李浩 陳亞平 魯智慧 郭建洋 李亞紅 朱林云 和淑琪 桂富榮

摘要：【目的】明確草地貪夜蛾[Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）]及其近緣種斜紋夜蛾[Spodoptera litura （Fabricius）]幼蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶對(duì)2種不同作用類(lèi)型殺蟲(chóng)劑的響應(yīng)，為草地貪夜蛾和斜紋夜蛾的田間防控及抗藥性治理提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎萌~片浸漬法測(cè)定甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)的毒力，并用2種殺蟲(chóng)劑亞致死濃度（LC25）和致死中濃度（LC50）處理過(guò)的小麥葉片分別飼喂2種害蟲(chóng)的3齡幼蟲(chóng)，比較取食6、12、18、24和48 h后幼蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶[超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）]及解毒酶[谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、細(xì)胞色素P450（CYP450）和羧酸酯酶（CarE）]的活性變化?！窘Y(jié)果】甲維鹽對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾的毒力高于氯蟲(chóng)苯甲酰胺。2類(lèi)殺蟲(chóng)劑脅迫下2種害蟲(chóng)的CYP450活性均上升，且草地貪夜蛾的CYP450活性高于斜紋夜蛾，在甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺低劑量（LC25）脅迫下草地貪夜蛾的CYP450活性均高于高劑量（LC50）脅迫處理，處理后48 h均達(dá)最高值（15.72±0.41和15.36±0.47 ng/mL）;而草地貪夜蛾另2種解毒酶（GST和CarE）活性在甲維鹽處理后低于斜紋夜蛾。甲維鹽脅迫下2種害蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶（SOD和POD）活性均降低，且草地貪夜蛾保護(hù)酶活性低于斜紋夜蛾;氯蟲(chóng)苯甲酰胺脅迫下草地貪夜蛾保護(hù)酶（SOD和POD）活性均上升，高劑量氯蟲(chóng)苯甲酰胺脅迫下2種害蟲(chóng)SOD和CAT活性均高于低劑量脅迫處理，且草地貪夜蛾SOD和CAT活性高于斜紋夜蛾。2種害蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性對(duì)2類(lèi)殺蟲(chóng)劑響應(yīng)差異明顯，且物種、藥劑、濃度、時(shí)間、物種×濃度和藥劑×濃度因素對(duì)2種害蟲(chóng)保護(hù)酶和解毒酶活性均有極顯著影響（P<0.01）。2類(lèi)殺蟲(chóng)劑脅迫下2種害蟲(chóng)的SOD和CAT活性間相關(guān)性較強(qiáng)?！窘Y(jié)論】草地貪夜蛾對(duì)甲維鹽的敏感性高于斜紋夜蛾，而對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的敏感性低于斜紋夜蛾，且2種害蟲(chóng)均主要通過(guò)增強(qiáng)CYP450活性對(duì)殺蟲(chóng)劑進(jìn)行解毒代謝。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上推薦使用甲維鹽作為防治草地貪夜蛾的藥劑。

關(guān)鍵詞： 草地貪夜蛾;斜紋夜蛾;保護(hù)酶;解毒酶;抗藥性

中圖分類(lèi)號(hào)： S433.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）03-0559-11

Response comparison of protective and detoxification enzymes in Spodoptera frugiperda（J. E. Smith） and Spodoptera litura （Fabricius） larvae to two insecticides

LI Hao1， CHEN Ya-ping1， LU Zhi-hui1，GUO Jian-yang2， LI Ya-hong3，

ZHU Lin-yun1， HE Shu-qi1*， GUI Fu-rong1，4*

（1Plant Protection College， Yunnan Agricultural University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources in Yunnan， Kunming? 650201， China; 2Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing? 100193， China; 3Yunnan Plant Protection and Quarantine Station， Kunming? 650034， China;

4Yunnan Plateau Characteristic Agriculture Industry Research Institute， Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】The research aimed to clarify the response of different insecticides on the activities of protective enzymes and detoxification enzymes in the larvae of Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）and Spodoptera litura （Fabricius） to two insecticides， and to provide theoretical basis for further study on the field control and and insecticide resistance mechanism of S. frugiperda and S. litura. 【Method】The toxicity of emamectin and chlorantraniliprole to the 3rd instar larvae of S. frugiperda and S. litura were assayed by leaf-dipping method by feeding wheat leaves treated with? sublethal concentration（LC25） and median lethal concentration（LC50） of the pesticides respectively， and the activities of protective enzymes[superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD） and catalase（CAT）] and detoxification enzymes [glutathione S-transferase（GST）， cytochrome P450（CYP450） and carboxylesterase（CarE）] in larvae after being treated for 6， 12， 18， 24 and 48 h were measured and analyzed. 【Result】The toxicity of emamectin to S. frugiperda and S. litura was higher than that of chlorantraniliprole. The activity of CYP450 in both pests increased after the two insecticide treatments， and was significantly higher in S. frugiperda than that in S. litura. The CYP450 activity in S. frugiperda was more active at low concentration（LC25） of emamectin and chlorantraniliprole than at high concentration（LC50）， which was the highest at 48 h as 15.72±0.41（emamectin） and 15.36±0.47 ng/mL（cholrantraniliprole）. However， the activities of two detoxification enzymes GST and CarE in S. frugiperda were lower than those in S. litura after emamectin treatment. The activities of protective enzymes SOD and POD in both pests decreased after treated with emamectin， and were lower in S. frugiperda than those in S. litura; while the activities of SOD and POD in S. frugiperda increased after treated with chlorantraniliprole. The activities of SOD and CAT were higher in both pests at LC50 chlorantraniliprole than at LC25， and were higher in S. frugiperda than in S. litura. The response activities of protective enzymes and detoxification enzymes in both pests were greatly affected by the two insecticides， and species， insecticide， concentration， time， species×concentration and insecticide×concentration had extremely significant effects on the activities of protective enzymes and detoxification enzymes（P<0.01）. There was a strong correlation between the activities of SOD and CAT of both S. frugiperda and S. litura under two insecticides treatments. 【Conclusion】The susceptibility of S. frugiperda to emamectinis higher than that of S. litura， while the sensitivity to chlorantraniliprole is lower than that of S. litura， and the two pests enhance detoxification metabolism of insecticides by increasing CYP450 activity. In agricultural production， it is recommended to use emamectin as an agent for controlling S. frugiperda.

Key words： Spodoptera frugiperda（J. E. Smith.）; Spodoptera litura（Fabricius）; protective enzyme; detoxification enzyme; pesticide resistance

Foundation item：National Key Research and Development Program of China（2019YFD0300101，2019YFD0300-104）;Major Science and Technology Special Project of Yunnan（2019ZG00910）

0 引言

【研究意義】草地貪夜蛾[Spodoptera frugiperda （J. E. Smith）]隸屬于鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種具有重大入侵性且危害嚴(yán)重的全球性雜食性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，幼蟲(chóng)可為害禾本科（玉米、小麥、水稻等）、十字花科（甘藍(lán)、白菜等）和茄科（馬鈴薯、番茄等）等350多種寄主植物（Goergen et al.，2016;Montezano et al.，2018）。草地貪夜蛾的同屬近緣本地種斜紋夜蛾[Spodoptera litura （Fabricius）]廣泛分布于亞洲和大洋洲，且與草地貪夜蛾有較高的生態(tài)位重疊（趙勝園等，2019a）。草地貪夜蛾作為入侵物種，其與本地種斜紋夜蛾對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性水平及生理適應(yīng)性差異至今鮮有研究報(bào)道。目前，草地貪夜蛾的防治手段仍以化學(xué)防治為主，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（Emamectin benzoate）、氯蟲(chóng)苯甲酰胺（Chlorantraniliprole）等化學(xué)農(nóng)藥對(duì)草地貪夜蛾具有良好的防效（Okuma et al.，2018;宋潔蕾等，2019）。探明不同作用類(lèi)型殺蟲(chóng)劑對(duì)入侵種草地貪夜蛾和本地種斜紋夜蛾保護(hù)酶和解毒酶活性的影響，明確其對(duì)藥劑的解毒代謝機(jī)制，對(duì)延緩害蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生及保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】相關(guān)研究表明，昆蟲(chóng)體內(nèi)的細(xì)胞色素P450（CYP450）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和羧酸酯酶（CarE）等主要解毒酶在應(yīng)對(duì)殺蟲(chóng)劑及其他外源或內(nèi)源有害物質(zhì)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Zhang et al.，2017;李長(zhǎng)春等，2019;魯智慧等，2020），解毒酶活性的改變與昆蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生有關(guān)（何超等，2020），解毒代謝增強(qiáng)是草地貪夜蛾對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的主要原因（Teixeira and Andaloro，2013）。張百重等（2020）、Zhang等（2020）研究發(fā)現(xiàn)用甲維鹽、氯蟲(chóng)苯甲酰胺和Bt殺蟲(chóng)蛋白處理可誘導(dǎo)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)CYP4G、CYP321A、CYP321B、CYP6AB和CYP6AE等亞家族的多個(gè)基因高表達(dá)，從而增強(qiáng)害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性。Gui等（2020）研究23種常用殺蟲(chóng)劑對(duì)草地貪夜蛾轉(zhuǎn)錄組的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)殺蟲(chóng)劑處理后草地貪夜蛾體內(nèi)與殺蟲(chóng)劑代謝相關(guān)的CYP450、GST、CarE和腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）等家族中的多個(gè)基因均被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。昆蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶基因的過(guò)表達(dá)可能引起抗藥性的產(chǎn)生，如對(duì)有機(jī)磷、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的草地貪夜蛾體內(nèi)CYP450、GST和CarE編碼基因過(guò)表達(dá)（Carvalho et al.，2013）。高祖鵬等（2020）研究發(fā)現(xiàn)乙基多殺菌素對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的毒殺效果高于氯蟲(chóng)苯甲酰胺，在不同濃度的乙基多殺菌素處理?xiàng)l件下，草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)的CarE和多功能氧化酶（MFO）活性有所提高。王芹芹等（2020）研究表明茚蟲(chóng)威對(duì)草地貪夜蛾MFO和GST活性具有顯著誘導(dǎo)作用，且增效醚（PBO）和順丁烯二酸二乙酯（DEM）對(duì)茚蟲(chóng)威有明顯的增效作用，故推測(cè)MFO和GST活性增強(qiáng)與草地貪夜蛾抗藥性發(fā)展相關(guān)。昆蟲(chóng)體內(nèi)的保護(hù)酶系主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT），當(dāng)受到包括殺蟲(chóng)劑在內(nèi)的外源化學(xué)物質(zhì)刺激時(shí)，3種保護(hù)酶的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，導(dǎo)致生物機(jī)體內(nèi)氧自由基濃度過(guò)高，破壞生物功能分子，使細(xì)胞功能受到威脅（Senthil-Nathan，2013;唐芬芬等，2019），蟲(chóng)體通過(guò)升高保護(hù)酶活性來(lái)最大限度降低外源物造成的氧化損傷（黃訓(xùn)兵等，2021）。【本研究切入點(diǎn)】目前，草地貪夜蛾與本地近緣種斜紋夜蛾的抗藥性差異比較鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以2種作用機(jī)制殺蟲(chóng)劑（甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺）為代表，在采用葉片浸漬法測(cè)定這2種殺蟲(chóng)劑對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)毒力的基礎(chǔ)上，分別以亞致死濃度（LC25）和致死中濃度（LC50）處理的小麥葉片飼喂2種害蟲(chóng)的3齡幼蟲(chóng)，用酶動(dòng)力法測(cè)定其體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性的差異，并分析物種—藥劑—濃度—時(shí)間的關(guān)系，以明確不同作用類(lèi)型殺蟲(chóng)劑對(duì)2種近緣種害蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性的影響，為草地貪夜蛾和斜紋夜蛾的田間防控及抗藥性治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試蟲(chóng)源 草地貪夜蛾于2019年5月采自云南省元江縣（東經(jīng)101°58′，北緯23°35′，海拔421 m），斜紋夜蛾購(gòu)自河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司，2種害蟲(chóng)均在人工氣候箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，MG-300A）內(nèi)采用未施用化肥及農(nóng)藥的淮麥36小麥葉片飼養(yǎng)15代以上[飼養(yǎng)溫度（27±0.5）℃，相對(duì)濕度（70±5）%，光周期L∶D=16 h∶8 h，下同]。選取3齡幼蟲(chóng)進(jìn)行毒力測(cè)定及酶活性檢測(cè)。

1. 1. 2 供試藥劑 98%甲維鹽原藥和98%氯蟲(chóng)苯甲酰胺原藥購(gòu)自江蘇泰越生物科技有限公司;SOD、POD、CAT、GST和CarE等試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，CYP450 ELISA試劑盒購(gòu)自上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 毒力測(cè)定 采用葉片浸漬法（IRAC）對(duì)2種殺蟲(chóng)劑進(jìn)行毒力測(cè)定。以丙酮分別溶解甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺原藥配制成母液，用含0.1% Triton X-100的雙蒸水按等比稀釋成5個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度3次重復(fù);以含0.1% Triton X-100雙蒸水為對(duì)照。將小麥葉片（5.0 cm×0.5 cm）在不同濃度藥液中浸漬15 s，取出晾干后放入養(yǎng)蟲(chóng)盒（18 cm×12 cm×8 cm）中，每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)盒放入大小一致、健康的3齡幼蟲(chóng)45頭，置于人工氣候箱中飼養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。48 h后觀察和統(tǒng)計(jì)各處理2種害蟲(chóng)的死亡情況，以毛筆輕觸幼蟲(chóng)無(wú)反應(yīng)視為死亡。

1. 2. 2 2種殺蟲(chóng)劑處理后草地貪夜蛾和斜紋夜蛾體內(nèi)保護(hù)酶及解毒酶活性測(cè)定 樣品藥劑處理：用含0.1% Triton X-100的雙蒸水分別將2種藥劑稀釋至相應(yīng)的LC25和LC50，將新鮮小麥葉片在藥液中浸漬15 s后取出，以在0.1% Triton X-100溶液中浸漬15 s的小麥葉片為對(duì)照，晾干后放入足量3齡幼蟲(chóng)的養(yǎng)蟲(chóng)盒內(nèi)。每個(gè)離心管分別收集6、12、18、24和48 h存活幼蟲(chóng)10頭為1個(gè)重復(fù)，每處理3次重復(fù)，立即浸入液氮，置于-80 ℃?zhèn)溆?。酶活性測(cè)定按試劑盒說(shuō)明操作。

酶源制備：分別取上述試蟲(chóng)10頭（約0.03 g），加入適量的預(yù)冷勻漿介質(zhì)后用高通量研磨儀粉碎，4 ℃下12000 r/min離心10 min，取上清液作為待測(cè)酶液。

酶活性測(cè)定：按照試劑盒說(shuō)明使用Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）分別測(cè)定酶活性。

SOD活性測(cè)定：以SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為1個(gè)酶活性單位（U）。

SOD抑制率（%）=[（對(duì)照OD-對(duì)照空白OD）-

（測(cè)定OD-測(cè)定空白OD）]/

（對(duì)照OD-對(duì)照空白OD）×100

SOD活性=SOD抑制率/50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)/

待測(cè)樣本蛋白濃度

POD活性測(cè)定：以每毫克組織蛋白在37 ℃每分鐘催化1 μg底物的酶量定義為1個(gè)酶活性單位（U）。

POD活性=（測(cè)定OD-空白OD）/（12×比色光徑）×

（反應(yīng)液總體積/樣本量）/反應(yīng)時(shí)間/

待測(cè)樣本蛋白濃度×1000

CAT活性測(cè)定：以每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol H2O2的量定義為1個(gè)酶活性單位（U）。

CAT活性=（對(duì)照OD-測(cè)定OD）×271×[1/（60×取

樣量）]/待測(cè)樣本蛋白濃度

GST活性測(cè)定：以每毫克組織蛋白在37 ℃扣除非酶促反應(yīng)，每分鐘降低1 μmol/L GSH的量為1個(gè)酶活性單位（U）。

GST活性=（對(duì)照OD-測(cè)定OD）/（標(biāo)準(zhǔn)OD-空白

OD）/反應(yīng)時(shí)間/（樣本取樣量×待測(cè)

樣本蛋白濃度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×反應(yīng)

體系稀釋倍數(shù)

CYP450活性測(cè)定：測(cè)定待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品OD，將待測(cè)樣品OD代入標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)直線(xiàn)回歸方程，計(jì)算樣品中昆蟲(chóng)CYP450活性。

CarE活性測(cè)定：以每毫克組織蛋白在37 ℃反應(yīng)每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活性單位（U）。

CarE活性=[（3 min 10 s測(cè)定OD-10 s測(cè)定OD）-

（3 min 10 s對(duì)照OD-10 s對(duì)照OD）]/

（待測(cè)樣品蛋白濃度×樣品取樣量）/

反應(yīng)時(shí)間×反應(yīng)體系總體積

蛋白含量測(cè)定：待測(cè)樣品蛋白濃度（μg/mL）=（測(cè)定OD-空白OD）/（標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD）×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS V7.05分析得到甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺的毒力方程及LC25和LC50。采用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），分別比較草地貪夜蛾和斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)同一時(shí)間不同劑量處理的保護(hù)酶和解毒酶活性差異顯著性;獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)比較同一藥劑處理濃度2種害蟲(chóng)保護(hù)酶和解毒酶活性差異顯著性;以物種、藥劑、濃度和時(shí)間為4個(gè)水平處理因子，應(yīng)用四因素方差分析（Four-way ANOVA）進(jìn)行處理間試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，并采用R語(yǔ)言函數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）和皮爾森（Pearson）相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 2種殺蟲(chóng)劑對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)的毒力測(cè)定結(jié)果

由表1可知，甲維鹽對(duì)2種害蟲(chóng)的毒力高于氯蟲(chóng)苯甲酰胺，其中甲維鹽對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)48 h的LC25和LC50分別為0.0065和0.0105 mg/L及0.0072和0.0128 mg/L，氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)48 h的LC25和LC50分別為0.0321和0.2448 mg/L及0.0288和0.2239 mg/L。同一處理時(shí)間下，甲維鹽對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾的LC25和LC50均小于氯蟲(chóng)苯甲酰胺，甲維鹽對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的LC25和LC50均小于斜紋夜蛾，而氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的LC25和LC50均大于斜紋夜蛾，說(shuō)明草地貪夜蛾對(duì)甲維鹽的敏感性高于斜紋夜蛾，而對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的敏感性低于斜紋夜蛾。

2. 2 甲維鹽對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶及解毒酶活性的影響

2. 2. 1 對(duì)保護(hù)酶活性的影響 甲維鹽處理后2種害蟲(chóng)保護(hù)酶（除斜紋夜蛾CAT外）活性均呈降低趨勢(shì)，高劑量（LC50處理）甲維鹽脅迫下，2種害蟲(chóng)SOD（圖1-A）和POD（圖1-B）活性均低于低劑量（LC25處理）脅迫處理，且草地貪夜蛾SOD和POD活性低于斜紋夜蛾，LC50處理草地貪夜蛾SOD和POD活性分別在處理后6和48 h達(dá)最低值（4.27±0.11和5.59±0.23 U/mg），僅為對(duì)照的73.17%和58.41%。LC25處理后的草地貪夜蛾CAT（圖1-C）活性低于LC50處理，且低于斜紋夜蛾，在處理后48 h達(dá)最低值（8.19±0.19 U/mg），僅為對(duì)照的68.17%，而斜紋夜蛾LC25處理的CAT活性高于LC50處理。

2. 2. 2 對(duì)解毒酶活性的影響 2種害蟲(chóng)的GST（圖1-D）和CYP450（圖1-E）活性均隨甲維鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈升高趨勢(shì)，且草地貪夜蛾CYP450活性高于斜紋夜蛾，而GST和CarE（圖1-F）活性低于斜紋夜蛾。其中LC25處理后的草地貪夜蛾CYP450和CarE活性均高于LC50處理，處理48 h均達(dá)最高值（15.72±0.41 ng/mL和2.64±0.04 U/mg），為對(duì)照的1.27和1.10倍，而GST活性低于LC50處理，在24 h達(dá)最高值（39.33±0.93 U/mg）;LC25處理后斜紋夜蛾GST和CarE活性均高于LC50處理，均在處理48 h達(dá)最高值（53.63±0.82和3.05±0.07 U/mg）。

2. 3 氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶及解毒酶活性的影響

2. 3. 1 對(duì)保護(hù)酶活性的影響 氯蟲(chóng)苯甲酰胺脅迫下草地貪夜蛾保護(hù)酶（SOD和POD）及斜紋夜蛾保護(hù)酶（SOD和CAT）活性均上升（表2），高劑量氯蟲(chóng)苯甲酰胺脅迫下的2種害蟲(chóng)SOD和CAT活性均高于低劑量脅迫處理，且草地貪夜蛾SOD和CAT活性高于斜紋夜蛾，LC50處理后18和12 h草地貪夜蛾SOD和CAT活性分別達(dá)最高值（8.74±0.16和15.01±0.18 U/mg），而LC25處理后草地貪夜蛾P(guān)OD活性高于LC50處理，且高于斜紋夜蛾，在處理后18 h達(dá)最高值（13.19±0.24 U/mg），為對(duì)照的1.39倍。

2. 3. 2 對(duì)解毒酶活性的影響 經(jīng)氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理后2種害蟲(chóng)解毒酶活性隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈升高趨勢(shì)，且草地貪夜蛾CYP450活性高于斜紋夜蛾，而GST活性低于斜紋夜蛾，其中，LC25處理后草地貪夜蛾的CYP450和CarE活性均高于LC50處理，處理48 h達(dá)最高值（15.36±0.47 ng/mL和3.51±0.09 U/mg），分別為對(duì)照的1.24和1.46倍，而GST活性低于LC50處理，處理后48 h達(dá)最高值（48.55±0.72 U/mg），為對(duì)照的1.08倍;LC25處理后斜紋夜蛾GST和CarE活性均高于LC50處理，處理后48 h達(dá)最高值（68.66±0.92和2.97±0.05 U/mg）。

2. 4 草地貪夜蛾和斜紋夜蛾酶活性主成分分析結(jié)果

物種×藥劑因素下草地貪夜蛾和斜紋夜蛾保護(hù)酶及解毒酶活性的主成分分析見(jiàn)圖2。第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)度為54.9%，第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)度為17.2%，二者的累積貢獻(xiàn)率為72.1%。草地貪夜蛾甲維鹽處理的保護(hù)酶和解毒酶活性在PC1的負(fù)方向，斜紋夜蛾甲維鹽處理在PC2的正方向，兩者間無(wú)重疊;而2種害蟲(chóng)氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理均在PC1正方向且有重疊，與2種害蟲(chóng)甲維鹽處理無(wú)重疊;說(shuō)明2種害蟲(chóng)氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理間的保護(hù)酶和解毒酶活性差異不明顯，但兩者均與2種害蟲(chóng)甲維鹽處理差異明顯。表明2種近緣種害蟲(chóng)體內(nèi)的保護(hù)酶及解毒酶對(duì)甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺響應(yīng)差異明顯。

2. 5 草地貪夜蛾和斜紋夜蛾酶活性變化的四因素方差分析結(jié)果

由表3可知，草地貪夜蛾和斜紋夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)SOD、POD、CAT、GST、CYP450和CarE活性修正模型F分別為40.06、95.07、37.07、60.40、24.57和60.08，處理間差異極顯著（P<0.01，下同），所選模型具有統(tǒng)計(jì)意義。其中，物種、藥劑、濃度、時(shí)間、物種×濃度、藥劑×濃度對(duì)3種保護(hù)酶和解毒酶活性均有極顯著影響;物種×藥劑、物種×藥劑×濃度對(duì)3種保護(hù)酶及CYP450和CarE活性均有極顯著影響;濃度×?xí)r間對(duì)CAT和3種解毒酶活性有極顯著影響;物種×藥劑×?xí)r間對(duì)GST和CarE活性有極顯著影響;物種×濃度×?xí)r間對(duì)GST和CYP450活性有極顯著影響。

2. 6 草地貪夜蛾和斜紋夜蛾酶活性相關(guān)分析結(jié)果

2種害蟲(chóng)酶活性的皮爾森相關(guān)分析結(jié)果表明，經(jīng)2種殺蟲(chóng)劑處理后，2種害蟲(chóng)體內(nèi)的SOD與CAT活性間相關(guān)性較強(qiáng)（圖3），其中，草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶SOD、POD和CAT間呈正相關(guān)，GST和CYP450活性與CarE呈正相關(guān)（圖3-A）;斜紋夜蛾P(guān)OD和CAT活性與SOD活性呈正相關(guān)，CYP450和CarE活性與GST活性呈正相關(guān)（圖3-B）。綜合GST、CYP450和CarE活性，推斷這3種與解毒代謝相關(guān)的酶在2種害蟲(chóng)應(yīng)對(duì)不同殺蟲(chóng)劑時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)活性相互協(xié)調(diào)、配合，共同抵御殺蟲(chóng)劑脅迫，其中以殺蟲(chóng)劑脅迫下草地貪夜蛾CYP450和CarE及斜紋夜蛾GST和CarE活性變化相關(guān)性較強(qiáng)。

3 討論

自2019年草地貪夜蛾入侵我國(guó)以來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者相繼開(kāi)展了殺蟲(chóng)劑對(duì)其毒力及防效研究。大量研究表明，新型作用機(jī)制殺蟲(chóng)劑甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)的毒殺效果，校正死亡率均超過(guò)90%（宋潔蕾等，2019;趙勝園等，2019b）。本研究中甲維鹽對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾的毒力均高于氯蟲(chóng)苯甲酰胺，與蔣興川等（2019）、宋潔蕾等（2019）報(bào)道的結(jié)果一致，且草地貪夜蛾對(duì)甲維鹽的敏感性高于斜紋夜蛾，而對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的敏感性低于斜紋夜蛾。

外源毒物可使昆蟲(chóng)體內(nèi)的O[-2]·、·OH和H2O2等活性氧自由基數(shù)量激增，對(duì)蟲(chóng)體產(chǎn)生毒害作用，而保護(hù)酶SOD、POD和CAT通過(guò)清除多余的活性氧自由基，使蟲(chóng)體不受外源毒物侵害（Bashan et al.，2009）。本研究中，經(jīng)甲維鹽處理后2種害蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶（除斜紋夜蛾CAT外）活性均呈降低趨勢(shì)，而氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理后草地貪夜蛾保護(hù)酶（SOD和POD）及斜紋夜蛾保護(hù)酶（SOD和CAT）活性均升高，表明SOD持續(xù)歧化O[-2]·，由CAT和POD分解H2O2，從而促使2種害蟲(chóng)能最大限度降低機(jī)體受到氯蟲(chóng)苯甲酰胺脅迫的氧化損傷（張文成等，2009）。同時(shí)，以高濃度氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理后2種害蟲(chóng)的保護(hù)酶活性均高于甲維鹽處理，表明保護(hù)酶活性升高可能是2種害蟲(chóng)對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的敏感性低于甲維鹽的原因之一。

為應(yīng)對(duì)環(huán)境中的外源有毒物質(zhì)如殺蟲(chóng)劑等壓力，昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中已形成解毒代謝途徑，其中體內(nèi)的GST、CYP450和CarE等解毒酶在解毒代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用（高祖鵬等，2020;Gui et al.，2020）。GST是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的II相解毒酶，通過(guò)催化還原型谷胱甘肽（GSH）和有毒物質(zhì)發(fā)生軛合反應(yīng)，使有毒軛合物的水溶性增強(qiáng)而更易排出體外，最終達(dá)到解毒代謝的目的（Song et al.，2020）。陳羿渠等（2017）研究表明，氯蟲(chóng)苯甲酰胺亞致死劑量處理甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸和脂肪體GST活性均升高，分別為對(duì)照的1.31和1.43倍;張振威等（2019）報(bào)道，舞毒蛾（Lymantria dispar）經(jīng)甲維鹽亞致死濃度處理后，幼蟲(chóng)體內(nèi)的GST活性高于對(duì)照，且隨著處理濃度的增加而升高。本研究以甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺LC50處理后草地貪夜蛾GST活性總體均升高，且低于斜紋夜蛾，表明在高濃度甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺脅迫下，草地貪夜蛾和斜紋夜蛾通過(guò)提高GST活性而增強(qiáng)解毒代謝作用，與戴瀚洋等（2015）、陳羿渠等（2017）關(guān)于甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)GST活性影響的結(jié)果類(lèi)似，同時(shí)表明殺蟲(chóng)劑脅迫下草地貪夜蛾GST活性低于斜紋夜蛾是草地貪夜蛾對(duì)甲維鹽敏感性高于斜紋夜蛾的原因之一。CYP450是昆蟲(chóng)體內(nèi)的重要代謝酶系之一，能代謝多種外源或內(nèi)源化合物（Riveron et al.，2013）。歐善生等（2012）研究報(bào)道，棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）經(jīng)氯蟲(chóng)苯甲酰胺脅迫后，3～6齡幼蟲(chóng)體內(nèi)CYP450活性均高于對(duì)照。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理后草地貪夜蛾CYP450活性均升高，且總體上高于斜紋夜蛾，表明草地貪夜蛾CYP450活性高于斜紋夜蛾是草地貪夜蛾對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺敏感性低于斜紋夜蛾的原因之一。Gui等（2020）通過(guò)基因組學(xué)分析揭示，入侵我國(guó)的草地貪夜蛾CYP450、解螺旋酶等多個(gè)基因家族出現(xiàn)顯著擴(kuò)增，其中CYP450家族多達(dá)425個(gè)基因，為本地種斜紋夜蛾的3倍，且有283個(gè)為草地貪夜蛾特有;在染色體水平基因組基礎(chǔ)上進(jìn)一步測(cè)定23種農(nóng)藥處理后的草地貪夜蛾轉(zhuǎn)錄組水平差異，發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾425個(gè)CYP基因中有107個(gè)基因差異表達(dá)明顯。本研究結(jié)果表明，在甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺脅迫下草地貪夜蛾CYP450活性升高是解毒代謝的關(guān)鍵。邢靜等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，以氯蟲(chóng)苯甲酰胺亞致死濃度處理3齡小菜蛾（Plutella xylostella）幼蟲(chóng)后，其體內(nèi)CarE活性顯著高于對(duì)照。蔣興川等（2019）研究報(bào)道，甲維鹽LC20處理后草地貪夜蛾3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)CarE活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)。本研究中，甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺LC25處理后草地貪夜蛾CarE活性均升高，且甲維鹽處理后CarE活性均低于斜紋夜蛾，與邢靜等（2011）、蔣興川等（2019）的研究結(jié)果類(lèi)似。任娜娜等（2014）研究表明，CarE在甲維鹽、氯蟲(chóng)苯甲酰胺等新型作用類(lèi)型殺蟲(chóng)劑的抗性發(fā)展中具有重要作用。Gui等（2020）研究顯示，入侵我國(guó)的草地貪夜蛾CarE家族基因數(shù)78個(gè)，僅為本地種斜紋夜蛾的一半。可見(jiàn)，草地貪夜蛾CarE活性低于斜紋夜蛾可能是對(duì)甲維鹽敏感性高的主要原因之一。

本研究首次比較入侵種草地貪夜蛾和本地種斜紋夜蛾對(duì)2種新型作用機(jī)制殺蟲(chóng)劑的酶活性響應(yīng)差異，探究2種夜蛾對(duì)殺蟲(chóng)劑脅迫下的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，為研究草地貪夜蛾的抗藥性機(jī)制和延緩抗藥性產(chǎn)生打下基礎(chǔ)，有關(guān)這2種殺蟲(chóng)劑對(duì)草地貪夜蛾和斜紋夜蛾的抗性選育和抗藥性基因篩選等有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

草地貪夜蛾對(duì)甲維鹽的敏感性高于斜紋夜蛾，而對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的敏感性低于斜紋夜蛾，且2種害蟲(chóng)均主要通過(guò)增強(qiáng)CYP450活性對(duì)殺蟲(chóng)劑進(jìn)行解毒代謝。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上推薦使用甲維鹽作為防治草地貪夜蛾的藥劑。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）