向麗萍，范斌強(qiáng)，黃 嬌，楊志龍，伍 強(qiáng)，余有貴

（1.邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南邵陽 422000；2.生態(tài)釀酒技術(shù)與應(yīng)用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南邵陽 422000；3.湖南湘窖酒業(yè)有限公司，湖南邵陽 422000）

隨著科學(xué)的進(jìn)步，釀酒技術(shù)也越來越先進(jìn)，應(yīng)用高品質(zhì)強(qiáng)化酒曲和改進(jìn)釀酒工藝，在保證酒的品質(zhì)的條件下，盡可能降低成本，提高原料淀粉利用率，增加出酒率[1-3]。國內(nèi)學(xué)者也對(duì)不同樣品中的酵母菌進(jìn)行分類，采用菌落觀察、形態(tài)學(xué)觀察、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)、API 50 CHL 和API 20 C AUX 生化試劑盒鑒定、16S rDNA 和26S rDNA 序列的分子生物學(xué)鑒定、26S rDNA D1/D2基因擴(kuò)增和測(cè)序分析等方法，成功鑒定到所測(cè)樣品中不同的酵母菌[4-8]。崔夢(mèng)君[9]從米酒曲中分離酵母菌，經(jīng)鑒定為扣囊復(fù)膜酵母和釀酒酵母，用于紅棗酒的制備。馬佳佳[10]從鳳窩酒曲中分離到的45 株酵母菌，被鑒定為8 個(gè)種。武偉偉[11]對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期的樹莓酒進(jìn)行酵母菌的分離純化，選擇代表菌株進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，共分離出323 株酵母菌，形態(tài)學(xué)初步鑒定為12類?；舴f玙[12]以畢赤酵母、地衣芽孢桿菌作為主要菌種制備強(qiáng)化大曲并進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，畢赤酵母不會(huì)影響地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)及代謝。杜剛[13]對(duì)6種市售酒曲樣品中分離出的酵母菌進(jìn)行26S rDNA 序列分析，將鑒定出的酵母菌進(jìn)行獼猴桃汁發(fā)酵，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液含25 種揮發(fā)性成分。王珍[14]以鳳型大曲為菌種來源，分離篩選耐高溫高產(chǎn)酒精酵母，比較分析混合菌種模擬固態(tài)發(fā)酵，用于大曲實(shí)際生產(chǎn)制備，提升了出房曲糖化力、液化力、發(fā)酵力、酯化力。周森[15]以菌劑模式添加兩種生香酵母到二鍋頭釀造過程中，發(fā)酵前期酒醅中生香酵母較活躍，提高了實(shí)驗(yàn)基酒中總酸、總酯和乙酸乙酯含量。劉延波[16]從中高溫大曲中篩得一株酵母菌，耐45 ℃高溫，通過26S rDNA 序列分析確定菌株為庫德里阿茲威畢赤酵母，其最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，12 %乙醇耐受性，產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)。從酒曲中通過篩選比較各種酵母菌的發(fā)酵力，選擇高發(fā)酵力的酵母菌，再利用純酵母菌制備強(qiáng)化酒曲，改善大曲的催化效率，提高出酒率，對(duì)釀酒企業(yè)創(chuàng)收具有重要意義。本研究以湘窖大曲為研究對(duì)象，通過平板劃線的方式分離純化出酵母菌，再通過YPD 培養(yǎng)基、WL 培養(yǎng)基、生物顯微鏡、VITEK MS鑒定等方式對(duì)酵母菌進(jìn)行分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 曲樣、試劑

湘窖大曲：取自湖南省湘窖酒業(yè)有限公司制曲車間成品大曲。

試劑及耗材：蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、瓊脂等培養(yǎng)基配制試劑購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯霉素（≥720 u/mg），購自海三杰生物技術(shù)有限公司；美蘭染液，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；香柏油，購自上海生物制片廠。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，瓊脂7.5 g，水500 mL，121 ℃滅菌20 min。

WL 培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5 %，葡萄糖5%，瓊脂2%，磷酸二氫鉀0.055%，氯化鉀0.0425%，氯化鈣0.0125%，氯化鐵0.00025%，硫酸鎂0.0125%，硫酸錳0.00025%，溴甲酚綠0.0022%，水100 mL，調(diào)pH值到6.5，121 ℃滅菌20 min。

SDA培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，蛋白胨5 g，瓊脂7.5 g，水500 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器設(shè)備

G154-DWS 型高壓蒸汽滅菌鍋，購自致微（廈門）儀器有限公司；BM1000 型顯微鏡，購自南京江南永新光學(xué)有限公司；101-2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，購自天津泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-1FD 型單人單面垂直凈化工作臺(tái)，購自蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；H21-6 型電熱恒溫水浴鍋，購自北京市東霞電子儀表廠；FW-400A 型萬能粉碎機(jī)，購自北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SCIENTZ-18N 型恒溫培養(yǎng)箱，購自北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 湘窖大曲酵母菌的初步分離

取4 個(gè)月的成品曲，將包包曲粉碎后裝于試劑瓶中并貼上標(biāo)簽。準(zhǔn)確稱取25.0 g 樣品于裝有225 mL 無菌水的錐形瓶?jī)?nèi)，充分搖勻，同時(shí)制備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋樣品液。

取100 μL 制備好的稀釋度為10-1的樣品稀釋液接種至YPD 培養(yǎng)基上，涂布均勻，貼好標(biāo)簽。重復(fù)此操作，分別將稀釋度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的樣品稀釋液接種到平板上，涂布均勻，同一梯度做3個(gè)平行，貼好標(biāo)簽。同時(shí)取100 μL無菌水接種至平板上，涂布均勻作為空白對(duì)照。將接種后的平板于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 d。

（2）坡口開制 600MPa和800MPa級(jí)別優(yōu)先采用坡口機(jī)、銑邊機(jī)加工，當(dāng)采用熱切割方法須將割口表面淬硬層、過熱組織等用砂輪磨掉，磨削層厚≥1mm。

1.2.2 酵母菌的分離純化

觀察平板菌落生長(zhǎng)情況，挑取20 株典型單一菌落，分別命名為H1-20，將它們劃線于YPD 固體培養(yǎng)基，按H1至H20依次貼好標(biāo)簽，于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2～5 d。將純種酵母菌接種至YPD 固體斜面培養(yǎng)基上，貼好標(biāo)簽，于28 ℃條件下培養(yǎng)2 d，待菌落生成后，保藏備用。

1.2.3 酵母菌的分類鑒定

（1）YPD培養(yǎng)基中菌落形態(tài)觀察。從斜面中挑取菌種并接種在新的YPD 培養(yǎng)基上，按照對(duì)應(yīng)斜面的編號(hào)依次為平板編號(hào)并貼好標(biāo)簽，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d。觀察菌落形態(tài)并拍照記錄。

（2）WL 培養(yǎng)基中菌落形態(tài)觀察。從斜面中挑取菌種并接種在WL 培養(yǎng)基上，按照對(duì)應(yīng)斜面的編號(hào)依次為平板編號(hào)并貼好標(biāo)簽，28 ℃倒置培養(yǎng)2～5 d。觀察菌落形態(tài)并拍照記錄。

（3）顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察。點(diǎn)燃酒精燈，在載玻片中心滴一滴無菌水，然后用接種環(huán)挑取少量菌體在無菌水中涂布均勻，固定菌體，用美蘭染色幾分鐘，然后用無菌水沖洗干凈，干燥后蓋上干凈的蓋玻片。在顯微鏡下從低倍鏡到高倍鏡依次觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲中酵母菌的分離與純化

分別取100 μL 10-1～10-6這6 個(gè)梯度的大曲稀釋液接種在YPD 培養(yǎng)基上，其生長(zhǎng)情況如圖1 所示。10-1～10-6這6 個(gè)梯度中，只有前4 個(gè)平板有微生物生長(zhǎng)，其中包括霉菌、細(xì)菌和酵母菌。根據(jù)酵母菌形態(tài)描述，挑選20 株典型的單一酵母菌菌落進(jìn)行分離純化。

圖1 各梯度樣品稀釋液中的酵母菌在YPD培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

對(duì)上面挑選出來的20 株酵母菌進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，經(jīng)3 次平板劃線，分離純化獲得的酵母菌菌落形態(tài)如圖2所示。

圖2 酵母菌的分離純化

由圖2 可知，經(jīng)過3 次分離純化后的酵母菌已無其他雜菌污染。將此次純化得到的酵母菌接種于YPD斜面固體培養(yǎng)基上保藏以供之后鑒定用。

2.2 酵母菌的分類鑒定

2.2.1 酵母菌在YPD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)觀察

觀察H1—H20這20株酵母菌在YPD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，可以將這些菌株大致分為3 類，分別命名為JM1、JM2、JM3，在YPD 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況如圖3所示。

圖3 3種類型酵母菌在YPD培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

由圖3 可知，3 類酵母在YPD 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況主要可以從顏色和菌落形態(tài)區(qū)分開來。從顏色上看大多數(shù)菌株表現(xiàn)為乳白色，表面附有一層透明狀物質(zhì)，還有的表現(xiàn)為白色，極少數(shù)為雪白色；從形態(tài)上來看大多數(shù)為球形凸起，表面光滑濕潤(rùn)，有的菌落為球形凸起但菌落較小為點(diǎn)狀，有的菌落平坦、黏稠菌落較大。20 株菌落在YPD 培養(yǎng)基上的具體生長(zhǎng)情況見表1。

表1 20株酵母菌在YPD培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況記錄

2.2.2 酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)觀察

觀察H1—H20 這20 株酵母菌在WL 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，也可以將這些菌株大致分為3 類，而且其編號(hào)可與上述利用YPD 培養(yǎng)基分出的3 類相對(duì)應(yīng)。在WL培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況如圖4所示。

圖4 3種類型酵母菌在WL培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

由圖4 可知，酒曲中酵母菌菌落在WL 培養(yǎng)基中顏色變化稍有顯現(xiàn)，大部分菌株在WL 培養(yǎng)基上表現(xiàn)出與其在YPD 培養(yǎng)基上不一樣的顏色。有的表現(xiàn)出草綠色，表面附有一層白色，有的表現(xiàn)出深綠色，有的表現(xiàn)出白色，其在WL 培養(yǎng)基上的具體生長(zhǎng)情況記錄見表2。

表2 20株酵母菌在WL培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況記錄

2.2.3 大曲酵母菌的細(xì)胞形態(tài)觀察

分別在以上3 種類型中挑選1 株在顯微鏡下做鏡檢(油鏡10×100)，在100 倍油鏡下觀察到的結(jié)果如圖5所示。

圖5 生物顯微鏡鏡檢結(jié)果

2.2.4 VITEK質(zhì)譜鑒定

從以上3種類型的酵母菌中分別選1株在SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，酵母菌在SDA 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況如圖6所示。

圖6 3種類型酵母菌在SDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

由圖6 可知，3 種類型的酵母菌在SDA 培養(yǎng)基上的菌落顏色均為白色，JM1 類型的菌落形態(tài)光滑，邊緣平整，菌落較大。JM2 類型的菌落形態(tài)為圓形凸起，JM3 類型的菌落形態(tài)較平坦，邊緣不規(guī)則。這三類的VITEK 質(zhì)譜儀的檢測(cè)結(jié)果分別如圖7所示。

圖7 VITEK質(zhì)譜儀檢測(cè)圖譜

通過對(duì)比菌種庫的蛋白質(zhì)量指紋圖，得出JM1類型的酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，JM2 型的酵母為菌膜假絲酵母(Candida pelliculosa)，JM3 型的酵母為粉狀米勒酵母(Millerozyma farinose)。

3 結(jié)論

結(jié)合菌株在YPD 培養(yǎng)基和WL 培養(yǎng)基上的形態(tài)特征、鏡檢結(jié)果以及VITEK MS 檢測(cè)結(jié)果，可以對(duì)湘窖酒業(yè)大曲中的酵母菌做出初步分類并分為三大類。JM1 類是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，菌落呈乳白色，表面附著一層透明狀物質(zhì)，表面濕潤(rùn)光滑，圓形凸起，邊緣規(guī)則，屬于這一類的有10 株，分別為H2、H4、H5、H10、H11、H12、H13、H15、H16、H17；JM2 類是菌膜假絲酵母(Candida pelliculosa)，菌落呈白色，球形凸起，菌落較小，邊緣規(guī)則，屬于這一類的有5 株，分別為H1、H3、H6、H7、H8；JM3 類是粉狀米勒酵母(Millerozyma farinose)，菌落呈雪白色，菌落大而平坦，表面黏稠，邊緣不規(guī)則，屬于這一類的有5 株，分別為H9、H14、H18、H19、H20。從湘窖酒業(yè)成品曲中分離純化出的酵母菌，為強(qiáng)化酒曲的研發(fā)提供菌種資源。