張 霞，雷學(xué)俊，楊康卓，羅青春，廖勤儉，劉多濤，喬宗偉，2，鄭 佳，2

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644007）

酵母菌是白酒釀造微生物區(qū)系中非常重要的組成部分，它可以分解釀造原料產(chǎn)生酯類、醇類、酮類、酸類、酚類、烯類、吡嗪類等風(fēng)味物質(zhì)[1]，對產(chǎn)酒率和酒質(zhì)至關(guān)重要。

酵母菌發(fā)酵代謝可產(chǎn)生一種叫丁二酸的物質(zhì)，又叫琥珀酸，是一種二元羧酸，能發(fā)生二元酸的大多數(shù)典型反應(yīng)，如鹵化、酯化、碘化等，也是合成各種復(fù)雜有機(jī)物的中間體。丁二酸作為三羧酸循環(huán)過程中的一種四碳化合物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)等行業(yè)[2-3]，可用于合成氨基酸、鎮(zhèn)靜劑、維生素、1,4-丁二醇、N-甲基吡咯烷酮以及酸化劑、風(fēng)味調(diào)節(jié)劑等[4-6]，琥珀酸（包括鹽類）可產(chǎn)生酸味和呈味物質(zhì)，可用于豆醬、醬油、日本酒、調(diào)味料[6]等。丁二酸進(jìn)行酯化形成的丁二酸酯類是一種生物活性成分，可以提高白酒的健康價值，而且丁二酸酯類具有愉快的氣味，對酒類的香味呈現(xiàn)有著一定的貢獻(xiàn)[7-10]。丁二酸還可以作為中間體合成γ-丁內(nèi)酯、1,4-丁二胺、四氫呋喃等化合物[11]，這些化合物對白酒的風(fēng)味形成有重要作用。

盧春芳等[12]在6株酵母菌中篩選出高活性酵母菌，其中熱帶假絲酵母產(chǎn)丁二酸的能力最強(qiáng)，培養(yǎng)液中丁二酸含量為119.70 μg/mL；高翠娟等[13]通過基因敲除的方法獲得可積累琥珀酸的解脂酵母重組菌，以提高琥珀酸的產(chǎn)量；申乃坤等[14]以牛胃內(nèi)容物為菌源,利用富馬酸鈉為唯一碳源并加入高濃度丁二酸鈉的選擇培養(yǎng)基篩選到1 株丁二酸產(chǎn)量較高，副產(chǎn)物較少的菌株，經(jīng)鑒定為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌。

本研究從不同培養(yǎng)基之間產(chǎn)丁二酸能力高低出發(fā)，通過5 株不同屬的酵母菌在不同培養(yǎng)基之間發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的對比，發(fā)現(xiàn)這5 株不同屬的酵母菌在五糧粉液中產(chǎn)丁二酸能力最強(qiáng)，而五糧粉則是五糧液釀造的糧食原材料，這對研究五糧液白酒風(fēng)味多樣性的形成有一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

所有酵母菌株均由本實驗室保藏，分離自五糧液釀造環(huán)境中。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離篩選培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、YEPD瓊脂培養(yǎng)基均為商業(yè)用合成培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基、YPD 液體培養(yǎng)基均為商業(yè)用合成培養(yǎng)基。

五糧粉[15]糖化液：五糧粉糖化液由高粱、小麥、大米、糯米和玉米5 種糧食按一定比例打碎混合組成，五糧粉∶水以1∶10 比例煮沸糊化，冷卻后加入糖化酶、液化酶，最后過濾調(diào)糖度終濃度至12～13°Bx。

以上培養(yǎng)基均121 ℃下0.1 MPa滅菌20 min。

1.2 主要試劑和儀器

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、YEPD 瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、YPD 液體培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；葡萄糖(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；API20ACUX 鑒定試劑盒，生物梅里埃公司；FKC-1型浮游菌采樣器，浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；離心機(jī)，Eppendorf 公司；顯微鏡，Olympus 公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技儀器有限公司；美國Agilent 公司1290 系列高效液相色譜儀(HPLC)-6520B 系列質(zhì)譜檢測器（QTOF），Agilent MassHunter 數(shù)據(jù)采集工作軟件、定性定量分析軟件，Milli-Q 超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離

在五糧液釀酒車間和制曲車間外圍環(huán)境采集樣品，采用FKC-1 型浮游菌采樣器，距離地面80 cm，將直徑為9 cm 的麥芽汁瓊脂平板置于采樣器內(nèi)，每次采樣設(shè)置3 個平行，空氣流量為100 L/min，采樣時間為1 min。然后將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待菌落長出后，挑選菌落形態(tài)不同的疑似酵母單菌落于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中，編號并劃線純化，重復(fù)純化2～3 次，直至平板上的菌落都為同一形態(tài)，利用傳代培養(yǎng)法，在4 ℃下進(jìn)行斜面保存并編號。

1.3.2 菌株的鑒定

1.3.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》進(jìn)行[16]。

菌落形態(tài)觀察：將純化后的菌株接種于YEPD平板，置28 ℃下培養(yǎng)2～3 d，單菌落觀察，并記錄菌落的大小、顏色、形狀、質(zhì)地、透明度、邊緣、濕潤程度等菌落特征。

顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：挑取單菌落于5 mL YPD 液體培養(yǎng)基中28 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征。

1.3.2.2 菌株生理生化鑒定

按照API 20A CUX 鑒定試劑盒所述方法測定菌株的生理生化特征。假菌絲觀察：將酵母接種于玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察酵母是否含有假菌絲。

1.3.2.3 菌株分子鑒定

基因組DNA的提取：將活化的菌株接入40 mL麥芽汁培養(yǎng)基中，160 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h 后，室溫、12000 r/min 離心5 min 獲得菌體，用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取菌株的基因組DNA，置于-20 ℃下備用。

PCR 擴(kuò)增：采用酵母菌通用引物為NL1（5-GCATATCAA TAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'），PCR 反 應(yīng)體系包括0.5 μL 的基因組DNA、2.5 μL 的10×Buffer（含Mg2+）、1 μL的dNTP、0.2 μL的聚合酶、0.5 μL的引物、0.5 μL 模板，加雙蒸水至25 mL；PCR 循環(huán)條件為94 ℃4 min 預(yù)變性、94 ℃45 s 變性、55 ℃45 s退火、72 ℃1 min延伸、循環(huán)30次，72 ℃10 min修復(fù)延伸，4 ℃終止反應(yīng)。經(jīng)PCR 反應(yīng)擴(kuò)增出26S rDNA 產(chǎn)物，用PCR 及酶反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物交由上海生工生物工程股份有限公司完成測序工作。

1.3.3 酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

參考文獻(xiàn)[17]，將測得的26S rDNA D1/D2 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，選取相似度較高的模式菌株的26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列作為參比對象；利用MEGA5.0 軟件進(jìn)行多序列比對、Kimura-2 模型計算進(jìn)化距離、最后采用鄰位相連(Neighbor-Joining)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，其中進(jìn)化樹拓?fù)浞治鰹?000次重復(fù)取樣的結(jié)果。

1.3.4 丁二酸的測定

取終濃度酵母菌活菌數(shù)105～106個/mL菌液接種于3 種發(fā)酵培養(yǎng)基中，以未接菌的培養(yǎng)基作為對照。28 ℃靜置培養(yǎng)48 h 后，將發(fā)酵液12000 r/min離心5 min，取上清液0.22 μm 濾膜過濾，用HPLC法測定發(fā)酵液中丁二酸的含量。色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1*100 mm 1.8-micron)；柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動相為甲醇B（液質(zhì)級）和超純水A（含0.05 g/L甲酸）；梯度洗脫條件：0～8 min：2 %～98 %B，8.1～12 min：98 %B，12.1～14 min：2 %B，15 min：stop。質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源(DESI)；負(fù)離子模式掃描；離子源溫度為325 ℃；干燥氣流量為10 L/min；霧化器壓力為40 psig；碰撞電壓為90 V。標(biāo)曲：Y=202.7x+10770。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 形態(tài)特征

5株不同屬酵母菌菌落和顯微鏡形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1，具體形態(tài)結(jié)構(gòu)描述見表1。

表1 酵母菌的菌落和微觀形態(tài)描述

圖1 酵母菌的菌落和微觀結(jié)構(gòu)

2.1.2 生理生化特征

生理生化特征鑒定結(jié)果如表2 所示，此5 株菌均能發(fā)酵利用葡萄糖作為碳源，均不能發(fā)酵利用2-酮基-葡萄糖酸鹽、L-阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、木糖醇和N-乙酰氨基葡萄糖。Y3可利用D-木糖，其他4 株菌則不可以；Y1、Y2、Y3、Y5 可發(fā)酵利用的碳源種類較多，而Y4 僅可利用D-半乳糖和纖維二糖兩種碳源。形態(tài)學(xué)試驗結(jié)果顯示，除了Y5 有假菌絲外，其他4株菌均沒有假菌絲出現(xiàn)。

表2 酵母菌生理生化檢測結(jié)果

2.1.3 菌株的分子鑒定結(jié)果

從表3 可以看出，Y1 與Kazachstania bulderi的相似度為100 %、Y2 與Saccharomyces cerevisiae的相似度為100 %、Y3 與Zygosaccharomyces bailii的相似度為100 %、Y4 與Naumovozyma castellii的相似度為99.52 %、Y5 與Saccharomycopsis fibuligera的相似度為100%，說明菌株Y1、Y2、Y3、Y4 和Y5都已經(jīng)在NCBI中找到相似度非常高的菌株。

表3 酵母菌26S rDNA的同源性分析結(jié)果

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

此5 株不同屬的酵母菌株的26S rDNA D1/D2序列和用BLAST 檢索到的與之有高度同源性菌株的26S rDNA D1/D2 序列通過MEGA5.0 軟件進(jìn)行比對和構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。可通過系統(tǒng)發(fā)育樹的建立對此5 株不同屬的酵母菌種間親緣關(guān)系進(jìn)行直觀界定。

由圖2 可以直觀地看出，Y1 和Kazachstania bulderi聚為一支、Y2 和Saccharomyces cerevisiae聚為一支、Y3 和Zygosaccharomyces bailii聚為一支、Y4和Naumovozyma castellii聚為一支、Y5 和Saccharomycopsis fibuligera聚為一支。結(jié)合相似度（表3）和系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），該5 株酵母菌可以清晰地鑒定到種。

圖2 基于26S rDNA D1/D2區(qū)域序列和neighbor-joining分析法繪制菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 不同培養(yǎng)基條件下丁二酸產(chǎn)量的測定

用HPLC 法測定發(fā)酵液中丁二酸的含量，結(jié)果如圖3 所示。同一菌株在3 種培養(yǎng)基中丁二酸的產(chǎn)量有顯著性差異（p＜0.05），該5 株菌都是在五糧粉液培養(yǎng)基中產(chǎn)丁二酸能力最強(qiáng)，其次是麥芽汁液體培養(yǎng)基，YPD液體培養(yǎng)基中丁二酸產(chǎn)量最低。菌株Y4 在五糧粉液培養(yǎng)基中丁二酸產(chǎn)量最高，可高達(dá)478.8 mg/L。五糧粉液中葡萄糖含量較高，通過葡萄糖代謝提高了丁二酸的糖酸轉(zhuǎn)化率[18]，但對于此5株菌在五糧粉液培養(yǎng)基中產(chǎn)丁二酸能力最強(qiáng)的原因目前尚未完全弄清楚，還有待于進(jìn)一步研究。菌株Y4 為Naumovozyma castellii，為產(chǎn)乙醇酵母，其在五糧粉液培養(yǎng)基中產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)，應(yīng)該是通過乙醇合成丁二酸途徑產(chǎn)丁二酸。

圖3 5株菌在不同培養(yǎng)基中丁二酸的產(chǎn)量

3 結(jié)論

從五糧液釀造環(huán)境中分離到5 株不同屬的酵母菌株，此5 株酵母菌用26S rDNA 序列可以鑒定到種，分屬于Kazachstania bulderi、Saccharomyces cerevisiae、Zygosaccharomyces bailii、Naumovozyma castellii、和Saccharomycopsis fibuligera5 個不同的屬；5 株不同屬酵母菌在3 種不同培養(yǎng)基中產(chǎn)丁二酸的能力有明顯不同，在五糧粉液培養(yǎng)基中產(chǎn)丁二酸能力均為最強(qiáng)，其次是麥芽汁液體培養(yǎng)基，YPD液體培養(yǎng)基中丁二酸產(chǎn)量最低。其中，菌株Y4（Naumovozyma castellii）在五糧粉液培養(yǎng)基中丁二酸產(chǎn)量最高。