陸鯨冰 楊潤梅 張飛揚 曹紅利

摘要：【目的】克隆茶樹CsMAPKK3基因，并進行表達分析，為探究CsMAPKK3基因的生物學功能及其抗逆分子機制提供理論支持?！痉椒ā恳澡F觀音為材料，采用RT-PCR克隆其CsMAPKK3基因的全長cDNA序列，對其進行生物信息學分析，并采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其在不同組織及逆境脅迫下的表達情況。【結果】克隆獲得的CsMAPKK3基因（GenBank登錄號：AUD40506.1）cDNA序列全長1941 bp，包含完整開放閱讀框（ORF），長度為1557 bp，編碼518個氨基酸殘基，蛋白相對分子量為57.52 kD，理論等電點（pI）為5.39，為無跨膜螺旋結構和信號肽的不穩(wěn)定蛋白，含有多個磷酸化位點，定位于細胞質和細胞核中，屬于PKc類型的MAPKK，且具有SPS1、S_TKc等催化結構域，以及D（I/L/V）K激活域和S/T-X3-5-S/T保守域，與中華獼猴桃PSS35243.1親緣關系最近，且與擬南芥B亞家族聚為一類。CsMAPKK3基因起始密碼子上游1714 bp的啟動子區(qū)序列含有光響應、逆境響應、植物激素和厭氧誘導等相關的順式作用元件。CsMAPKK3基因在根、莖、葉、花和果中均有表達，其中在莖和果的表達量較高，顯著高于在花中的表達量（P<0.05），但與根和葉中的表達量均無顯著差異（P>0.05）。低溫脅迫抑制CsMAPKK3基因表達，而脫落酸（ABA）、高鹽和干旱脅迫均能誘導CsMAPKK3基因上調表達?！窘Y論】CsMAPKK3基因表達具有組織表達特異性，且參與茶樹ABA、高鹽、低溫和干旱脅迫響應等逆境脅迫的分子調控。

關鍵詞： 茶樹;CsMAPKK3基因;基因克隆;生物信息學分析;表達分析;逆境脅迫

中圖分類號： S571.103.53? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）03-0651-09

Cloning and expression analysis of CsMAPKK3 gene in tea plant

LU Jing-bing， YANG Run-mei， ZHANG Fei-yang， CAO Hong-li*

（College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science in

Universities of Fujian Province， Fuzhou? 350002， China）

Abstract：【Objective】The CsMAPKK3 gene of tea tree was cloned and its expression was analyzed to provide theoretical support for clarifying the biological function of tea plant CsMAPKK3 gene and revealing its role in tea plants stress resistance. 【Method】In this study，the full-length cDNA of MAPKK3 gene were cloned using RT-PCR from Tieguanyin tea plant. Then，the bioinformatics characteristics and functions of CsMAPKK3 gene were predicted，and its expression patterns in various tissues and under different stress treatments were investigated using real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full-length cDNA of CsMAPKK3 was 1941 bp，with a 1557 bp open reading frame（ORF），encoding 518 amino acids，and submitted to the GenBank with accession number of? AUD40506.1. The molecular weight of CsMAPKK3 protein was 57.52 kD，and the theoretical isoelectric point（pI） was 5.39. The amino acid sequence prediction showed that it was an unstable protein without transmembrane helix structure and signal peptide，and contained multiple phosphorylation sites. CsMAPKK3 protein，located in cytoplasm and nucleus，belonged to PKC type MAPKK，and had catalytic domains such as SPS1，S_TKC，D（I/L/V）K activation domain and S/T-X3-5-S/T conserved domain. It had close relationship with Chinese kiwifruit（PSS35243.1），and was clustered in a class with Arabidopsis B subfamily in phylogenetic tree.? Additionally，promoter sequence analysis showed that the 1714 bp promoter region in the? initiation codon upstream of CsMAPKK3 contained several cis-acting elements related to light response，stress response，plant hormones，and anaerobic induction. Real time quantitative PCR analysis showed that CsMAPKK3 was expressed in roots，stems，leaves，flowers and fruits，and the expression level was higher in stems and fruits，which was significantly higher than that in flowers（P<0.05），but had no significant difference with that in roots and leaves（P>0.05）. The expression of CsMAPKK3 was down-regulated by cold stress，but up-regulated by abscisic acid（ABA），salt and drought treatments. 【Conclusion】The expression of CsMAPKK3 is tissue-specific，and it is involved in the tea plant response to ABA，high salt，low temperature and drought stresses.

Key words： Camellia sinensis; CsMAPKK3 gene; gene cloning; bioinformatics analysis; expression analysis; stress

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31800587）; Education Research Project for Young and Middle-aged Teachers of Education Department of Fujian（JAT170160）

0 引言

【研究意義】在逆境脅迫下，植物可通過促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs）級聯途徑響應，經過MAPKKK（MAPK kinase kinase）-MAPKK（MAPK kinase）-MAPK的依次磷酸化作用，將外界逆境信號級聯放大并傳遞至下游，調控相應的生理生化反應（Hamel et al.，2006）。目前，國內外學者對MAPKs級聯途徑的研究越來越多，結果發(fā)現MAPKs級聯途徑在植物生長發(fā)育、抗病及非生物脅迫響應、植物激素信號轉導通路和乙烯信號轉導過程中均發(fā)揮重要作用（趙琳琳等，2008）。茶樹喜好溫暖濕潤的生長環(huán)境，且偏好酸性土壤，低溫、干旱和高鹽等逆境條件下會導致茶樹生長發(fā)育不良甚至死亡，對成茶品質產生嚴重影響。因此，研究茶樹MAPKs級聯途徑相關基因對其抗逆境脅迫的分子機制研究及抗逆育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】MAPKK是雙特異性蛋白酶，在MAPKs級聯途徑中，上游被激活的MAPKKK能磷酸化MAPKK中保守的S/T-X3-5-S/T（S為絲氨酸，T為蘇氨酸，X為任意氨基酸）基序（Wu et al.，2014），從而激活MAPKK，然后MAPKK通過對MAPK活化環(huán)中T-X-Y（T為蘇氨酸，Y為酪氨酸）基序的磷酸化而激活MAPK，最終通過激活的MAPK來激活下游應答因子將胞外逆境信號傳遞到細胞內進行響應。植物MAPKK在MAPKs級聯途徑中的成員數量最少。據報道，擬南芥基因組中至少存在60個AtMAPKKK基因和20個AtMAPK基因，但僅10個AtMAPKK基因被鑒定出（張振才等，2014）。根據S/T-X3-5-S/T保守結構和D激活位點，AtMAPKK基因家族可區(qū)分為A、B、C和D 4個亞族，其中AtMAPKK1、AtMAPKK2和AtMAPKK6屬于A亞族，AtMAPKK3屬于B亞族，AtMAPKK4和AtMAPKK5屬于C亞族，AtMAPKK7、AtMAPKK8、AtMAPKK9和AtMAPKK10屬于D亞族（Hamel et al.，2006）。此外，MAPKK是上游逆境信號的聚集點，也是下游MAPK的分支點，因此，對MAPKK功能的揭示是明確MAPKs級聯反應途徑作用機制的關鍵（Xu et al.，2010）。在逆境脅迫下，植物不同組織中的MAPKK基因表達量會發(fā)生上調或下調變化，然后通過MAPKs級聯途徑傳導脅迫信號，最終通過激素調控、滲透調節(jié)、氧化還原和信號轉導等對非生物脅迫作出應答。擬南芥AtMKK1基因參與多種擬南芥響應生物和非生物脅迫過程中的信號轉導，包括對脫落酸（ABA）的響應調控（蔡國華等，2013）;將玉米ZmMKK1基因轉入擬南芥中，可提高轉基因植株的耐鹽性和抗旱性（Cai et al.，2014）;棉花GhMKK3基因在響應干旱脅迫下被誘導上調表達，表明該基因參與干旱脅迫響應調控（Wang et al.，2016）?！颈狙芯壳腥朦c】目前鮮見有關茶樹MAPKK基因及MAPK信號通路在茶樹抗逆過程中作用機制的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】克隆茶樹CsMAPKK3基因cDNA全長序列，對其進行生物信息學分析，并檢測該基因在外源ABA、鹽脅迫、干旱脅迫和低溫脅迫下的表達模式，并從茶樹（舒茶早）基因組數據庫中檢索該基因的啟動子序列，分析其順式作用元件，為深入研究茶樹MAPKK基因響應逆境脅迫中的分子機制和調控機理提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為3年生盆栽茶樹品種鐵觀音的茶苗。多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自杭州開泰生物有限公司;Easy Script @One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒和Transstart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒購自廈門泰京生物技術有限公司。主要儀器設備：GeIDoc It TS3 Imager凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）、CFX96 Touch熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）、T100TM Thermal Cycler PCR儀（Bio-Rad，美國）、瓊脂糖水平電泳儀和電泳槽（北京六一儀器有限公司）、AIRTECH紫外超凈工作臺（蘇州安泰科技有限公司）和NanoDrop ND2000超微量分光光度計（Thermo Scientific，賽默飛世爾科技公司）。

1. 2 樣品處理及采集

取供試材料的根、莖、葉、花和果實，每組織設3次生物學重復。參照曹紅利等（2017）的方法對材料進行低溫（4 ℃）、ABA（100 μmol/L ABA）、高鹽（150 mmol/L NaCl）和干旱（100 g/L PEG）4種脅迫處理，分別在處理后3、9和24 h進行取樣，以0 h為對照，每處理設3次生物學重復。所取樣品經液氮速凍后放-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 總RNA提取及cDNA合成

根據多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明提取總RNA，利用NanoDrop ND2000超微量分光光度計測定其濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照Easy Script@One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明將所提取的總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈，用于逆轉錄PCR（RT-PCR）和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。

1. 4 基因克隆及啟動子序列分析

根據本課題組前期試驗獲得的茶樹低溫轉錄組數據庫中的基因注釋，篩選出1個MAPKK3基因序列，將該參考序列在NCBI中進行比對后顯示其含有完整的開放閱讀框（ORF），因此設計ORF上、下游擴增引物（表1），按照PrimeSTAR HS試劑盒的說明配制50.0 μL體系進行PCR擴增。擴增程序：94 ℃預變性30 s，98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 90 s，共進行30個循環(huán)。PCR產物回收測序后與原序列拼接，最終獲得該基因的cDNA序列。并根據cDNA序列在舒茶早茶樹基因組數據庫中檢索，獲得其密碼子上游序列2000 bp的序列，最終得到1714 bp啟動子序列。

1. 5 生物信息學分析

利用NCBI數據庫中的BLASTn和BLASTp對CsMAPKK3基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進行同源性分析，并利用DNAMAN 6.0將CsMAPKK3與同源蛋白序列進行多重比對。使用ExPASy在線工具中的ProtParam預測CsMAPKK3蛋白的理化性質;使用SingalP 3.0預測其信號肽;利用TMHMM 2.0預測其跨膜螺旋結構域;采用NetPhos 3.1 Server預測其磷酸化位點;利用Plant-mPLoc和WOLF PSORT預測其亞細胞定位。將獲得的CsMAPKK3基因啟動子序列提交至PlantCARE中對其逆境相關順式作用元件進行預測。利用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining method）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 6 qRT-PCR檢測

通過qRT-PCR檢測CsMAPKK3基因在茶樹不同組織及4種脅迫處理下的表達情況，以CsPTB為內參基因，定量PCR引物見表1。參照Transstart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒說明配制反應體系（20.0 μL），包括2×TransTaq HiFiPCR SuperMix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性30 s;94 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。采用2-ΔCt算法計算目的基因在組織中的相對表達量，2-ΔΔCt算法計算其在非生物脅迫下的相對表達量。

1. 7 統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0對數據采用LSD法和Dunnett法進行顯著性分析（P<0.05），使用Excel 2020繪制柱形圖。

2 結果與分析

2. 1 CsMAPKK3基因克隆及序列分析結果

如圖1所示，CsMAPKK3基因ORF的PCR產物約1500 bp，與預期結果相符，其測序結果顯示，該序列為1557 bp，與參考序列拼接后，獲得cDNA全長為1941 bp。CsMAPKK3基因編碼518個氨基酸殘基，且氨基酸序列中含有D（I/L/V）K激活域以及S/T-X3-5-S/T保守域（圖2）。該基因序列已提交至GenBank，登錄號為AUD40506.1。

2. 2 生物信息學分析結果

ProtParam預測結果顯示，CsMAPKK3蛋白分子式為C2566H3996N682O768S26，相對分子量為57.52 kD，含酸性氨基酸（Asp+Glu）63個、堿性氨基酸（Arg+Lys）48個，理論等電點（pI）為5.39，不穩(wěn)定系數為42.07，屬于不穩(wěn)定蛋白。TMHMM 2.0預測結果（圖3）顯示，CsMAPKK3蛋白無跨膜螺旋結構和信號肽。SignalP 3.0信號肽預測結果與TMHMM預測結果相同，即該蛋白無信號肽。

NetPhos 3.1 Server預測結果（圖4）顯示，CsMAPKK3蛋白含有52個能被磷酸化的位點（超過閾值線），其中包括27個Ser位點、16個Thr和9個Tyr位點，主要被unsp、cdc2、CKII和INSR等蛋白激酶磷酸化。Plant-mPLoc預測結果顯示，CsMAPKK3蛋白定位于細胞核;WOLF PSORT預測結果顯示，其定位于細胞質和細胞核（K值分別為11和2），故推測CsMAPKK3蛋白的亞細胞定位可能定位于細胞質和細胞核中。利用NCBI中BLASTp對CsMAPKK3蛋白功能結構域進行分析，結果（圖5）發(fā)現，CsMAPKK3蛋白屬于PKc類型的MAPKK，且具有SPS1、S_TKc等催化結構域。

用NCBI數據庫中BLASTn對CsMAPKK3基因進行同源比對，結果顯示該基因與葡萄（Vitis vini-fera）MAPKK3基因（GenBank登錄號MT154083.1）的相似性最高，達85%，與栓皮櫟（Quercus suber）MAPKK3基因（GenBank登錄號XM_024032986.1）和巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）MAPKK3基因（GenBank登錄號XM_021788394.1）的相似性均達84%。從NCBI數據庫下載CsMAPKK3的同源蛋白氨基酸序列，并利用DNAMAN 6.0進行多重序列比對，結果（圖6）顯示，CsMAPKK3、擬南芥AtMKK3、玉米ZmMKK3和中華獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis）PSS35243.1序列中均含D（I/L/V）K激活域和S/T-X3-5-S/T保守域。以CsMAPKK3蛋白與擬南芥的10個AtMAPKK蛋白構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果（圖7）顯示，CsMAPKK3蛋白與擬南芥B亞家族聚為一類，其中，與AtMKK3蛋白關系最近。以CsMAPKK3蛋白與其他17種植物的MAPKK蛋白構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果（圖8）表明，CsMAPKK3蛋白與中華獼猴桃PSS35243.1親緣關系最近。

2. 3 CsMAPKK3基因啟動子順式作用元件分析結果

在PlantCARE中對茶樹CsMAPKK3基因啟動子序列進行順式作用元件預測分析，結果（表2）顯示，啟動子區(qū)含有與光響應相關元件如ACE、ATCT-motif、Box 4、MRE和TCCC-motif等，以及多種逆境響應相關元件如TC-rich repeats等。此外，還含有與植物激素響應相關元件如脫落酸響應元件ABRE、水楊酸響應元件TCA-element等，以及與厭氧誘導相關元件如ARE等。

2. 4 CsMAPKK3基因在不同組織及逆境脅迫處理下表達模式分析結果

CsMAPKK3基因在根、莖、葉、花和果中均有表達，其中在莖和果的表達量較高，顯著高于花中的表達量，但與根和葉中的表達量均無顯著差異（P>0.05）（圖9-A）。CsMAPKK3基因在4種逆境脅迫處理（ABA、高鹽、低溫和干旱）下的表達量檢測結果如圖9-B～圖9-E所示。ABA處理后CsMAPKK3基因較處理0時顯著上調表達（P<0.05，下同），在9 h時達最大值（圖9-B）;高鹽脅迫處理也能顯著誘導CsMAPKK3基因顯著上調表達，在3 h時達最大值（圖9-C）;低溫脅迫處理下CsMAPKK3基因的表達模式與其他3個處理完全相反，其表達量呈顯著下調趨勢，在24 h時達最小值（圖9-D）;干旱脅迫處理下CsMAPKK3基因的表達量與ABA處理呈相似的變化趨勢，在9 h時顯著上調表達，表達量達最大值（圖9-E）。推測CsMAPKK3基因參與茶樹ABA、高鹽、低溫和干旱脅迫響應調控。

3 討論

自Ichimura等（1998）首次從模式植物擬南芥中鑒定出1條完整的MAPKs級聯途徑AtMEKK1-AtMKK1-AtMPK4，并證明其能傳遞干旱和機械損傷信號后，Teige等（2004）也在擬南芥中發(fā)現另一條MAPKs級聯途徑AtMEKK1-AtMAPKK2-AtMAPK4/AtMAPK6，并證實其參與抵御鹽脅迫和低溫脅迫;Schrnidt等（2013）研究發(fā)現MAPKs級聯途徑OsMEKK6-OsMAPK5參與水稻根部對鹽脅迫的信號轉導?？梢姡琈APKs級聯途徑在響應非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，而MAPKK作為連接上游MAPKKK和下游MAPK的信號樞紐，是MAPKs級聯途徑中的關鍵點（單鴻軒和付暢，2017）。本研究克隆獲得CsMAPKK3基因，并進行組織表達特性及非生物脅迫下表達模式分析，以期為研究MAPKs級聯途徑在茶樹中的抗逆作用機制提供參考。CsMAPKK3亞細胞定位結果顯示其可能定位于細胞質和細胞核中，與玉米ZmMKK3蛋白定位在細胞質和細胞核中的預測結果一致（Zhang et al.，2012）。而在此前與MAPKK定位相關的研究中，發(fā)現大多MAPKK蛋白定位于細胞質（Song et al.，2015），但也有定位于細胞核（Song et al.，2015）的報道，可能是由于MAPKK在細胞質中被上游MAPKKK激活，隨后轉移至細胞核磷酸化其下游的MAPK所導致。

本研究發(fā)現，CsMAPKK3基因啟動子序列中含有與響應ABA脅迫和水楊酸等激素信號分子相關的多種順式作用元件，推測該基因參與激素信號分子調控，從而影響植物生長發(fā)育。且通過qRT-PCR檢測發(fā)現，CsMAPKK3基因在茶樹莖和果中的表達量較高，與黃瓜CsMAPK4-2基因在果實中表達量最高，其旁系同源基因CsMAPK4-1在莖中的表達量較高的結果相似（Wang et al.，2015）;CsMAPKK3基因受高鹽和干旱脅迫誘導表達顯著上調，推測該基因可能參與茶樹耐鹽和抗旱響應。李粲等（2012）克隆獲得甘蔗SoMAPK4基因，并證實該基因可能參與多種生物和非生物脅迫響應的信號傳導。Song等（2015）研究發(fā)現，西瓜ClMKK3基因受非生物（干旱、高鹽、高溫和ABA）脅迫不同程度誘導上調表達，但低溫脅迫抑制其顯著下調表達，表明該基因在逆境脅迫中發(fā)揮重要調控功能;ClMKK5基因在西瓜枯萎菌侵染后第9 d時的表達量是對照的6倍，表明該基因在西瓜抗枯萎病過程中發(fā)揮重要調控功能（Song et al.，2015）。張演義等（2015）對葡萄MAPKK基因家族進行鑒定分析，結果發(fā)現MAPKK基因家族對植物生長發(fā)育細胞周期調控以及響應環(huán)境脅迫方面有重要作用。

基于前人對植物抗旱耐鹽基因的研究結果，發(fā)現這些基因主要包括滲透調節(jié)基因、蛋白類基因（如信號傳導中的蛋白激酶基因）及轉錄因子基因（陳麗萍和何道一，2010）。CsMAPKK3基因則屬于蛋白類基因。蛋白磷酸化及去磷酸化過程在細胞的信號識別和轉導中發(fā)揮重要作用，而細胞信號識別和轉導又直接影響植物體對環(huán)境變化的感應和對逆境信息的傳遞，故在這個過程中蛋白激酶發(fā)揮重要的作用。通過蛋白質組學研究發(fā)現，在逆境條件下許多與逆境相關的蛋白表達量會發(fā)生明顯變化（付晨熙等，2016）。因此，后續(xù)應重點研究CsMAPKK3蛋白在逆境中的調控機制及CsMAPKK3基因在MAPKs級聯途徑中的作用分子機制。

4 結論

CsMAPKK3基因表達具有組織表達特異性，且參與茶樹ABA、高鹽、低溫和干旱脅迫響應等逆境脅迫的分子調控。

參考文獻：

蔡國華，王麗，潘教文，孔祥培，李德全. 2013. 擬南芥AtMKK1結構特征和信號轉導功能研究進展[J]. 植物生理學報，49（3）：225-233. doi：10.13592/j.cnki.ppj.2013.03.012. [Cai G H，Wang L，Pan J W，Kong X P，Li D Q. 2013. Research progress of structure characteristics and signal transduction functions of AtMKK1 in Arabidopsis[J]. Plant Physiology Journal，49（3）：225-233.]

曹紅利，陳丹，葉乃興，郭雅玲，岳川. 2017. 茶樹CsMAPK3的全長克隆及其逆境表達分析[J]. 園藝學報，44（11）：2203-2214. doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0367. [Cao H L，Chen D，Ye N X，Guo Y L，Yue C. 2017. Clo-ning and abiotic stress expression analysis of CsMAPK3 gene in tea plant[J]. Acta Horticulturae Sinica，44（11）：2203-2214.]

陳麗萍，何道一. 2010. 植物抗旱耐鹽基因的研究進展[J]. 基因組學與應用生物學，29（3）：542-549. doi：10.3969/gab. 029.000542. [Chen L P，He D Y. 2010. Research advance on drought and salt resistant genes in transgenic plants[J]. Genomics and Applied Biology，29（3）：542-549.]

付晨熙，肖自華，高飛，周宜君. 2016. 植物應答非生物脅迫的蛋白質組學研究進展[J]. 基因組學與應用生物學，35（12）：3569-3582. doi：10.13417/j.gab.035.003569. [Fu C X，Xiao Z H，Gao F，Zhou Y J. 2016. Progress on proteomics to reveal abiotic stress response in plant[J]. Genomics and Applied Biology，35（12）：3569-3582.]

李粲，滕崢，劉開雨，桑洪玉，盧雙楠，方位寬，梁朝旭，劉曉靜，何珊珊，劉芳，邱永福，李鳴，李容柏. 2012. 甘蔗MAP激酶基因SoMAPK4克隆與生物信息學分析[J]. 南方農業(yè)學報，43（6）：727-732. doi：10.3969/j：issn.2095-1191. 2012.06.727. [Li C，Teng Z，Liu K Y，Sang H Y，Lu S N，Fang W K，Liang C X，Liu X J，He S S，Liu F，Qiu Y F，Li M，Li R B. 2012. Cloning and bioinformatic analysis of mitogen-activated protein kinase gene SoMAPK4 in sugarcane[J]. Journal of Southern Agriculture，43（6）：727-732.]

單鴻軒，付暢. 2017. 逆境脅迫下植物MAPK級聯反應途徑研究新進展[J]. 核農學報，31（4）：680-688. doi：10.11869/j.issn.100-8551.2017.04.0680. [Shan H X，Fu C. 2017. The recent advances on plant MAPK cascade pathway under adverse stress conditions[J]. Journal of Nuclear Agriculture Sciences，31（4）：680-688.]

張演義，呂福堂，張全軍，房經貴. 2015. 葡萄MAPKK基因家族的識別與分析[J]. 西南農業(yè)學報，28（4）：1791-1797. doi：10.16213/j.cnki.scjas.2015.04.070. [Zhang Y Y，Lü F T，Zhang Q J，Fang J G. 2015. Identification and analysis of MAPKK gene family in Vitis vinifera[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，28（4）：1791-1797.]

張振才，梁燕，李翠. 2014. 植物MAPK級聯途徑及其功能研究進展[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），42（4）：207-214，doi：10.13207/j.cnki.jnwafu.2014.04.013. [Zhang Z C，Liang Y，Li C. 2014. Review on plant MAPK cascades and their functions[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），42（4）：207-214.]

趙琳琳，徐啟江，李玉花. 2008. 生物和非生物脅迫下的植物細胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導[J]. 植物生理學通訊，44（1）：169-174. doi：10.13592/j.cnki.ppj. 2008.01.017. [Zhao L L，Xu Q J，Li Y H. 2008. The mitogen-activated protein kinase signal transduction in plant cell under biotic and abiotic stress conditions[J]. Plant Physiology Communications，44（1）：169-174.]

Cai G H，Wang G D，Wang L，Liu Y，Pan J W，Li D Q. 2014. A maize mitogen-activated protein kinase kinase，Zm-MKK1，positively regulated the salt and drought tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Journal of Plant Physiology，171（12）：1003-1016. doi：10.1016/j.jplph.2014.02.012.

Hamel L P，Nicole M C，Sritubtim S，Morency M J，Ellis M，Ehlting J，Beaudoin N，Barbazuk B，Klessig D，Lee J，Martin G，Mundy J，Ohashi Y，Scheel D，Sheen J，Xing T，Zhang S Q，Seguin A，Ellis B E. 2006. Ancient signals：Comparative genomics of plant MAPK and MAPKK gene families[J]. Trends in Plant Science，11（4）：192-198. doi：10.1016/j.tplants.2006.02.007.

Ichimura K，Mizpguchi T，Irie K，Morris P，Giraudat J，Matsumoto K，Shinozaki K. 1998. Isolation of ATMEKK1（a MAP kinase kinase kinase）：Interacting proteins and analy-sis of a MAP kinase cascade in Arabidopsis[J]. Biochemi-cal & Biophysical Research Communications，253（2）：532-543. doi：10.1006/bbrc.1998.9796.

Schrnidt R，Mieulet D，Hubberten H M，Obata T，Hoefgen R，Alisdair R，Fernie，Fisahn J，Segundo B S，Guiderdoni E，Schippers J，Bernd M R 2013. Salt-responsive ERF1 regu-lates reactive oxygen species-dependent signaling during the initial response to salt stress in rice[J]. The Plant Cell，25（6）：2115-2131. doi：10.1105/TPC.113.113068.

Song Q M，Li D Y，Dai Y，Liu S X，Huang L，Hong Y B，Zhang H J，Song F M. 2015. Characterization，expression patterns and functional analisis of the MAPK and MAPKK genes in watermelon（Citrullus lanatus）[J]. BMC Plant Biology，15（1）：298-321. doi：10.1186/s12870-015-0681-4.

Teige M，Scheikl E，Eulgem T，Doczi R，Ichimura K，Shinozaki K，Shinozaki K，Jeffery L，Dangl，Hirt H. 2004. The MKK2 pathway mediates cold and salt stress signaling in Arabidopsis[J]. Molecular Cell，15（1）：141-152. doi：10. 1016/j.molcel.2004.06.023.

Wang C，Lu W J，He X W，Wang F，Zhou Y L，Guo X L，Guo X Q. 2016. The cotton Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 3 functions in drought tolerance by regulating stomatal responses and root growth[J]. Plant Cell Physiology，57（8）：1629-1642. doi：10.1093/pcp/pcw090.

Wang J，Pan C T，Wang Y，Ye L，Wu J，Chen L F，Zou T，Lu G. 2015. Genome-wide identification of MAPK，MAPKK，and MAPKKK gene families and transcriptional profiling analysis during development and stress response in cucumber[J]. BMC Genomics，16（1）：1-22. doi：10.1186/s12864-015-1621-2.

Wu J，Wang J，Pan C T，Guan X Y，Wang Y，Liu S Y，He Y J，Chen J L，Chen L F，Lu G. 2014. Genome-wide identification of MAPKK and MAPKKK gene families in tomato and transcriptional profiling analysis during development and stress response[J]. PLoS One，9（7）：103032. doi：10. 1371/journal.pone.0103032.

Xu H N，Li K Z，Yang F J，Shi Q H，Wang X F. 2010. Overexpression of CsNMAPK in tobacco enhanced seed germination under salt and osmotic stresses[J]. Molecular Biology Reports，37（7）：3157-3163. doi：10.1007/s11033-009-9895-6.

Zhang M Y，Pan J W，Kong X P，Zhou Y，Liu Y，Sun L P，Li D Q. 2012. ZmMKK3，a novel maize group B mitogen-activated protein kinase kinase gene，mediates osmotic stress and ABA signal responses[J]. Journal of Plant Phy-siology，169（15）：1501-151. doi：10.1016/j.jplph.2012.06. 008.

（責任編輯 陳 燕）