、10、12、15、18、23、28和33 d時間點采集的鯽魚各組織樣本進行上機檢測。2種暴露濃度下鯽魚的鰓、肝臟和腎臟中替米考星的殘留測定結(jié)果見圖4～圖6。結(jié)果顯示，0.15和1.50 mg/L 2種暴露濃度下替米考星在3種組織中的代謝曲線變化基本一致，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

如圖4所示，在0.15 mg/L和1.50 mg/L替米考星2種暴露濃度下，鯽魚鰓中替米考星在第1個采集時間點的濃度分別為0.005、0.112 mg/kg；隨后分別下降至0.002、0.036 mg/kg；然后明顯上升，分別于8 d和9 d時達到最高濃度，濃度為0.089、0.502 mg/kg；之后迅速下降，在15 d和23 d時分別代謝完全。在0.15 mg/L替米考星暴露濃度下，第6、12和15 d差異性不顯著，其他時間差異顯著。1.50mg/L替米考星暴露濃度下，15 d與18 d的差異不顯著，其他時間差異顯著。

圖4 不同暴露濃度下鯽魚鰓中替米考星的藥物濃度－時間曲線

如圖5所示，肝臟中替米考星的變化趨勢較明顯，在2組替米考星暴露濃度下均于第8 d達到最高峰，低暴露組在8～9 d時下降趨勢更明顯，在第18 d檢測到2組暴露濃度的含量均為0 mg/kg，說明替米考星在鯽魚肝臟中代謝完全。在0.15 mg/L替米考星暴露濃度下，6、8、9 d的差異顯著，其他時間差異不顯著。在1.5 mg/L替米考星暴露濃度下，6、15、18 d的差異不顯著，其他時間差異顯著。

圖5 不同暴露濃度下鯽魚肝臟中替米考星的藥物濃度－時間曲線

如圖6所示，在2組替米考星暴露濃度下，4～8 d時鯽魚腎臟中的替米考星濃度逐漸升高，在第8 d時達到最大值，含量分別為6.780和19.613 mg/kg，然后開始迅速下降。在不同暴露濃度下，替米考星在鯽魚腎臟中的含量均遠高于其他組織10倍至數(shù)十倍。在0.15 mg/L替米考星暴露濃度下，4、6、9、10、12、15和18 d差異不顯著，其他時間差異顯著。在1.50mg/L替米考星暴露濃度下，6、18 d差異不顯著，其他時間差異顯著。

圖6 不同暴露濃度下鯽魚腎臟中替米考星的藥物濃度-時間曲線

在替米考星暴露濃度為0.15 mg/L時，鰓、肝臟和腎臟中的濃度均于第8 d達到最高峰，峰值分別為0.089、0.544和6.780 mg/kg。隨后3種組織中的替米考星含量均開始下降，并分別在第15、18和23 d時替米考星含量降低為0 mg/kg。在替米考星暴露濃度為1.50 mg/L時，鰓中的濃度于第9 d達到最高峰，肝臟和腎臟中的濃度均于第8 d達到最高峰，腎臟、肝臟、鰓中替米考星殘留濃度峰值分別為19.613、1.571、0.502 mg/kg。隨后3種組織中的替米考星含量均開始下降，并分別于23 d、18 d和23 d時降低為0 mg/kg。

（四）替米考星在鯽魚組織中的藥代動力學特征使用DAS 2.0藥代動力學軟件分析藥代參數(shù)，結(jié)果見表3，在0.15 mg/L和1.50 mg/L替米考星暴露濃度下，鯽魚鰓中替米考星最高濃度分別為0.089 mg/kg和0.502 mg/kg，藥時曲線下面積為0.18（mg·d）/L和1.91（mg·d）/L，平均滯留時間為8.08 d和8.42 d，消除半衰期分別為0.51 d和1.25 d，達峰時間均為8 d。

表3 不同濃度替米考星暴露下鯽魚鰓、肝臟和腎臟中的藥代動力學參數(shù)

鯽魚肝臟中藥時曲線下面積為0.97（mg·d）/L和6.85（mg·d）/L，平均滯留時間為8.04 d和8.06 d，消除半衰期分別為1.88 d和1.33 d；替米考星均在第8 d時達到最高峰，最高濃度分別是0.54 mg/kg和1.57 mg/kg，隨后殘留濃度迅速降低。

在0.15 mg/L和1.50 mg/L替米考星暴露濃度下，鯽魚腎臟中替米考星藥時曲線下面積為11.12（mg·d）/L和58.44（mg·d）/L，平均滯留時間為7.98 d和7.81 d，與鰓和肝臟的滯留時間差異不顯著；消除半衰期分別為1.24 d和0.99 d，達峰時間均為8 d，與肝臟的達峰時間一致，最高濃度分別是6.78 mg/kg和19.61 mg/kg，腎臟是殘留濃度最高的組織。

三、結(jié)論與討論

（一）高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測養(yǎng)殖水體和鯽魚組織中替米考星殘留目前常用的測定動物性食品中替米考星殘留的方法主要有高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法等，其中酶聯(lián)免疫法具有快速、簡便、靈敏等特點，且對儀器設備和檢測人員要求相對較低，但該方法適用于基層大批量樣品的快速篩查，若檢測結(jié)果為陽性，應采用儀器方法（如高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等）進行定量確證。劉勇軍和姜艷彬[21]建立了固相萃?。咝б合嗌V法檢測豬肉與雞肉中替米考星殘留量的方法，檢出限為30μg/kg。曹忠君[22]應用高效液相色譜法對市場中64批次雞肉樣品中替米考星藥物殘留量進行檢測，方法檢出限為10μg/kg。易錫斌等[23]建立了測定禽肉組織中替米考星殘留量的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜方法，在禽肉不同組織中替米考星檢出限為1.0～3.0μg/kg。吳婉琴等[24]建立了超高液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物，其中替米考星檢出限為2.5μg/kg。

本研究通過對提取劑的比較分析，建立了鯽魚養(yǎng)殖水體中替米考星殘留的前處理和檢測方法，采用電噴霧離子源、正離子掃描模式，在多反應監(jiān)測模式下測定各取樣點養(yǎng)殖水體中替米考星含量。對于水產(chǎn)品，常用的提取試劑有Tris緩沖溶液、偏磷酸－甲醇、甲醇和乙腈等，本研究對鯽魚血液、肌肉、肝臟、腎臟和鰓組織樣品，用乙腈進行提取，并用Oasis HLB固相萃取柱凈化。本研究采用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定鯽魚及養(yǎng)殖水體中替米考星殘留量，檢出限為2.0μg/kg。液質(zhì)聯(lián)用法雖對儀器設備和技術(shù)要求高，但該方法檢測替米考星靈敏度高、檢測限低，且可以選擇性地將分子量、分子結(jié)構(gòu)等非常接近的物質(zhì)分離開來，對其進行定性和定量。

（二）替米考星在養(yǎng)殖水體和鯽魚不同組織中的殘留分布特征在0.15 mg/L和1.50 mg/L替米考星藥浴給藥后，替米考星在水體中的含量逐漸下降，而暴露后一定時期內(nèi)其在鯽魚腎臟、肝臟、鰓中殘留含量快速升高直到峰濃度，可見鯽魚對水體中的替米考星具有較強的吸收和蓄積能力。養(yǎng)殖水體中的替米考星殘留量均在96 h時出現(xiàn)反峰值，主要是由于魚體在吸收養(yǎng)殖環(huán)境中的替米考星后，經(jīng)胃腸排空和魚體自身生物作用，部分替米考星以原藥形式排出到養(yǎng)殖水體中。

以0.15 mg/L和1.5 mg/L濃度暴露后，替米考星在鯽魚腎臟中殘留量最高，肝臟、鰓次之，肌肉和血液中均未檢出。鯽魚不同組織中替米考星殘留量于第8/9 d達到峰值，原因主要是前8 d鯽魚一直處于暴露環(huán)境中，至第9 d換清水養(yǎng)殖，暴露濃度為0。給藥初期，鯽魚各組織中替米考星殘留濃度均呈現(xiàn)上升趨勢，說明在暴露初期替米考星不斷被魚體吸收并富集。魚體在藥浴暴露后，替米考星主要富集于鯽魚內(nèi)臟中，鰓中富集相對緩慢，肌肉和血液中未檢測到有富集，原因是腎臟是藥物代謝和排泄的重要器官，而肝臟是消化和代謝器官，特別是有機體中外源性物質(zhì)的主要代謝器官，故腎臟及肝臟組織對替米考星具有較強的蓄積、富集作用。

（三）替米考星在鯽魚組織中藥代動力學特征分析鯽魚鰓中替米考星藥代動力學特征符合一級吸收一室開放模型，而肝臟和腎臟則符合一級吸收二室開放模型。在0.15 mg/L和1.50 mg/L替米考星暴露濃度下，鰓、肝臟、腎臟3種組織中最大藥物濃度分別為0.089、0.544、6.780 mg/L和0.502、1.571、19.613 mg/L，消除半衰期分別為0.51、1.88、1.24 d和1.25、1.33、0.99 d。相比肝臟，替米考星在鯽魚腎臟中殘留量最高，消除半衰期短，消除速率較快，可在短時間內(nèi)代謝完全。

已有的替米考星研究多集中在禽肉檢測中，在水產(chǎn)品中的研究相對較少，主要涉及了替米考星對魚類的毒性試驗和檢測方法的建立等，但尚未見替米考星在魚體中代謝消減規(guī)律和藥代動力學分析的研究報道。本文研究了替米考星在養(yǎng)殖水體和鯽魚組織中的殘留分布及代謝消減規(guī)律，并進一步分析了藥代動力學特征，為替米考星在魚肉中的代謝研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。盡管鯽魚肌肉中未檢測到替米考星殘留，但由于抗菌藥在水產(chǎn)品及養(yǎng)殖水體中的暴露會間接影響人體健康，且抗菌藥耐藥性直接影響人類健康，抗菌藥管控已在全球范圍展開，在“健康中國”、減抗限抗背景下，替米考星作為抗菌類藥物，應嚴格監(jiān)管。