張金偉，王小艷，張 穎，劉 輝，何太波，趙國淼，王澤興，李 凡

（1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安 716000；2.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；3.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江哈爾濱 133010；4.河北環(huán)境工程學(xué)院，河北秦皇島 066102）

液體燃料乙醇指以生物質(zhì)為原料通過生物發(fā)酵等途徑獲得的可作為燃料用的乙醇，是近年來極為環(huán)保的可再生能源之一。隨著我國“十四五”規(guī)劃的提出，實(shí)現(xiàn)碳達(dá)峰、碳中和等目標(biāo)也提上日程，液體燃料乙醇的開發(fā)和利用得到了更多的重視與研究[1-3]。釀酒酵母作為生產(chǎn)燃料乙醇最主要的發(fā)酵微生物，已形成了成熟的工業(yè)發(fā)酵技術(shù)體系，但在實(shí)際發(fā)酵過程中，乙醇產(chǎn)量和糖利用率很難達(dá)到理論水平，究其原因是由于工業(yè)發(fā)酵中的多重脅迫因素造成了酵母細(xì)胞的受損和生產(chǎn)性能下降，如發(fā)酵過程中溫度升高造成的熱脅迫，發(fā)酵底物造成的高糖滲透壓，乙醇積累產(chǎn)生的細(xì)胞毒性等[4-5]。其中為控制發(fā)酵溫度需要使用大量的冷卻水，尤其在亞熱帶地區(qū)，過高的環(huán)境溫度會極大地增加冷卻水用量，增加發(fā)酵成本；此外不同的發(fā)酵原料帶來的滲透壓也有很大差異；實(shí)際工業(yè)發(fā)酵中，在保證乙醇產(chǎn)量不受影響的基礎(chǔ)上，發(fā)酵溫度每增加1 ℃都能節(jié)省大量的冷卻水使用，因此對逆境耐受能力強(qiáng)的菌株能很大程度上降低發(fā)酵成本，產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

基因組的突變產(chǎn)生豐富的表型以適應(yīng)環(huán)境的變化，這使得基因組具有極強(qiáng)的可塑性，為菌株的選育提供了基礎(chǔ)[6-9]。釀酒酵母的菌株改造有很多方法，基于理性的基因組改造策略，如Luo 等[10]開發(fā)了一種能進(jìn)行酵母染色體大量重排，誘導(dǎo)產(chǎn)生大的基因型多樣性菌株的系統(tǒng)—ReSCuES，利用LoxP 序列的特異性重組結(jié)合營養(yǎng)缺陷型篩選得到環(huán)境脅迫條件下的耐受菌株。Mitsui 等[11]利用CRISPR/Cas9 編輯系統(tǒng)對轉(zhuǎn)座子進(jìn)行隨機(jī)突變，成功地得到可以在39 ℃、低pH 值和高乙醇濃度下良好生長的耐熱突變菌株T8-292。此外非理性策略如典型的實(shí)驗(yàn)室的適應(yīng)性進(jìn)化，通過緩慢改變外界環(huán)境模擬自然選擇過程使得菌種自發(fā)突變朝著更適合生長的方向進(jìn)行[12-13]。通過適應(yīng)性進(jìn)化的方法，Pereira 等[13]得到對3 種二元酸（戊二酸，己二酸和海松酸）有較強(qiáng)耐受性的釀酒酵母，F(xiàn)letcher 等[14]提高了對有機(jī)酸和無機(jī)酸的耐受性。菌種的適應(yīng)性進(jìn)化被視為逆代謝工程的一種方法，通過積累有效的生物表型后再分析相應(yīng)的分子基礎(chǔ)也是工業(yè)微生物改造上的常見理念[2]。為了在短時間內(nèi)通過實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化獲得耐受菌株，本實(shí)驗(yàn)通過基因組改造縮短了菌株實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化所需時間，篩選獲得了耐受能力較強(qiáng)的菌株，并對其發(fā)酵性能進(jìn)行了評估。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

菌株：釀酒酵母為安琪公司的安琪超酒酵母，其最適生長溫度為32 ℃。

主要試劑：酵母粉，Oxoid 公司；蛋白胨，Oxoid公司；氯化鈉，北京化工廠；瓊脂，Amresco 公司；瓊脂糖，西班牙（上海分裝）；冰醋酸，北京化工廠；山梨醇，Amresco公司；Tris，Sigma公司。

YPD固體培養(yǎng)基：用于釀酒酵母和畢赤酵母的活化、培養(yǎng)及菌種保存，含有1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖，15 %瓊脂，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 基因組的改造

1.2.1 酵母的電擊轉(zhuǎn)化

取2 μg 左右基因片段或質(zhì)粒輕輕加入一管感受態(tài)細(xì)胞中，注意加入體系不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10。將加入轉(zhuǎn)化片段或質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入2 mm 預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯中，以1.5 kV，200 W，25 μF的條件電擊5 ms。立即加入1 mL 無抗YPD 培養(yǎng)基，以30 ℃、170 r/min 搖床復(fù)蘇1 h。取復(fù)蘇后菌體以5000 r/min 離心5 min，棄去上清液，然后用500 μL 1 M 山梨醇重懸菌體，取1/10 涂布于YPD選擇平板上，剩余接入含相應(yīng)抗性的5 mL YPD 液體培養(yǎng)基中。于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選。

1.2.2 基因組改造

基于重疊延伸PCR 技術(shù)[15]，采用具有互補(bǔ)末端的引物RAD52-F&RAD52-MID-R 與RAD52-MID-F&RAD52-R，擴(kuò)增獲得L-Arm 與R-Arm 后將兩條片段進(jìn)行重組，將重組后的片段轉(zhuǎn)化入釀酒酵母內(nèi)，通過同源重組敲除RAD52 基因核心區(qū)域約890 bp達(dá)到酵母基因組的改造目的。

1.3 實(shí)驗(yàn)室的適應(yīng)性進(jìn)化與篩選

圖1 RAD52基因的敲除

取原始工業(yè)菌株接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中于32 ℃下活化培養(yǎng)，不間斷取樣，測定其OD600nm處吸光值，待OD 值為10 左右，以10%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至30%葡萄糖、2%乙醇、32 ℃下培養(yǎng)，期間不間斷取樣測定OD600nm處吸光值，OD 值為10 左右后完成一輪的適應(yīng)性進(jìn)化。第二輪以2 %轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)至30 %葡萄糖、4%乙醇、34 ℃下培養(yǎng)，OD 值生長至10 左右再進(jìn)行下一輪是適應(yīng)性傳代培養(yǎng)，每一輪依次增加2%的乙醇脅迫與2 ℃的溫度，直至在30%葡萄糖、8%乙醇、40 ℃下生長至10 OD 后，取菌懸液涂布于30 %葡萄糖、8 %乙醇的YPD 固體平板于40 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。挑取較大的單菌落于32 ℃活化后接種液化醪，35 ℃搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證其發(fā)酵性能。

1.4 發(fā)酵驗(yàn)證

取工業(yè)用液化醪，對篩選出的釀酒酵母進(jìn)一步調(diào)整溫度進(jìn)行工業(yè)物料小試驗(yàn)證。工藝條件：工業(yè)用液化醪為底物，S.C D12 與對照菌株均接種于種子培養(yǎng)基（YPD 液體培養(yǎng)基）中，培養(yǎng)種子液至10 OD 左右，按0.125 億/mL 液化醪計算用量，離心、水洗1 次，用生理鹽水懸浮至2 mL，在1 L 搖瓶中加入350 g 液化醪中。發(fā)酵過程測試菌株試驗(yàn)組均進(jìn)行溫度調(diào)整（0～16 h、32 ℃，17 h、33 ℃，18 h、34 ℃，19～72 h、35 ℃），并加入對照菌株的空白試驗(yàn)組（不調(diào)整溫度，一直控溫32 ℃）進(jìn)行對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌生長曲線的測定

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的適應(yīng)性進(jìn)化前，需要選擇一個合適的轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)時間，一般來說菌株在對數(shù)生長的中后期具有較高的代謝活性并易于突變[16]。因此測定了菌株在30 %葡萄糖的YPD 中的生長曲線，如圖2 所示在高糖濃度的YPD 中，菌株最高OD600可至20 左右，OD600為10 時正處于其對數(shù)生長中后期，因此選擇OD600值在10左右時作為轉(zhuǎn)接點(diǎn)，進(jìn)行多輪的適應(yīng)性進(jìn)化。

圖2 出發(fā)菌株的生長曲線

2.2 基因組改造

基因組的改造是縮短實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化過程的基礎(chǔ)，只有底盤宿主具有較高的突變率才能在脅迫環(huán)境下更快的發(fā)生突變產(chǎn)生有義突變表型。有研究表明，釀酒酵母RAD52 基因的缺失能導(dǎo)致宿主具有較高的突變能力[17]，因此通過同源重組敲除宿主RAD52 基因后保證其具有較高的突變能力，能縮短實(shí)驗(yàn)室的適應(yīng)性進(jìn)化時間并篩選所需的多重抗逆工業(yè)酵母，RAD52 核心區(qū)域敲除后其結(jié)構(gòu)如圖3。

圖3 RAD52基因改造后圖譜

2.3 搖瓶驗(yàn)證（圖4）

對篩選獲得的5 株優(yōu)勢菌進(jìn)行液化醪搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，使用肇東工廠生產(chǎn)線上的三期液化醪搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，35 ℃搖瓶發(fā)酵66 h，搖瓶發(fā)酵結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示S.C D12 乙醇產(chǎn)量顯著高于對照菌株，葡萄糖殘留顯著優(yōu)于對照菌株。

圖4 發(fā)酵成熟醪殘葡萄糖含量和乙醇含量

2.4 不同工業(yè)物料的搖瓶驗(yàn)證

為了驗(yàn)證S.C D12 在不同地區(qū)物料和不同配比物料中的發(fā)酵穩(wěn)定性，我們選取了安徽地區(qū)工廠所用的糙米和小麥、廣西地區(qū)工廠所用水稻和小麥進(jìn)行了不同比例的混合和發(fā)酵驗(yàn)證，35 ℃搖瓶發(fā)酵66 h 后檢測葡萄糖和乙醇，其結(jié)果如圖5，可以觀察到S.C D12 在不同地區(qū)物料和不同配比的情況下依然能保持良好的發(fā)酵性能，具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。

圖5 35 ℃不同地區(qū)物料與配比條件下的發(fā)酵成熟醪殘葡萄糖和乙醇

2.5 工業(yè)物料小試驗(yàn)證

取肇東工廠生產(chǎn)線上的三期液化醪為發(fā)酵底物，對S.C D12與對照菌株進(jìn)行發(fā)酵小試驗(yàn)證。發(fā)酵分為控溫（32 ℃）和溫度調(diào)整（0～16 h、32 ℃，17 h、33 ℃，18 h、34 ℃，19～72 h、35 ℃）。對照菌株分別使用控溫和溫度調(diào)整組進(jìn)行發(fā)酵，S.C D12 使用溫度調(diào)整組發(fā)酵并與對照菌株進(jìn)行比較。發(fā)酵成熟醪酒精度如圖6 所示，在溫度調(diào)整的高溫情況下（35 ℃），工程菌株S.C D12乙醇產(chǎn)量為12.50%vol，較出發(fā)菌株提升了0.53%vol，殘總糖1.93 g/100 mL，較出發(fā)菌株降低了0.82 g/100 mL，S.C D12 在高溫下與對照菌株在正常溫度下的發(fā)酵性能相當(dāng)，具有良好的穩(wěn)定性。發(fā)酵產(chǎn)物HPLC 檢測結(jié)果見表1，菌株S.C D12 在高溫下的發(fā)酵各項指標(biāo)均達(dá)到對照菌株正?？販貤l件下的發(fā)酵性能。

表1 S.C D12菌株與對照菌株發(fā)酵HPLC數(shù)據(jù) (g/100 mL)

圖6 S.C D12菌株與對照菌株發(fā)酵結(jié)果

3 結(jié)論

與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化方法相比，對基因組進(jìn)行改造后的菌株能極大的縮短實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化所需的時間，在數(shù)周內(nèi)即可獲得優(yōu)良的工業(yè)釀酒酵母。本研究中就基于此方法篩選獲得了1 株能高產(chǎn)乙醇的抗逆菌株S.C D12，工業(yè)物料小試發(fā)現(xiàn)，35 ℃高溫下仍然能保持良好的乙醇產(chǎn)量和較低的殘?zhí)?，且發(fā)酵性能與對照菌株在32 ℃下基本一致，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，能極大的節(jié)約工業(yè)上冷卻水的使用，降低發(fā)酵成本。