柯梟，胡曉，楊賢慶，陳勝軍，吳燕燕，薛長湖，李來好*

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003)2(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，國家水產(chǎn)品加工技術研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州，510300)

羅非魚是一種廣泛養(yǎng)殖的淡水魚，目前羅非魚工業(yè)化產(chǎn)品主要為魚片，加工過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物,如頭部，內(nèi)臟，骨骼，魚皮和魚鱗。其中魚皮含有豐富的膠原蛋白，可作為生物活性肽的理想原料。膠原蛋白具有特殊的三螺旋結構，其氨基酸序列呈現(xiàn)(G-X-Y)n周期性排列，G為甘氨酸，X多為脯氨酸[1]。因其含有豐富的甘氨酸和脯氨酸，因此具備良好的鋅離子螯合能力的潛質[2-3]。本研究選用羅非魚皮為原料，以期得到良好生物活性的螯合物。

鋅是一種體內(nèi)快速轉換的微量元素，由于人體缺乏鋅儲存功能，因此每天需要從飲食中獲得攝入量的20%～40%，以保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[4]。鋅在結構、催化和調節(jié)3個方面發(fā)揮重要作用[5]，缺鋅可能導致動脈粥樣硬化、類風濕性關節(jié)炎、多種惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病和衰老等慢性疾病[6]。傳統(tǒng)的無機鋅補充劑和有機鋅補充劑與胃酸或者食物中的草酸結合易形成沉淀[7]，導致鋅的生物利用率較低[8]。因此，開發(fā)一種高效、安全且易吸收的鋅離子補充劑至關重要。已有研究發(fā)現(xiàn)，多肽與鋅離子形成可溶性螯合物，這種螯合物以整體的形式被消化吸收，能夠有效地阻止鋅在胃腸道中形成沉淀[9-11]。

本研究以羅非魚為原料，分別用堿性蛋白酶、復合蛋白酶和胰蛋白酶提取膠原蛋白肽，以鋅離子螯合率為指標，篩選出最佳活性的膠原蛋白肽。通過高效液相色譜對其分子質量分布進行測定，并借助線性擬合來探究分子質量分布與鋅離子螯合率的相關性。運用紫外光譜和傅里葉紅外光譜對其螯合位點進行探究，通過掃描電鏡和原子力顯微鏡觀察螯合前后的形態(tài)結構變化。此外采用體外模擬胃腸道消化模型評估肽-鋅螯合物的生物利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮，廣東百維生物科技有限公司；堿性蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶和胃蛋白酶，酷爾化學科技有限公司；硫酸鋅，合肥巴斯夫生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽(307.3 Da)、氧化型L-谷胱甘肽(612.63 Da)、桿菌肽(1 422.69 Da)、抑肽酶(6 511.44 Da)和細胞色素C(12 400 Da)，北京睿博興科生物技術有限公司；以上試劑均為分析純。乙腈和三氟乙酸(色譜純)，Sigma-Aldrich化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

Titrando-809型自動電位滴定儀，瑞士萬通公司；KjeLtecTM-2300型蛋白自動分析儀，丹麥福斯分析儀器公司；THZ-C型臺式恒溫振蕩器，太倉華美生化儀器廠；ALpha1-4型冷凍干燥機，德國Christ公司；AvantiJ26XP型高速離心機，美國貝克曼庫爾特公司；LC-20AD高效液相色譜儀、IRAffinity-1型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；電感耦合等離子體質譜，美國安捷倫公司；SU1510 型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Dimension-Icon 原子力顯微鏡，德國布魯克公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠原蛋白肽制備

根據(jù)ZHANG等[12]方法略做修改。將羅非魚皮切成1 cm×1 cm的小片，用2 g/L NaOH溶液(1∶10，g∶mL)溶液浸泡30 min以除去雜蛋白和色素，隨后用蒸餾水沖洗直至pH=7。然后用2 g/L HCl 溶液浸泡15 min使其發(fā)生溶脹，并用蒸餾水沖洗直至pH=7。最后，將其在恒溫水浴鍋內(nèi)40 ℃振蕩5 h進行熱提，經(jīng)4 900×g離心20 min，上清液即為膠原蛋白溶液。

將獲得的膠原蛋白溶液，分別用堿性蛋白酶，復合蛋白酶和胰蛋白酶在最適溫度和pH下進行酶解，料液比1∶10，加酶量為0.5%(質量分數(shù))，結束后放沸水浴15 min 終止反應。經(jīng)冷凍干燥，得到膠原蛋白肽的凍干粉。

1.3.2 水解度的測定

原料中總氮含量M1(g)均采用半微量凱氏定氮法測定；膠原蛋白肽的氨基態(tài)氮含量M2(g)采用甲醛電位滴定法測定。水解度計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.3 鋅離子螯合率的測定

根據(jù)ZHANG等[13]的方法并作適當修改。5 mg/mL膠原蛋白肽與5 mmol/L ZnSO4溶于20 mmol/L的磷酸緩沖溶液(pH 5.0)，在37 ℃螯合反應30 min。用分子質量100 Da的截留袋透析去除未螯合的鋅離子，采用電感耦合等離子體質譜檢測螯合鋅含量。

1.3.4 分子質量分布的測定

使用凝膠色譜法在TSKgel G2000 SWXL色譜柱(300 mm×7.8 mm，5 μm)對堿性蛋白酶酶解6 h下的膠原蛋白肽進行分子質量分布的測定。將樣品配制成2 mg/mL，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾，裝入棕色液相小瓶并裝載到液相，液相條件：流動相A：含有0.1%(體積分數(shù))三氟乙酸的超純水；流動相B：含有0.1%(體積分數(shù))三氟乙酸的乙腈；等度洗脫：20% B；流速：0.5 mL/min；紫外檢測波長：214 nm。選取5種標準品：谷胱甘肽還原(307.3 Da)，L-谷胱甘肽氧化(612.63 Da)，桿菌肽(1 422.69 Da)，抑肽酶(6 511.44 Da)和細胞色素C(12 400 Da)，以保留時間為X軸，lg(MW)為Y軸，得到標準曲線y=-0.221x+6.879 4 (R2=0.995 6)。

1.3.5 螯合物的制備

將膠原蛋白肽與ZnSO4溶于20 mmol/L的磷酸緩沖溶液(pH 5.0)，在37 ℃螯合反應30 min。用分子質量100 Da的截留袋透析去除未螯合的鋅離子，將截留溶液冷凍干燥，得到螯合物白色粉末，備用。

1.3.6 螯合物的結構表征

1.3.6.1 紫外光譜

將膠原蛋白肽溶解于去離子水(0.1 mg/mL)，然后加入不同濃度的ZnSO4溶液(0、50、100、200 mmol/L)進行螯合。以去離子水完成空白校準，紫外分光光度計的檢測掃描波長范圍為190～260 nm。

1.3.6.2 傅里葉變換紅外光譜

將1 mg的肽和螯合物凍干粉分別與100 mg 干燥的KBr在瑪瑙研缽中混合均勻，充分研磨至顆粒達到約2 μm，將混合物均勻放置在固體壓膜模具，在8 T/cm2左右壓力下保持1～2 min，得到透明的錠片。取出錠片，進行IRAffinity-1型傅里葉變換紅外光譜檢測，通過軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6.3 掃描電鏡

將肽和螯合物凍干粉配制成溶液，均勻涂在樣品架的玻璃片上并進行噴金處理，通過掃描電鏡對肽和螯合物進行表面形態(tài)分析。

1.3.6.4 原子力顯微鏡

將肽和螯合物凍干粉用超純水配制成0.5 mg/mL，在室溫下用氮氣將樣品鋪展在云母片表面上。采用輕敲模式，利用原子力顯微鏡分析肽和螯合物的表面形態(tài)。

1.3.7 模擬體外胃腸道消化

根據(jù)WANG等[14]方法略做修改。用0.1 mol/L HCl(pH 2.0)將肽-鋅螯合物和ZnSO4配制質量濃度為5 mg/mL，加入胃蛋白酶(酶與底物的質量比為1∶50)模擬胃部環(huán)境，將混合物于37 ℃水浴振蕩2 h。模擬胃消化后，添加1 mol/L NaOH溶液將pH調至7.5使胃蛋白酶失活。隨后，向溶液中加入胰蛋白酶(酶與底物的質量比為1∶25)模擬腸道環(huán)境，并在37 ℃水浴振蕩2 h。模擬胃腸道消化結束，消化液在沸水浴加熱15 min以終止酶解。

肽-鋅螯合物的穩(wěn)定性評估：使用液相色譜法在Althena C18-WP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，CNW Technologies)上對胃部消化、腸液消化后的消化液進行檢測，評估肽-鋅螯合物的穩(wěn)定性。將消化液在12 000 r/min離心10 min，然后取上清液經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾，裝入棕色液相小瓶并裝載到液相。液相條件設置如下：流動相A：含有0.1%(體積分數(shù))三氟乙酸的超純水；流動相B：含有0.1%(體積分數(shù))三氟乙酸的乙腈；洗脫梯度：90%～50% B，0～10 min;50%～10% B，10～18 min;10%～90% B，18～20 min；流速：0.5 mL/min；紫外檢測波長：214 nm。

溶解率測定：分別取胃部消化、腸液消化后的消化液測定肽-鋅螯合物和ZnSO4的溶解率。將溶液在12 000 r/min離心10 min。利用ICP-MS分別測定上清液中鋅離子和溶液中總鋅濃度。鋅離子溶解率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：ρ1為上清液中鋅離子的質量濃度，μg/L；ρ2為等體積溶液中鋅離子的質量濃度，μg/L。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)通過Excel軟件整理，Origin 2018軟件作圖，SPSS 19.0軟件Duncan′s Multiple-Range Test方法進行多重比較分析，P<0.05為統(tǒng)計學上顯著差異。

2 結果與分析

2.1 膠原蛋白肽的水解度

由圖1可知，隨著時間推移，酶解反應進行得越充分，水解程度越高。在0～4 h，水解度呈現(xiàn)快速上升趨勢，可能與此時酶活力較高和酶切位點較多有關。4 h之后，隨著底物濃度的限制和酶切位點減少，水解度變化趨于平緩。堿性蛋白酶酶解的膠原蛋白肽水解度在7 h達到最高24.95%，同樣，復合蛋白酶酶解的膠原蛋白肽水解度在8 h達到最高21.54%。相比而言，胰蛋白酶酶解的膠原蛋白肽水解度較低。研究表明[8]，相比于高分子質量肽，低分子質量肽往往具有更好的生物活性。堿性蛋白酶由地衣芽孢桿菌發(fā)酵制備，作為一種絲氨酸型的內(nèi)切蛋白酶，對蛋白水解效果顯著[15]。復合蛋白酶由米曲霉菌株發(fā)酵生成，同時具有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶2種酶的活性，水解蛋白效果顯著[16]。每種蛋白酶具有不同的酶切特異性，對肽鍵的破壞程度不同，導致水解度的差異[17]。綜上所述，堿性蛋白酶對膠原蛋白的水解程度較高，一定程度表明堿性蛋白酶更有助于產(chǎn)生更多的生物活性肽。

2.2 膠原蛋白肽的鋅離子螯合率

由圖2可知，膠原蛋白肽的鋅離子螯合活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但是三者之間存在顯著性差異，其中經(jīng)堿性蛋白酶酶解制備的膠原蛋白肽-鋅離子螯合率最佳，顯著高于復合蛋白酶和胰蛋白酶(P<0.05)。經(jīng)堿性蛋白酶酶解6 h制備的膠原蛋白肽螯合率最高，達到0.075 μmol/mg。堿性蛋白酶由多種不同的蛋白酶組成，能產(chǎn)生更多的活性位點[18]；經(jīng)復合蛋白酶酶解2 h獲得的膠原蛋白肽螯合率最佳，達到0.040 μmol/mg；而經(jīng)胰蛋白酶酶解4 h 獲得的膠原蛋白肽螯合率最佳，達到0.020 μmol/mg。HOU等[19]發(fā)現(xiàn)太平洋鱈魚骨肽鈣離子螯合率最高達到0.040 μmol/mg。綜合水解度指標和鋅離子螯合率的檢測結果，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解6 h獲得的膠原蛋白肽具有最佳鋅離子螯合活性，且酶解程度充分，故將該樣品作為后續(xù)螯合物的原料。

2.3 膠原蛋白肽的分子質量分布

根據(jù)前人的報道，分子質量與鋅離子螯合率的關系是不確定的。WANG等[8]報道稱從芝麻酶解物分離出的低分子質量肽(<500 Da)鋅離子螯合活性優(yōu)于高分子質量肽(>500 Da)。另外，CHEN等[20]研究發(fā)現(xiàn)從牡蠣酶解物獲得的高分子質量肽更易與鋅離子發(fā)生螯合反應。因此，本研究對堿性蛋白酶不同酶解時間制備的膠原蛋白肽分子質量分布進行測定，并與鋅離子螯合率進行線性擬合。由圖3可知，隨著酶解過程的進行，膠原蛋白肽的高分子質量組分向低分子質量的轉化。酶解前期(0～120 min)分子質量分布變化明顯，酶解后期(360～480 min)時，其分子質量分布情況基本保持不變。該發(fā)現(xiàn)與前面水解度的結果保持一致，酶解前期水解度大，會發(fā)生更多向低分子質量肽的轉化。由圖4可知，膠原蛋白肽200～500 Da的組分在逐步上升，從25.22%增長到48.69%，而1 000～3 000 Da的組分在明顯下降，從33.10%下降到10.14%。由圖5可知，線性擬合分析發(fā)現(xiàn)200～1 000 Da的組分與鋅離子螯合率呈正相關性(r=0.96，P<0.05)。綜上，這些結果表明羅非魚皮膠原蛋白肽的分子質量對鋅離子螯合活性有顯著影響，且低分子質量肽更易與鋅離子發(fā)生螯合反應。

2.4 肽-鋅螯合物的結構表征

2.4.1 紫外掃描分析

2.4.2 傅里葉變換紅外光譜分析

2.4.3 電鏡分析

由圖8可知，膠原蛋白肽和肽-鋅螯合物電鏡圖有明顯區(qū)別，膠原蛋白肽的表面光滑，呈現(xiàn)片狀結構。與鋅離子螯合之后，膠原蛋白肽和鋅形成橋連，螯合物呈現(xiàn)粗糙的球狀顆粒聚集體形態(tài)。螯合物表面附著白色晶體，這應該是吸附在膠原蛋白肽上的鋅晶體。該發(fā)現(xiàn)與原洪等[24]，劉閃等[25]發(fā)現(xiàn)螯合物表面附著白色晶體的結論一致。掃描電鏡結果從微觀表面形態(tài)的角度同樣證明螯合物的產(chǎn)生。

2.4.4 原子力顯微鏡分析

由圖9可知，膠原蛋白肽與肽-鋅螯合物的分子表面形態(tài)和納米分辨率級別的粗糙度。膠原蛋白肽平均粗糙度9.67 nm，而肽-鋅螯合物平均粗糙度 3.12 nm。膠原蛋白肽的表面圖像顯示相對均勻的納米級顆粒(圖9-a)，其中單個分散體3D圖像(圖9-b)更加直觀的顯示該特性。與鋅離子螯合之后，螯合物顯示不同形狀的簇，其3D圖像也可以明顯看出，可能由多肽與鋅離子螯合導致。螯合物呈現(xiàn)不同聚集體的發(fā)現(xiàn)與電鏡結果一致。該結果與CUI等[26]發(fā)現(xiàn)海參卵肽結合鈣離子之后表面形態(tài)發(fā)生變化的結果類似。這與上述實驗得到的結果達成一致。

2.5 肽-鋅螯合物生物利用率分析

由圖10可知，肽-鋅螯合物經(jīng)過胃腸道消化后，液相色譜圖出峰時間均在4～8 min，沒有發(fā)生明顯變化。該結果表明，肽-鋅螯合物保持了一定的穩(wěn)定性。觀察胃部消化，腸道消化后，肽-鋅螯合物吸收峰形變化，胃部消化后峰形相對穩(wěn)定，最大吸收峰吸光值略微降低，而腸道消化后，峰形變化更加明顯，且最大吸收峰吸光值下降更多。根據(jù)該結果，推測肽-鋅螯合物在胃部消化后能夠保持良好的穩(wěn)定性，而在腸道消化后會發(fā)生部分分解。該結果表明螯合物的螯合結構幾乎不受胃蛋白酶的影響，而胰蛋白酶對結構具有部分破壞作用。類似的結果發(fā)生在芝麻肽-鋅螯合物能夠抵抗胃部分解，但在腸道會發(fā)生部分分解[27]。

由圖11可知，肽-鋅螯合物經(jīng)過胃部消化和腸道消化后的溶解率分別為96.10%，68.03%，而ZnSO4經(jīng)過胃腸道消化為88.31%，39.93%，結果表明在整個胃腸道消化階段螯合物的鋅離子溶解率均顯著高于無機鋅(P<0.05)。螯合物在胃部表現(xiàn)出良好的鋅離子溶解率，主要原因是螯合結構沒有發(fā)生破壞(圖10)，鋅離子與多肽作為一個整體存在。螯合物在腸道的溶解率明顯下降，可能是螯合結構在腸道階段發(fā)生部分分解(圖10)，被分解鋅離子在腸道的堿性環(huán)境下易形成沉淀[28]。綜上，相比于無機鹽，螯合物在胃腸道消化階段能夠一定程度保持其完整的螯合結構，避免了無機鋅在胃腸道易于形成沉淀的問題，有效地提高了鋅離子的生物利用率。

3 結論

本文對膠原蛋白肽的分子質量分布與鋅離子螯合活性的關系進行探究，并對螯合前后的結構進行表征，隨后通過模擬胃腸道模型探究螯合物的生物利用率。結果表明，低分子質量的膠原蛋白肽更易與鋅離子發(fā)生螯合作用；鋅離子螯合后，膠原蛋白肽的表面形態(tài)發(fā)生變化，其螯合位點為酰胺鍵，氨基的氮原子和羧基的氧原子；相比于無機鹽，螯合物在胃腸道消化階段能夠一定程度保持其完整的螯合結構，避免了無機鋅在胃腸道易于形成沉淀的問題，有效地提高了鋅離子的生物利用率。