張 寧，王 翠，王 娟，溫望文，謝 亮，明良山，李林福，劉 海，黃 浩

（1. 江西心正藥業(yè)有限責(zé)任公司，江西 萍鄉(xiāng) 337053；2. 贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心—客家中醫(yī)藥資源研究分中心，江西 贛州 341000；3. 江西省華藥醫(yī)藥有限公司，江西 新余 338000；4. 江西中醫(yī)藥大學(xué)高等研究院中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心，江西 南昌 330004）

復(fù)方滋補(bǔ)力膏由黨參、何首烏、枸杞子、熟地黃、黃精五味藥材制成，具有益氣、滋陰、補(bǔ)腎的功效，主治氣血不足、腎虛、體力衰弱、腰酸肢軟、耳鳴眼花等癥狀［1］。復(fù)方滋補(bǔ)力膏處方含有豐富的化學(xué)成分。而收載于中藥成方制劑第14 冊(cè)（WS3-B-2754-97）的復(fù)方滋補(bǔ)力膏現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，僅有性狀、pH值、微生物限度等常規(guī)檢查項(xiàng)目［1-2］，不能滿足復(fù)方滋補(bǔ)力膏質(zhì)量控制的要求。為了有效控制復(fù)方滋補(bǔ)力膏的內(nèi)在質(zhì)量，參考相關(guān)文獻(xiàn)［3-5］采用薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，TLC）及高效液相色譜 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）對(duì)復(fù)方滋補(bǔ)力膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器ZF-1型三用紫外分析儀，高效液相色譜儀（安捷倫1260），色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）。

1.2 試藥復(fù)方滋補(bǔ)力膏（批號(hào)：20151101、20151102、20151103）；缺何首烏陰性樣品（江西心正藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，取黨參、枸杞子、熟地黃、黃精按照復(fù)方滋補(bǔ)力膏的生產(chǎn)工藝制得）；缺枸杞子陰性樣品（江西心正藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，取黨參、何首烏、熟地黃、黃精按照復(fù)方滋補(bǔ)力膏的生產(chǎn)工藝制得）；二苯乙烯苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110844-201512）；枸杞子對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121072-201410）；乙腈，分析純，超純水；硅膠G板（青島海洋化工廠，0.20～0.25 mm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC定性鑒定

2.1.1 何首烏薄層鑒別取復(fù)方滋補(bǔ)力膏樣品10 mL，加水10 mL，搖勻，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，棄去乙醚液，水液用水飽和的正丁醇振搖提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺何首烏的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法同法制成缺何首烏陰性樣品溶液。取二苯乙烯苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015 版第四部通則0502）［6］進(jìn)行試驗(yàn)。吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-水（7∶65∶55∶12）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在日光下檢視。結(jié)果：供試品色譜與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；缺何首烏陰性無干擾。經(jīng)多次試驗(yàn)，本方法簡(jiǎn)單、靈敏、重復(fù)性好，說明此方法專屬性較好。見圖1。

圖1 復(fù)方滋補(bǔ)力膏中何首烏的TLC圖譜

2.1.2 枸杞子薄層鑒別取復(fù)方滋補(bǔ)力膏樣品30 mL，加水20 mL，攪勻，用乙酸乙酯50 mL 振搖提取，取乙酸乙酯層，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取缺枸杞子的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液。取枸杞子對(duì)照藥材0.5 g，加水35 mL，加熱煮沸30 min，冷卻，過濾，濾液用乙酸乙酯20 mL 振搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。參照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015版第四部通則0502）［6］進(jìn)行試驗(yàn)。吸取供試品溶液10 μL、對(duì)照藥材溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3∶2∶1）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果：樣品色譜與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；缺枸杞子陰性無干擾。經(jīng)多次試驗(yàn)，本方法簡(jiǎn)單、靈敏、重復(fù)性好，說明此方法專屬性較好。見圖2。

圖2 復(fù)方滋補(bǔ)力膏中枸杞子的TLC圖譜

2.2 HPLC法含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備取二苯乙烯苷對(duì)照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備取復(fù)方滋補(bǔ)力膏樣品約5 g，精密稱定，置25 mL 棕色量瓶中，加60%乙醇15 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）10 min，冷卻，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備取缺何首烏陰性樣品適量，按供試品溶液的制備方法：取本品約5 g，精密稱定，置25 mL棕色量瓶中，加60%乙醇15 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）10 min，冷卻，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，制得缺何首烏陰性樣品溶液。

2.2.4 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）填充劑色譜柱；乙腈-水（25∶75）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃。按《中國(guó)藥典》規(guī)定，理論塔板數(shù)按二苯乙烯苷計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別精密吸取二苯乙烯苷對(duì)照品、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明：二苯乙烯苷保留時(shí)間約在6 min 左右，與其它各峰達(dá)到基線分離；缺何首烏陰性無干擾；理論塔板數(shù)按二苯乙烯苷峰計(jì)為2 000 以上，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。本品系統(tǒng)適應(yīng)性良好。見圖3～圖5。

圖3 二苯乙烯苷對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

圖4 供試品溶液HPLC色譜圖

圖5 缺何首烏陰性溶液HPLC色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察分別精密吸取對(duì)照品溶液（二苯乙烯苷濃度為21.84 μg·mL-1）2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，二苯乙烯苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：二苯乙烯苷回歸方程為：y=3 642.9x+17.428，R2=0.999 6，二 苯 乙 烯 苷 在0.044 7～0.446 8 μg 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。見表1和圖6。

圖6 二苯乙烯苷線性關(guān)系圖

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)20151101 的復(fù)方滋補(bǔ)力膏樣品6 份，按照“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算二苯乙烯苷的含量。結(jié)果表明，本法重復(fù)性良好。見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按2.2.4 項(xiàng)的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24小時(shí)后依法測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果表明，混合對(duì)照品溶液和供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表3。

表3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.2.4 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果：測(cè)定值RSD 為0.35%，儀器精密度良好。見表4。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的復(fù)方滋補(bǔ)力膏（批號(hào)：20150301，每1 g 含101.13 μg 二苯乙烯苷）6 份，各2.5 g，分別精密加入282.10 μg·mL-1二苯乙烯苷對(duì)照品溶液1 mL，按供試品溶液的制備方法制備加樣回收樣品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，得二苯乙烯苷的加樣回收率均在95%～105%之間，平均回收率為99.50%，RSD為0.72%，表明該方法回收率良好。見表5。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 儀器及色譜柱耐用性試驗(yàn)取批號(hào)20151101 復(fù)方滋補(bǔ)力膏樣品進(jìn)行耐用性試驗(yàn)，按照2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在不同柱溫，不同流速，不同流動(dòng)相比例條件下測(cè)定二苯乙烯苷含量。結(jié)果：在各試驗(yàn)條件下，待測(cè)成分分離較好，測(cè)定結(jié)果基本一致，耐用性良好。見表6。

2.2.12 樣品測(cè)定取復(fù)方滋補(bǔ)力膏樣品3 批（批號(hào)依次為20151101，20151102，20151103），按2.2.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，外標(biāo)法計(jì)算二苯乙烯苷。結(jié)果：3 批樣品中的二苯乙烯苷的含量依次為101.33、99.79、100.12 μg·mL-1。

3 討 論

3.1 薄層色譜鑒定復(fù)方滋補(bǔ)力膏處方中包括黨參、何首烏、枸杞子、熟地黃、黃精五味中藥，藥材化學(xué)成分復(fù)雜，有黨參炔苷［7］、二苯乙烯苷［8］、生物堿［9］、多糖［10］等。黨參是復(fù)方中含量最高的一味藥，中國(guó)藥典將黨參炔苷作為黨參標(biāo)識(shí)成分進(jìn)行TLC鑒定［11］，但有研究發(fā)現(xiàn)，該方法專屬性較差［12］，不適合作為質(zhì)量控制的標(biāo)識(shí)物質(zhì)。此外，本組前期研究發(fā)現(xiàn)，將熟地黃與黃精進(jìn)行薄層色譜鑒定時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組結(jié)果都不具有顯著性差異，因此，二者均不作為薄層色譜鑒定項(xiàng)。通過摸索多種前處理及薄層色譜的條件，再結(jié)合復(fù)方滋補(bǔ)力膏的功能主治和各藥材的藥理作用，從中選取何首烏、枸杞子做為鑒別項(xiàng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，所選取的藥味和化學(xué)成分在薄層色譜中展開、顯色效果顯著，重復(fù)性好，穩(wěn)定性可靠。用薄層色譜法鑒定復(fù)方滋補(bǔ)力膏中何首烏、枸杞子的方法能夠有效對(duì)該藥進(jìn)行質(zhì)量控制。

此外，為評(píng)價(jià)薄層色譜法的適用性，還對(duì)薄層色譜法進(jìn)行耐用性實(shí)驗(yàn)，分別從溫度（10 ℃和35 ℃）、相對(duì)濕度（42%和88%）以及不同硅膠板（預(yù)制板和自制板）等3個(gè)方面進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方滋補(bǔ)力膏的TLC 鑒別結(jié)果不受溫度、相對(duì)濕度和不同硅膠板等條件改變的影響。說明薄層色譜法作為復(fù)方滋補(bǔ)力膏的定性鑒定方法具有很強(qiáng)的適用性。

3.2 HPLC含量測(cè)定現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，二苯乙烯苷是何首烏主要的活性成分和質(zhì)量控制的關(guān)鍵成分［13-14］，具有抗衰老、降血脂、保肝、保護(hù)腎臟、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強(qiáng)造血功能等藥理作用，與復(fù)方滋補(bǔ)力膏的功能主治針對(duì)氣血不足、腎虛、體力衰弱、腰酸肢軟具有極強(qiáng)的相關(guān)性。故選用二苯乙烯苷作為復(fù)方滋補(bǔ)力膏指標(biāo)化學(xué)成分，進(jìn)行含量測(cè)定。確定采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，通過方法學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)考察，均符合中藥指導(dǎo)原則的要求，說明該方法可操作性強(qiáng)，專屬性好，準(zhǔn)確度高，精密度高，穩(wěn)定性可靠，可以作為復(fù)方滋補(bǔ)力膏中二苯乙烯苷定量測(cè)定方法。

4 結(jié) 論

采用薄層色譜法和高效液相色譜法，研究分析了薄層色譜法鑒定復(fù)方滋補(bǔ)力膏中何首烏、枸杞子、二苯乙烯苷的專屬性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，建立了高效液相色譜法檢測(cè)復(fù)方滋補(bǔ)力膏中有效成分含量的方法，為復(fù)方滋補(bǔ)力膏提供新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。